技术领域
本发明涉及一种组成型启动子及其用途，特别是涉及一种组成型的水稻泛 素基因启动子及其用途。
背景技术
细胞生物学和转基因技术的重大进步使得外源基因合并进许多作物中。 外源基因被转入植物中主要为表达蛋白，所述植物被称为“转基因植物”， 所述蛋白将给予有益的性状，如抵抗病原微生物或昆虫、抗除草剂、耐旱或 其它不利的环境。通常，外源基因的DNA编码区域连接于一强大的且组成 型的DNA启动子区域以确保外源基因在转基因细胞中有效表达。
大量普通的启动子被用于在转基因植物中驱动外源基因的表达。花椰菜 花叶病毒（CaMV）35S启动子被广泛地用于双子叶和单子叶植物中，但是它 在单子叶植物中的效率显著低于其在双子叶植物中的效率。CaMV35S甚至 在某些细胞类型中无活性，例如花粉。
泛素（Ubiquitin，简称UBQ或Ubi）基因启动子作为组成型启动子在植 物的大多数组织和许多类型细胞中都显示出明显较高的基因表达水平，特别 是在单子叶植物中具有较高的活性，如分离自玉米聚泛素基因的泛素启动子 Ubi1在玉米原生质体中可以比CaMV35S启动子更有效地驱动报告基因CAT 的表达；同时，泛素基因启动子在幼嫩组织中也显示出优先的活性，如维管 束组织和花粉粒。目前，植物来源的泛素基因启动子主要分离自玉米、向日 葵、烟草、马铃薯、甘蔗、拟南芥和大豆，而水稻中的泛素基因启动子却鲜 有报道。另外，在同一转基因植物中多个转基因的叠加需要大量不同的启动 子，否则将会发生同源依赖的基因沉默，这一现象在具有多拷贝同一启动子 的转基因植物中屡见不鲜。因此需要开发不同来源的泛素基因启动子，使异 源核苷酸序列能够在植物组织中高效表达。
发明内容
本发明的目的是提供一种组成型启动子及其用途，即新的分离自水稻 （Oryzasativa）的Ubi基因启动子，使异源核苷酸序列能够在植物组织中高 效表达。
为实现上述目的，本发明提供了一种组成型启动子，其核苷酸序列包括如 下（a）或（b）的序列：
（a）具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或
（b）在严格条件下与（a）限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
上述严格条件可为在6×SSC（柠檬酸钠）、0.5%SDS（十二烷基硫酸钠） 溶液中，在温度65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS 各洗膜1次。
为实现上述目的，本发明还提供了一种包含与目的异源核苷酸序列可操作 地连接的所述组成型启动子的嵌合基因。
进一步地，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。
为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述嵌合基因的表达盒。
为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述表达盒的重组载体。
为实现上述目的，本发明还提供了一种在植物中表达目的异源核苷酸序列 的方法，包括：将与所述组成型启动子可操作地连接的目的异源核苷酸序列稳 定的整合进植物细胞中。
进一步地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。
优选地，所述目的异源核苷酸序列在植物组织中组成型的表达。
进一步地，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。
优选地，所述目的异源核苷酸序列编码除草剂耐性蛋白质。
所述目的异源核苷酸序列编码昆虫抗性蛋白质。
为实现上述目的，本发明还提供了一种所述组成型启动子用于在植物组织 中组成型的表达目的异源核苷酸序列的用途。
优选地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。
进一步地，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。
本发明中术语“启动子”是指DNA调节区，通常含有能够引导RNA聚合 酶II在特定编码序列的适合转录起始位点启动RNA合成的TATA盒。启动子 可另外含有其它的识别序列，一般位于TATA盒的上游或5’端，称作上游启动 子元件，它们影响转录起始速率。公认地，由于本发明启动子区域核苷酸序列 己经确定，从本发明具体启动子区域上游的5’非翻译区内进一步分离和鉴定调 节元件属于现有技术。因此，本发明启动子区域进一步包括上游调节元件，它 赋予与本发明启动子序列可操作地连接的任何异源核苷酸序列组成型的表达， 即在植物的大体上所有组织和所有生长发育阶段都能够表达。
本发明中术语“基因”是指在适宜的调控区域（例如植物可表达性启动子 区域）控制下在细胞内含有被转录成RNA分子（例如mRNA）的DNA区域（“转 录的DNA区域”）的任何DNA片段。因此，基因可能含有几种可操作性连接 的DNA片段，例如启动子、5’非翻译前导序列、编码区域和含有多聚腺苷酸 化位点的3’非翻译区域。内源植物基因是在植物物种中天然发现的基因。嵌合 基因是通常不在植物物种中发现的任何基因，或者是在天然情况下其启动子与 部分或全部转录的DNA区域或者与该基因的至少另一调控区域无关的任何基 因。
本发明中术语“组成型启动子”是指在该类启动子的控制下，目的异源核 苷酸序列的表达大体恒定在一定水平上，在植物的不同组织和/或不同生长发 育阶段表达水平没有明显差异。所述组织为植物体中由来源相同和执行同一 功能的一种或多种类型细胞集合而成的结构单位，例如保护组织、输导组织、 营养组织、机械组织、分生组织，几种不同的组织有机配合、紧密联系，形 成不同的器官（organ），不同的器官之间互相配合，更有效地完成有机体的 整个生命活动过程。所述生长发育阶段可根据植物形态、机能的差异划分为 胚胎阶段、幼苗阶段、成熟阶段和衰老阶段。本发明中术语“组成型的表达” 是指目的异源核苷酸序列在植物的不同组织和/或不同生长发育阶段都以大 体上一致的水平进行表达。
本领域技术人员根据相同目的能够容易地鉴定并利用功能上等价的启 动子。具有本质上与含有本发明SEQIDNO:1所示的核苷酸序列、或具有启 动子活性部分的核苷酸序列的水稻Ubi基因启动子相似的启动子活性的 DNA序列，是这些启动子的功能等价物。这些功能等价启动子能在严格条件 下与含有上述核苷酸序列的水稻Ubi基因启动子区域杂交。
在杂交技术中，己知核苷酸序列的全部或部分被用作探针，与来自被选 生物体的克隆基因组DNA片段或cDNA片段（如基因组文库或cDNA文库） 群体中存在的其它对应核苷酸序列选择性地杂交。杂交探针可以是基因组 DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，可以被可探测的基团 如32P或其它任何可探测标记物标记。因此，例如，通过标记根据本发明序 列的合成寡核苷酸可以制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA和基因组 文库的方法为本领域己知并公开于Sambrook等人（1989）分子克隆：实验 室手册（第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，Plainview，NewYork）。
序列的杂交可在严格条件下进行。所述“严格条件”是指探针将与其靶 序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交（如至少2倍于背景）的条件。 严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤 条件的严格性，可以鉴定与探针100%互补的靶序列（同源探测）。可选择 地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性 （异源探测）。通常，探针长度短于大约1000个核苷酸，优选地短于500 个核苷酸。
典型地，严格条件是在pH7.0至8.3下盐浓度低于大约1.5MNa离子， 典型地大约0.01至1.0MNa离子浓度（或其它盐类），温度对短探针（如 10至50个核苷酸）至少大约30℃，对长探针（如超过50个核苷酸）至少大 约60℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可获得严格条件。低度严格条件，例 如，包括在30-35%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS（十二烷基磺酸钠）的缓冲溶 液中37℃杂交，在1×至2×SSC（20×SSC=3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠）中 50-55℃洗涤。中度严格条件，例如，包括在40-45%甲酰胺、1.0MNaCl、1%SDS 的缓冲溶液中37℃杂交，在0.5×至1×SSC中55-60℃洗涤。高度严格条件， 例如，包括在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在 0.1×SSC中60-65℃洗涤。非必要地，洗涤缓冲液可含有大约0.1%至1%的 SDS。杂交时间一般少于大约24小时，通常大约4至12小时。
特别典型地是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度 和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可以从Meinkoth和Wahl（1984）Anal. Biochem.138:267-284的方程估算：Tm=81.5℃+16.6（logM）+0.41（%GC） -0.61（%form）-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，%GC是鸟嘌呤 核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，%form是甲酰胺在杂交溶液中 的百分比，L是杂交体在碱基对中的长度。Tm是50%互补靶序列与完全配对 探针杂交的温度（在规定的离子强度和pH下）。每1%的错配需Tm降低大 约1℃；因此，Tm杂交和/或洗涤条件可被调节以与所需同一性的序列杂交。 例如，如果探寻的序列具有≥90%的同一性，Tm可以降低10℃。一般地，选 择的严格条件是低于特定序列的热解链温度（Tm）大约5℃，且其在规定的 离子强度和pH下互补。但是，高度严格条件可以应用低于热解链温度（Tm） 1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中度严格条件可以应用低于热解链温度（Tm） 6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低度严格条件可以应用低于热解链温 度（Tm）11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。应用此方程、杂交 和洗涤组合物和所需的Tm，本领域普通技术人员会理解杂交和/或洗涤溶液 的条件随严格程度的变化而变化。如果所需的错配程度使Tm低于45℃（水 溶液）或32℃（甲酰胺溶液），优选增加SSC浓度以能够使用较高的温度。 核酸杂交的指南见于Tijssen（1993）生物化学和分子生物学实验室技术-用 核酸探针杂交，第I部分，第2章（Elsevier，NewYork）；和Ausubel等人 编辑（1995）分子生物学现代方法第2章（GreenePublishingand Wiley-Interscience，NewYork）。见Sambrook等人（1989）分子克隆：实验 室手册（第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，Plainview，NewYork）。
因此，具有启动子活性并在严格条件下与本发明启动子序列或其片段杂交 的分离序列包括在本发明中。这些序列与本发明序列至少大约40%-50%同源， 大约60%、65%或70%同源，甚至至少大约75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源。即序列同一性的范围分 布在至少大约40%-50%、大约60%、65%或70%同源，甚至至少大约75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的 序列同一性。
其它功能等价启动子含有这样的核苷酸序列，即能用含有SEQIDNO:1所 示的核苷酸序列的至少约25、优选至少约50、特别是至少约100个连续核苷酸 的寡核苷酸引物在聚合酶链式反应中扩增的核苷酸序列。
还可以构建人工启动子，其包含SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的5’调 控区域的决定启动子的组成型的表达的内部序列。所述人工启动子可能包含能 在植物中表达的另一启动子的“核心启动子”或“TATA盒区域”，例如WO 93/19188中所述的CaMV35S“TATA盒区域”。含有所述人工启动子的启动子 区域的适用性可以通过它们与目的异源核苷酸序列的适当融合以及目的异源核 苷酸序列在适宜组织、适当发育阶段的表达的检测进行鉴定。
本发明所述的启动子序列及其片段，当组装进DNA结构使启动子序列与目 的异源核苷酸序列可操作地连接时，用于遗传性操控任何植物。所述“可操作 地连接”是指本发明的启动子序列与第二个序列之间的功能性连接，其中启动 子序列启动和调节对应于第二个序列的DNA序列的转录。一般地，可操作地连 接是指被连接的核酸序列是连续的，必要时相邻地结合两个蛋白编码区，并在 同一个阅读框内。以此方式，启动子核苷酸序列与目的异源核苷酸序列构成所 述嵌合基因在表达盒中一起提供，以在目的植物中表达。这种表达盒提供了大 量限制性位点以插入目的异源核苷酸序列，所述目的异源核苷酸序列将受到包 含本发明启动子序列的调节区的转录调节。表达盒可另外含有至少一个将共转 化进生物体的附加基因。可选择地，附加基因可以在多个表达盒上被提供。
表达盒可另外含有可选择的标记基因。一般地，表达盒将包含用于选择转 化细胞的选择性标记基因。所述选择性标记基因用于选择转化的细胞或组织。 所述选择性标记基因包括但不限于，编码抗生素抗性的基因（如编码新霉素磷 酸转移酶II（NPT））和潮霉素磷酸转移酶（HPT）的基因，以及赋予除草剂抗 性的基因如草胺磷、溴苯腈、咪唑啉酮类和2，4-二氯苯氧乙酸酯（2，4-D）。
表达盒包括沿5’-3’方向转录的本发明的启动子序列、翻译起始区、目的 异源核苷酸序列、和在植物中起作用的转录和翻译终止区。目的异源核苷酸序 列可以是天然的或对植物宿主外源的或异源的。可选择地，目的异源核苷酸序 列可以是天然序列或选择性合成序列。“外源”是指在导入转录起始区的天然 植物中不存在所述的导入转录起始区。例如，嵌合基因包含本发明的启动子序 列，本发明的启动子序列可操作地与不同于本发明的启动子序列的编码序列连 接。
终止区可来源于本发明的启动子序列，也可来源于可操作连接的目的异源 核苷酸序列，或可来源于另外的来源。传统的终止区可从土壤农杆菌的Ti质粒 获得，如肉碱合成酶和胭脂碱合成酶（NOS）终止区。
在表达盒制备中，可以操控不同的DNA片段以提供适当方向的DNA序列， 并在适合的时候提供适当的阅读框。所以，可应用接受子或连接子结合DNA片 段，或可进行其它操控以提供方便的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制 性位点等。为此目的，可能涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、再取代， 如转变和转换。
在适合的情况下，目的异源核苷酸序列可被优化以增加在转化植物中的表 达量。即可用植物优选的密码子合成基因以改善表达。
本领域公知的，另外的序列修饰可提高细胞宿主中的基因表达水平。这些 包括但不限于，去除编码假性聚腺苷信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座 子的重复序列，以及其它充分表征出可能不利于基因表达的序列。序列的G-C 含量可调节到指定宿主细胞的平均水平，引用宿主细胞中己知的基因表达水平 进行计算。可能地，修饰序列以避免预测的发夹式mRNA二级结构。
在表达盒或重组载体中，表达盒可另外含有5’前导序列。所述前导序列可 以起改进转录效率的作用。所述前导序列为本领域已知的，包括但不限于，细 小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列（脑心肌炎5’非编码区）； 马铃薯病毒组前导序列，例如烟草蚀刻病毒（TEV）前导序列、玉米矮小花叶 病毒（MDMV）前导序列和人免疫球蛋白重链结合蛋白（BiP）；来自紫花苜蓿 花叶病毒包被蛋白mRNA（AMVRNA4）的非翻译前导序列；烟草花叶病毒 （TMV）前导序列；和玉米萎黄病斑点病毒（MCMV）前导序列。还可以使用 其它己知的改进转录效率的元件，例如内含子等。
本发明的启动子序列可用来启动与目的异源核苷酸序列的信使RNA （mRNA）至少部分互补的反义结构的转录。构建反义核苷酸序列以与相应的 mRNA杂交。只要反义序列长到可与相应的mRNA杂交并干扰其表达，就可进 行反义序列的修饰。以此方式，可以使用与相应的反义序列具有70%，优选的 80%，更优选的85%序列同一性的反义结构。此外，反义核苷酸序列的一部分可 被用来破坏靶基因的表达。一般，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200 个核苷酸或更多个核苷酸的序列。
本发明的启动子序列还可用于启动正义方向的核苷酸序列的转录以抑制植 物中内源性基因的表达。应用正义方向的核苷酸序列在植物中抑制基因表达的 方法为本领域己知。该方法通常涉及用含启动子的DNA结构转化植物，启动子 可操作地连接至少一部分相当于内源性基因转录体的核苷酸序列，并驱动其在 植物中表达。典型地，所述核苷酸序列与内源性基因转录体的序列具有实质上 地序列同一性，优选地超过大约65%序列同一性，更优选地超过大约85%序列 同一性，最优选地超过大约95%序列同一性。
本发明的启动子序列被用于目的异源核苷酸序列的组成型的表达。“异源 核苷酸序列”是指非天然地与启动子序列一起存在的序列。虽然所述核苷酸序 列与启动子序列是异源的，但对植物宿主可能是同源的或天然的或异源的或外 源的。可操作地与本发明的启动子连接的异源核苷酸序列可编码目的蛋白质。 这种异源核苷酸序列的实例包括但不限于，编码赋予以下抗性多肽的核苷酸序 列：非生物应激如干旱、温度、盐度、臭氧和除草剂，或生物应激如病原体侵 袭，包括昆虫、病毒、细菌、真菌和线虫类，并防止产生这些生物体伴随的疾 病。
本发明中除草剂耐性蛋白质可以表达对除草剂的抗性和/或耐受性。这些基 因包括但不限于，乙酰乳酸合酶（ALS）基因、5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶 （EPSPS）基因、草胺磷乙酰转移酶（PAT）基因、草甘膦氧化还原酶（GOX） 基因、GAT基因等。
本发明中“昆虫抗性”是指植物避免植物-昆虫相互作用所致的症状和损害。 即阻止昆虫引起的植物损害、农作物损害、植物损形和植物疾病，或可选择地， 将由昆虫引起的植物损害、农作物损害、植物损形和植物疾病减少到最小或减 轻。所述昆虫可以属于鳞翅目（如玉米螟）、半翅目（如椿象）、鞘翅目（如 甲虫）、直翅目（如飞蝗）、同翅目（如蚜虫）、双翅目（如蝇）等。本领域 公知的，目的昆虫抗性蛋白质包括但不限于，芽孢杆菌毒性蛋白；凝集素类， 其中凝集素包括雪花莲凝集素、豌豆凝集素、刀豆凝集素、麦芽凝集素、马铃 薯凝集素、花生凝集素等；脂氧化酶类，其中脂氧化酶包括豌豆脂氧化酶1或 大豆脂氧化酶；昆虫壳多糖酶等。
不同害虫将病毒从感染的植物传递给健康植物的方式不同。所述病毒包括 但不限于，水稻东格鲁杆状病毒、烟草花叶病毒、甘薯萎黄矮小病毒和甘薯羽 状斑点病毒等。因此，可以选择在植物组织中组成型的表达具有抗致病原体活 性或使病毒病原体的影响最小化的异源核苷酸序列。
本发明的启动子序列和方法可用于任何目的异源核苷酸序列在植物宿主中 的表达调节，以改变植物的表现型。各种目的表现型改变包括但不限于，改变 植物的脂肪酸成分、改变植物的氨基酸含量、改变植物病原体防御机制等。上 述改变可以通过提供异源产物的表达或增加植物内源性产物的表达而得到。可 选择地，上述改变可以通过减少植物中一个或多个内源性产物的表达而得到， 特别是酶或辅助因子。上述改变将导致转化植物的表现型改变。
转化方案以及将核苷酸序列导入植物的方案依定向转化的植物或植物细胞 类型而异，即单子叶植物或双子叶植物。将核苷酸序列导入植物细胞并随后插 入植物基因组中的适合方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、 直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。
已经转化的细胞可按照常规的方式生长成植物。这些植物被培育，用相同 的转化株或不同的转化株授粉，得到的杂交体表达所需的被鉴定的表现型特征。 可培育二代或多代以保证稳定地保持和遗传所需表现型特征的表达，然后收获 可保证得到所需表现型特征表达的种子。
本发明提供了一种组成型启动子及其用途，具有以下优点：
1、普遍存在活性。本发明组成型启动子几乎在植物的大多数组织和许多 类型细胞中都显示出活性，特别是在单子叶植物的根、茎、叶中。
2、活性高。与CaMV35S启动子相比，本发明组成型启动子几乎在植物 的大多数组织和许多类型细胞中都显示出明显较高的基因表达水平，特别是 在单子叶植物中具有强大的、普遍存在的活性，例如根、茎、叶。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明组成型启动子及其用途的重组克隆载体pT-prOsRUBQ1构建 流程图；
图2为本发明组成型启动子及其用途的重组表达载体p100024构建流程图；
图3为本发明组成型启动子及其用途的重组表达载体p100079示意图；
图4为本发明组成型启动子及其用途的转基因玉米植株除草剂抗性效果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明组成型启动子及其用途的技术方 案。
第一实施例、prOsRUBQ1启动子序列的合成
获得本发明组成型启动子prOsRUBQ1，如序列表中SEQIDNO:1所示；所 述prOsRUBQ1启动子序列（如序列表中SEQIDNO:1所示）由南京金斯瑞生物 科技有限公司合成；合成的所述prOsRUBQ1启动子序列（SEQIDNO:1）的5’ 端还连接有KpnII酶切位点，所述prOsRUBQ1启动子序列（SEQIDNO:1）的 3’端还连接有HindIII酶切位点。
第二实施例、含有prOsRUBQ1启动子序列的重组表达载体p100024的构建 及重组表达载体转化农杆菌
1、构建含有prOsRUBQ1启动子序列的重组克隆载体pT-prOsRUBQ1
将prOsRUBQ1启动子序列连入克隆载体pGEM-T（Promega，Madison，USA， CAT：A3600）上，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T载体说明书进行，得 到重组克隆载体pT-prOsRUBQ1，其构建流程如图1所示（其中，Amp表示氨 苄青霉素抗性基因；f1表示噬菌体f1的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子； SP6为SP6RNA聚合酶启动子；T7为T7RNA聚合酶启动子；prOsRUBQ1为 水稻品种日本晴的Ubiqutin（泛素）1基因启动子（SEQIDNO:1）；MCS为多 克隆位点）。
然后将重组克隆载体pT-prOsRUBQ1用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细 胞（Transgen，Beijing，China，CAT：CD501），其热激条件为：50μl大肠杆菌 T1感受态细胞、10μl质粒DNA（重组克隆载体pT-prOsRUBQ1），42℃水浴30 秒；37℃振荡培养1小时（200rpm转速下摇床摇动），在表面涂有IPTG（异丙 基硫代-β-D-半乳糖苷）和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的氨苄青霉 素（100mg/L）的LB平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L， 琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5）上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培 养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，氨苄青霉素100mg/L， 用NaOH调pH至7.5）中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒：将菌 液在12000rpm转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μl冰预冷的溶液I （25mMTris-HCl，10mMEDTA（乙二胺四乙酸），50mM葡萄糖，pH8.0）悬浮； 加入200μl新配制的溶液II（0.2MNaOH，1%SDS（十二烷基硫酸钠）），将管 子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III（3M醋酸钾， 5M醋酸），立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条 件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于 温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度（V/V）为 70%的乙醇洗涤后晾干；加入30μl含RNase（20μg/ml）的TE（10mMTris-HCl， 1mMEDTA，PH8.0）溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化RNA；于温 度-20℃保存备用。
提取的质粒经KpnI和HindIII酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结 果表明重组克隆载体pT-prOsRUBQ1中插入的水稻prOsRUBQ1启动子序列为 序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。
2、构建含有prOsRUBQ1启动子序列的重组表达载体p100024
用限制性内切酶KpnII和HindIII分别酶切重组克隆载体pT-prOsRUBQ1和 表达载体p90000，将切下的prOsRUBQ1启动子片段插到p90000的KpnI和 HindIII位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的， 构建成重组表达载体p100024，其构建流程如图2所示（Kan：卡那霉素基因； RB：右边界；prOsRUBQ1：水稻品种日本晴的Ubiqutin（泛素）1基因启动子 （SEQIDNO:1）；PAT：草丁膦乙酰转移酶基因（SEQIDNO:3）；Nos：胭脂 碱合成酶基因的终止子（SEQIDNO:4）；Ubi：玉米Ubiquitin（泛素）基因启 动子（SEQIDNO:5）；PMI：磷酸甘露糖异构酶基因（SEQIDNO:6）；LB： 左边界）。
将重组表达载体p100024用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，其热激 条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA（重组表达载体p100024）， 42℃水浴30秒；37℃振荡培养1小时（200rpm转速下摇床摇动）；然后在含 50mg/L卡那霉素（Kanamycin）的LB固体平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5）上于温度37℃条件下培 养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5）中于温度37℃条 件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶EcoRV和XhoI 酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体p100024在 KpnI和HindIII位点间的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO:1所示核苷酸序列， 即水稻品种日本晴的Ubiqutin（泛素）1基因启动子序列。
3、构建含有对照序列的重组表达载体p100079（正对照）
按照本发明第二实施例中1所述的构建含有prOsRUBQ1启动子序列的重组 克隆载体pT-prOsRUBQ1的方法，利用对照序列构建含有对照序列的重组克隆 载体pT-prCaMV35S。对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体 pT-prCaMV35S中插入的prCaMV35S启动子序列为序列表中SEQIDNO:2所示 的核苷酸序列，即对照序列正确插入。
按照本发明第二实施例中2所述的构建含有prOsRUBQ1启动子序列的重组 表达载体p100024的方法，利用对照序列构建含有对照序列的重组表达载体 p100079，其构建流程如图3所示（Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；prCaMV35S： 对照序列（SEQIDNO:2）；PAT：草丁膦乙酰转移酶基因（SEQIDNO:3）； Nos：胭脂碱合成酶基因的终止子（SEQIDNO:4）；Ubi：玉米Ubiquitin（泛素） 基因启动子（SEQIDNO:5）；PMI：磷酸甘露糖异构酶基因（SEQIDNO:6）； LB：左边界）。对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组表达载体p100079中 插入的对照序列为序列表中SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，即对照序列正确 插入。
4、重组表达载体转化农杆菌
对己经构建正确的重组表达载体p100024和p100079用液氮法转化到农杆 菌LBA4404（Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015）中，其转化条件为： 100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA（重组表达载体）；置于液氮中10分 钟，37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度 28℃、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平（Rifampicin） 和100mg/L的卡那霉素（Kanamycin）的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取 单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶EcoRV和XhoI酶切后进行酶切验 证，结果表明重组表达载体p100024和p100079结构完全正确。
第三实施例、转入prOsRUBQ1启动子序列的玉米植株的获得
按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的玉米品种综31（Z31）的幼胚 与第二实施例中4所述的农杆菌共培养，以将第二实施例中2和3构建的重组 表达载体p100024和p100079（对照序列）中的T-DNA（包括玉米Ubiquitin基 因的启动子序列、prOsRUBQ1启动子序列、对照序列、PAT基因、PMI基因和 Nos终止子序列）转入到玉米染色体组中，获得了转入prOsRUBQ1启动子序列 的玉米植株和转入对照序列的玉米植株（正对照）；同时以野生型玉米植株作 为负对照。
对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离未成熟的幼胚，用农 杆菌悬浮液接触幼胚，其中农杆菌能够将prOsRUBQ1启动子序列传递至幼胚之 一的至少一个细胞（步骤1：侵染步骤），在此步骤中，幼胚优选地浸入农杆菌 悬浮液（OD660=0.4-0.6，侵染培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、 蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮（AS）40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D） 1mg/L，pH5.3））中以启动接种。幼胚与农杆菌共培养一段时期（3天）（步骤 2：共培养步骤）。优选地，幼胚在侵染步骤后在固体培养基（MS盐4.3g/L、 MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮（AS） 100mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）上培养。在此 共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复 培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯 氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）中至少存在一种己知抑制农杆菌生 长的抗生素（头孢霉素），不添加植物转化体的选择剂（步骤3：恢复步骤）。 优选地，幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并 为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的幼胚在含选择剂（甘露糖）的培养基上 培养并选择生长着的转化愈伤组织（步骤4：选择步骤）。优选地，幼胚在有选 择剂的筛选固体培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、 甘露糖12.5g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）上培养， 导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组织再生成植物（步骤5：再生步骤）， 优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基（MS分化培养基 和MS生根培养基）上培养以再生植物。
筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基（MS盐4.3g/L、MS 维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、琼 脂8g/L，pH5.8）上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培 养基（MS盐2.15g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸 1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结 实。在温室中，每天于28℃下培养16小时，再于20℃下培养8小时。
第四实施例、prOsRUBQ1启动子序列的活性测定
实验一、PAT基因拷贝数的鉴定
分别取转入prOsRUBQ1启动子序列的玉米植株和转入对照序列的玉米植 株的叶片约100mg作为样品，用Qiagen的DNeasyPlantMaxiKit提取其基因组 DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测PAT基因的拷贝数。同时以野 生型玉米植株作为负对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取 平均值。
检测PAT基因拷贝数的具体方法如下：
步骤11、分别取转入prOsRUBQ1启动子序列的玉米植株、转入对照序列 的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆， 每个样品取3个重复；
步骤12、使用Qiagen的DNeasyPlantMiniKit提取上述样品的基因组DNA， 具体方法参考其产品说明书；
步骤13、用NanoDrop2000（ThermoScientific）测定上述样品的基因组DNA 浓度；
步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范 围为80-100ng/μl；
步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过 鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为负对照，每 个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：
引物1（PF）：CAGTTGAGATTAGGCCAGCTACAG如序列表中SEQID NO:7所示；
引物2（PR）：TTCACTGTAGACGTCTCAATGTAATGG如序列表中SEQ IDNO:8所示；
探针1（PP）：CAGCTGATATGGCCGCGGTTTGTG如序列表中SEQIDNO:9 所示；
PCR反应体系为：
所述50×引物/探针混合物包含1mM浓度的每种引物各45μl，100μM浓度 的探针50μl和860μl1×TE缓冲液，并且在4℃，贮藏在琥珀试管中。
PCR反应条件为：
利用SDS2.3软件（AppliedBiosystems）分析数据。
实验结果表明，prOsRUBQ1启动子序列和对照序列己经整合到所检测的玉 米植株的染色体组中，而且转入prOsRUBQ1启动子序列的玉米植株和转入对照 序列的玉米植株均获得了含有单拷贝PAT基因的转基因玉米植株。
实验二、PAT蛋白的含量检测
本实验中涉及的溶液如下：
萃取缓冲液：8g/LNaCl，0.2g/LKH2PO4，2.9g/LNa2HPO4·12H2O，0.2g/L KCl，5.5ml/L吐温20（Tween-20），pH7.4；
洗涤缓冲液PBST：8g/LNaCl，0.2g/LKH2PO4，2.9g/LNa2HPO4·12H2O， 0.2g/LKCl，0.5ml/L吐温20（Tween-20），pH7.4；
终止液：1MHCl。
分别取3mg转入prOsRUBQ1启动子序列的玉米植株和转入对照序列的玉 米植株的叶片（V3-V5期）、根（成熟期）、茎（成熟期）作为样品，液氮研 磨后加入800μl所述萃取缓冲液，4000rpm的转速下离心10min，取上清液用所 述萃取缓冲液稀释40倍，取80μl稀释后的上清液用于ELISA检测。用ELISA （酶联免疫吸附测定法）试剂盒（ENVIRLOGIX公司，PAT试剂盒）对样品中 PAT蛋白的表达量占样品鲜重的比例进行检测分析，具体方法参考其产品说明 书。
同时以野生型玉米植株（CK）和经Taqman鉴定为非转基因的玉米植株 （NGM）作为对照，按照上述方法进行检测分析。每类植株选3个株系，从每 个株系选3株进行测试，每株重复6次。
转基因玉米植株的PAT蛋白含量的实验结果如表1所示。分别测得转入 prOsRUBQ1启动子序列的玉米植株、转入对照序列的玉米植株、野生型玉米植 株（CK）和经Taqman鉴定为非转基因的玉米植株（NGM）的叶片中ELISA值 （ng/g）分别为585.34、461.65、0.12和0.01；转入prOsRUBQ1启动子序列的 玉米植株、转入对照序列的玉米植株、野生型玉米植株（CK）和经Taqman鉴 定为非转基因的玉米植株（NGM）的根中ELISA值（ng/g）分别为384.21、432.54、 0.11和0.23；转入prOsRUBQ1启动子序列的玉米植株、转入对照序列的玉米植 株、野生型玉米植株（CK）和经Taqman鉴定为非转基因的玉米植株（NGM） 的茎中ELISA值（ng/g）分别为376.57、317.64、0和0.13，这一结果表明 prOsRUBQ1启动子普遍存在活性，在叶片、根和茎中均有表达。
表1、转基因玉米植株的PAT蛋白含量的实验结果
上述结果还表明，转入prOsRUBQ1启动子序列的玉米植株的叶片和茎中 ELISA值（ng/g）分别为585.34和376.57，而转入对照序列的玉米植株的叶片 和茎中ELISA值（ng/g）分别为461.65和317.64，前者显著高于后者，这一结 果表明prOsRUBQ1启动子活性高，显著地增加了目的异源核苷酸序列在植物组 织中的表达量，特别是在叶片和茎中。
实验三、转基因玉米植株的除草剂抗性效果检测
分别取转入prOsRUBQ1启动子序列的玉米植株和转入对照序列的玉米植 株（V3-V5期），并用4×草铵膦（1600gae/ha，4倍大田浓度）和空白溶剂（水） 喷施。喷施7天后观察植株的发育情况。同时以野生型玉米植株（CK）和经 Taqman鉴定为非转基因的玉米植株（NGM）作为对照，按照上述方法进行检测 分析。每类植株选3个株系，从每个株系选3株进行测试，每株选取20粒种子。 结果如图4所示。
图4的结果表明：在喷施空白溶剂（水）7天后，转入prOsRUBQ1启动子 序列的玉米植株、转入对照序列的玉米植株、野生型玉米植株（CK）和经Taqman 鉴定为非转基因的玉米植株（NGM）之间无明显差异；在喷施4×草铵膦7天 后，除了野生型玉米植株（CK）和经Taqman鉴定为非转基因的玉米植株（NGM） 均已死亡外，转入prOsRUBQ1启动子序列的玉米植株和转入对照序列的玉米植 株均可以正常生长；与转入对照序列的玉米植株相比，转入prOsRUBQ1启动子 序列的玉米植株的生长比较旺盛，叶片呈深绿色，这一结果表明prOsRUBQ1启 动子活性高，显著地增加了目的异源核苷酸序列在植物组织中的表达量。
综上所述，本发明组成型启动子几乎在植物的大多数组织和许多类型细 胞中普遍存在活性且显著地提高目的异源核苷酸序列在植物组织中的表达量， 特别是在叶片和茎中。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理 解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方 案的精神和范围。