技术领域
本发明涉及一种KRAS基因突变检测试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术
1)KRAS基因突变在结直肠癌中的临床意义
近年来，随着人民生活水平的不断提高，饮食习惯和饮食结构的改变以及人口老龄化，我国结直肠癌（colorectal cancer,CRC）的发病率和死亡率均保持上升趋势。其中，结肠癌的发病率上升尤为显著。大多数患者发现时已属于中晚期。结直肠癌发病率22.1万，死亡率11万，5年生存率63.7%。
KRAS是EGFR（表皮生长因子受体）信号传导通路中的一个关键的下游调节因子，参与细胞生长的调节，在癌变发生过程中起着重要作用。KRAS基因产物参与了控制基因转录的激酶信号传导路径，从而能调节细胞的生长与分化。KRAS基因的改变使KRAS蛋白发生变化，其结果KRAS蛋白不再具有裂解GTP分子和释放GTP分子的能力。这样的改变导致这条信号传导路径始终处于“开”通的状态。这种“开”的信号导致细胞的生长和增生。因此KRAS的过度表达与扩增导致持续的细胞增殖，这是肿瘤发生的关键一步。
西妥昔单抗和帕尼单抗是作用于EGFR的单克隆抗体，可以抑制下游的信号通路传导。2008年6月,美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上CRYSTAL、OPUS等研究了西妥昔单抗联合FOLFIRI和FOLFOX作为转移性结直肠癌的初始治疗作用，结论为：KRAS野生型患者在加用西妥昔单抗治疗后PFS得到了显著改善。若KRAS有突变，则无论单药或联合均不应使用西妥昔单抗或帕尼单抗，因为不仅无效，还增加副反应，浪费金钱。
2008年10月，KRAS基因检测被写入《美国国立癌症综合网络(NCCN) 结直肠癌临床实践指南》，专家组强烈推荐所有转移性结直肠癌患者均应进行KRAS基因型检测，原发灶或继发灶组织均可，对于KRAS野生型的患者可考虑进一步检测BRAF分型。
2010年版中国《结直肠癌诊疗规范》指出：完整的病理报告内容应该包括K-ras基因状态的检测，同时晚期/转移性结直肠癌靶向药物治疗前应检测KRAS。
2)KRAS基因突变在非小细胞肺癌NSCLC的临床意义
原发性肺癌（以下简称肺癌）是我国最常见的恶性肿瘤之一。2012年WHO统计显示，肺癌是我国目前发病率和死亡率第1位的恶性肿瘤。基于肺癌的生物学特性、治疗和预后，WHO将其分为两大类：非小细胞肺癌NSCLC和小细胞肺癌SCLC。其中NSCLC占肺癌的85%以上。虽然治疗肺癌技术有了很大的提高，但5年生存率没有明显改善，而且大多数肺癌患者死于无法控制的远处转移，传统的化疗和放疗由于缺乏特异性，取得疗效的同时也往往给患者带来较大的副作用。因此，选择肺癌细胞特异的分子靶点，应用针对该靶点的药物进行治疗，在取得明显疗效的同时又避免对正常细胞的伤害的治疗模式，已经被肿瘤学术界和广大患者所认同和采用。
EGFR（epidermal growth factor receptor,表皮生长因子受体）是目前用于NSCLC分子靶向治疗的最主要靶点。EGFR受体抑制剂TKI小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor），通过阻断细胞受体的ATP结合位点，阻止下游信号传递而产生抑制肿瘤作用。
三种EGFR-TKI（吉非替尼/易瑞沙，厄罗替尼/特罗凯，和凯美钠）是目前用于NSCLC分子靶向治疗的主要药物，但在不同的病人中EGFR-TKI的疗效差异很大。大量临床实验发现，除了EGFR突变，KRAS突变能帮助NSCLC病人更好的预测吉非替尼疗效；KRAS突变的NSCLC病人用厄洛替尼联合处理后临床预后较差。
2012年《美国国立癌症综合网络(NCCN)非小细胞肺癌临床实践指南》病 理评估原则中明确：KRAS突变和内源性TKI耐药有关，确定KRAS基因状态有助于选择适合TKI治疗的病人。同时指出，KRAS基因状态是NSCLC生存的预后指标，也是EGFR-TKI药物的疗效预测指标；还和顺铂/长春瑞滨化疗疗效相关。
目前临床检测KRAS基因突变的检测试剂原料配备较多，实验过程较为繁琐，设计的原料种类较多，耗时较长，容易污染，准确性不高，另外冷冻的试剂反复冻融多次会造成试剂失效，所以探索一种检测KRAS基因快速可靠的方法已经成为临床实验不得不解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种KRAS基因突变检测试剂盒，本试剂盒结构完全基于一种新的实验方法设计，结构简单合理、使用方便、分区设计使得检测过程不易受污染。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种KRAS基因突变检测试剂盒，包括：带盒盖的盒体、挡板、2个海绵、1个装有蒸馏水的试管、2个装有PCR反应预混液的试管、3个装有KRAS外显子1PCR引物的试管、3个装有KRAS外显子2PCR引物的试管、3个装有KRAS外显子1测序引物的试管、3个装有KRAS外显子2测序引物的试管，
其中，所述挡板置于盒体内，将盒体分成两个部分，所述2个海绵分别置于挡板两侧的盒体内，在海绵上打有容器孔，所述1个装有蒸馏水的试管、2个装有PCR反应预混液的试管、3个装有KRAS外显子1PCR引物的试管、3个装有KRAS外显子2PCR引物的试管置于挡板一侧海绵的容器孔内，所述3个装有KRAS外显子1测序引物的试管、3个装有KRAS外显子2测序引物的试管置于挡板另一侧海绵的容器孔内。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述两个海绵中的一个打有9个容器孔，另一个海绵打有6个容器孔。
进一步，所述容器孔在海绵上平行排列。
本发明与现有产品相比有如下积极有益的效果：
本试剂盒完全基于一种新的实验方法设计，结构设计简单合理、使用方便、分区设计使得检测过程不易受污染；
本试剂盒在检测KRAS基因第2号外显子突变时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点；
本试剂盒中设置的挡板，使得一个空间变为两个空间，能有效防止试剂交叉等引起的污染，将所有引物试剂分成两管存储，可以有效减少试剂反复冻融的风险，使得实验更准确。
附图说明
图1为本发明一种KRAS基因突变检测试剂盒的结构示意图；
附图中，各标号所代表的部件列表如下：
1、盒体，2、海绵、3、挡板，4、装有蒸馏水的试管，5、装有PCR反应预混液的试管，6、装有KRAS外显子1PCR引物的试管，7、装有KRAS外显子2PCR引物的试管，8、装有KRAS外显子1测序引物的试管，9、装有KRAS外显子2测序引物的试管，10、容器孔。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
如图1所示，一种KRAS基因突变检测试剂盒，包括：带盒盖的盒体1、 挡板3、2个海绵2、1个装有蒸馏水的试管4、2个装有PCR反应预混液的试管5、3个装有KRAS外显子1PCR引物的试管6、3个装有KRAS外显子2PCR引物的试管7、3个装有KRAS外显子1测序引物的试管8、3个装有KRAS外显子2测序引物的试管9，
其中，所述挡板3置于盒体1内，将盒体1分成两个部分，所述2个海绵2分别置于挡板3两侧的盒体1内，在海绵2上打有容器孔10，所述1个装有蒸馏水的试管4、2个装有PCR反应预混液的试管5、3个装有KRAS外显子1PCR引物的试管6、3个装有KRAS外显子2PCR引物的试管7置于挡板3一侧海绵2的容器孔10内，所述3个装有KRAS外显子1测序引物的试管8、3个装有KRAS外显子2测序引物的试管9置于挡板3另一侧海绵2的容器孔10内。
所述两个海绵2中的一个打有9个容器孔10，另一个海绵2打有6个容器孔10。
所述容器孔10在海绵2上平行排列。
操作方法：
1、DNA提取：（使用天根公司基因组DNA提取试剂盒，货号DP331)按照提取试剂盒说明书做常规DNA提取，最终DNA的洗脱体积50ul，若DNA当天不使用，则要保存在-20℃。
2、PCR：将PCR反应预混液、双蒸水及KRAS PCR引物,室温融化并混匀，2000rpm离心3秒。
所述PCR反应预混液为2×Taq mix（novoprotein公司，产品货号：E005）
试剂盒包含2套PCR引物。一套能够扩增KARS基因外显子1，包含12、13密码子在内的片段，另一套能够扩增KARS基因外显子2，包含61密码子在内的片段。每套PCR引物中均有一条引物标记了生物素的引物，它能保证在测序反应中正确分离出待测DNA链。同时，该试剂盒还含有2条不同的测 序引物，一条用于12、13密码子，另一条用于61密码子，它们用于后续的焦磷酸序列分析中检测并定量者最常见的3个密码子突变。
基因KRAS第1外显子的正向引物、反向引物和测序引物：
F:5′-AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3′（SEQ ID NO.1）；
R:5′-GTTGGATCATATTCGTCCACAAA-3′（SEQ ID NO.2），5′端生物素标记;
测序引物：5′-AAACTTGTGGTAGTTGGAGC-3′（SEQ ID NO.5），检测密码子12、13；
基因KRAS第2外显子的正向引物、反向引物和测序引物：
F:5′-CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTCAGGATT-3′（SEQ ID NO.3）；
R:5′-AAGAAAGCCCTCCCCAGTCC-3′（SEQ ID NO.4），5′端生物素标记;
测序引物：5′-TTGGATATTCTCGACACAGCAGGT-3′（SEQ ID NO.6），检测密码子61；
所述基因KRAS外显子1PCR引物和KRAS外显子2PCR引物的浓度均为10μmol/L；
所述基因KRAS外显子1测序引物和KRAS外显子2测序引物的浓度均为10μmol/L；
每个样本需要做两管PCR扩增，体系配制如表1和表2，基因KRAS外显子1和外显子2PCR扩增的总体积均为25ul。
表1
表2
样本量较多时，可以计算好PCR反应预混液、双蒸水以及引物的使用量，加入适当体积离心管中，充分混合均匀，2000rpm离心5秒，向设定的n个PCR反应管中分别加入24ul。
PCR反应条件设置：反应体系设为25ul
95℃：5min；
95℃：30sec,61℃:30sec,72℃:30sec，30个循环；
72℃：10min,25℃：10min。
若PCR扩增产物当天不使用，则要保存在-20℃。
3、PCR产物处理：在新的PCR八联管内按照表3配制预混液.
表3
（注意：Beads在使用前必须摇匀，确保悬浮液均一）
所述Beats为GE公司产品，货号货号17-5113-01。
所述Binding Buffer为Qiagen公司焦磷酸测序测序仪PyroMark Q24的配套常规试剂。
建议每次实验加入一个阴性对照，使用高纯水代替PCR扩增产物。
用盖子密封PCR八联管，2000rpm涡旋震荡2分钟。
在24孔测序板孔内加入1ul测序引物及24ul Annealing Buffer（每个样本需要做两个孔，分别加入测序引物A及测序引物B，以检测不同区域）
所述Annealing Buffer为Qiagen公司焦磷酸测序测序仪PyroMark Q24 的配套常规试剂。
按照Qiagen公司焦磷酸测序测序仪PyroMark Q24配套的真空负压式工作站的操作指南的步骤一一操作。
将24孔测序板置于预热的支架上，在80℃的加热模块上加热2分钟；从支架上移走反应板，让样本冷却至少5分钟，直至室温（15-25℃）。冷却后的反应板可放入PyroMark Q24内操作。
4、测序设置及分析：
12及13密码子测序设置：在Q24软件中建立新的分析-New AQ Assay，在Sequence to Analyze中输入TGNTGNCGTAGGC，在Dispensation Order中输入TACGACTCAGATCGTAG，此设置分析12(GGT)及13(GGC)密码子的第二个碱基（最常见突变）；
61密码子测序设置：在Q24软件中建立新的分析—New AQ Assay，在Sequence to Analyze中输入CANGAGGAGTA，然后点击“Generate Dispensation Order”按钮，此设置分析61(CAA)的第三个碱基（最常见突变）；
12及13密码子测序分析：若结果没有突变（含5%以下突变）或者结果为红色（Failed），请改变Analysis Setup中的Sequence to Analyze为TNGTNGCGTAGGC，此设置分析12(GGT)及13(GGC)密码子的第一个碱基；
61密码子测序分析：若结果没有突变（含5%以下突变）或者结果为红色（Failed），请改变Analysis Setup中的Sequence to Analyze为CNAGAGGAGTA或者NAAGAGGAGTA，此设置分析61(CAA)密码子的第一个及第二个碱基；
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。