技术领域
与提取叶黄素/叶黄素类、尤其用超临界流体从金盏花的花提取叶黄素和从该方法获得的高度纯化的叶黄素/叶黄素相关的有机化学。
本发明的背景
金盏花（万寿菊(Tagetes erecta)）是具有管样花瓣的具有广泛颜色范围的一年生开花植物。在泰国，金盏花（marigold）主要在素攀府、北碧府、南奔府和清迈府种植。归因于高含量的类胡萝卜素，常在动物饲料中出于动物健康益处使用金盏花。另外，还使用金盏花中亮黄色和亮红色的类胡萝卜素作为饲料中的天然色素，例如用于产生亮红色卵黄的鸡饲料。
金盏花中的主要类胡萝卜素是叶黄素类（至多1%），尤其叶黄素。
叶黄素（lutein）是显示抗氧化特性的叶黄素（xanthophyll）并且还是眼中视网膜的组成。已经报道，叶黄素可以有效地用于治疗与视觉相关的疾病并且还用于维持人体中的功能。因此，从天然材料提取叶黄素的方法是令人感兴趣的。
尝试之一是通过有机溶剂、尤其非极性溶剂如己烷从金盏花提取叶黄素。有机溶剂中所含的材料称作油水混合物（miscellar）。为了获得叶黄素产物，必须蒸发剩余溶剂。溶剂蒸发后获得的粗提物称作油树脂（oleoresin）。油树脂（oleoresin）含有10%(w/w)叶黄素类，其中叶黄素是主要产物。
问题之一是绝对移除提取溶剂的严格要求。剩余溶剂必须不得超过国际标准。这归因于以下事实：剩余溶剂可能对消费者造成严重健康问题。
已经存在通过使用更安全用于消费产品的替代性溶剂即超临界流体、尤其超临界二氧化碳提取叶黄素的尝试。另外，与液体溶剂相比时，超临界二氧化碳拥有高扩散能力和低粘度。因此，超临界二氧化碳因传质特性而适用于提取。另外，它可以用于在低温（临界温度是30℃）下提取，这防止提取材料的分解或降解。也可以通过降低压力或降低温度容易地移除它。
美国专利号20040267033描述了通过超临界二氧化碳在70℃和475巴从金盏花提取叶黄素，获得85-90%产率。本发明的问题在于必须使用更高的温度，目的是以营养药或药物中应用所要求的较高纯度获得叶黄素。与提取期间渐增温度相关的问题是叶黄素类的降解或分解，而压力的增加还消耗更多能量并带来更多风险。因此，超临界流体不能实际地用于工业提取叶黄素类，尤其工业提取高度纯化的叶黄素。根据以上发明的方法仍具有条件苛刻（strongcondition）的问题，即便它可以解决液体溶剂的安全问题。
其他相关文献包括美国专利44669223、5120558、5932101、6737552、6350890、7214379、5780693、6262284、7351424和6689400。
本发明人已经研究了现有技术中的问题和自然界中这种化合物和其他叶黄素类的天然特性。发现自然界中的叶黄素和其他叶黄素类大多处于具有脂肪酸的二酯形式，例如叶黄素二棕榈酸酯、叶黄素二肉豆蔻酸酯、玉米黄素二棕榈酸酯（zeaxanthine depalmitate）和玉米黄素二肉豆蔻酸酯（zeaxanthinedemyristate）。这些二酯具有高分子量，例如叶黄素二棕榈酸酯具有在1045道尔顿的分子量，而游离叶黄素具有仅在569道尔顿的分子量。因此，用超临界流体提取这个复杂形式分子中的天然叶黄素/叶黄素类，因而将需要高温和/或高压以获得与溶剂提取方法相似的叶黄素/叶黄素类产率。
本发明人用超临界流体以降低的温度60℃直接从天然材料进行叶黄素提取并且分别在300巴、350巴和400巴变动压力条件持续4小时，如图1中所显示。
图1显示从提取获得的粗制叶黄素的产率。虽然通过增加压力增加粗制叶黄素，最大产率在400巴时仅是74.40%。
另外，本发明人将粗制叶黄素应用于色谱纯化，发现游离叶黄素与极高量的叶黄素酯混合，如图2中所显示。
直至现在，不存在用超临界流体在低温和低压力以高于90%的产物产率提取粗制天然叶黄素的报道。
因此，本发明人旨在将叶黄素酯/叶黄素类的酯在用超临界流体提取之前修饰成游离叶黄素/叶黄素类和/或低分子量叶黄素酯（lutein ester）/叶黄素类的酯（xanthophylls ester）。含有叶黄素/叶黄素类的天然材料包括金盏花，羽衣 甘蓝，菠菜，微生物细胞例如细菌、酵母、真菌和微藻，以及藻类。本发明允许用超临界流体在低温和低压下从天然材料提取粗制叶黄素，但是仍提供较高产率。
发明简述
本发明提供用于从天然材料提取叶黄素的新方法，所述方法产生比先前存在更高的粗制叶黄素和/或更高的纯化叶黄素。
本发明的另一个目的是提供适用于叶黄素类的提取方法，所述叶黄素类处于与叶黄素相同的化合物组（group）。
本发明的另一个目的是提供从根据本发明的方法获得的高度纯化的叶黄素/叶黄素类。
本发明的方法包括将天然材料中的天然叶黄素酯修饰成游离叶黄素和/或低分子量叶黄素酯，用超临界流体在最佳条件提取所述天然材料。因为提取效率改进，所以本发明的方法能够从天然材料以高量提取叶黄素。粗制叶黄素可以进一步用色谱（chromatography）纯化，以便获得高度纯化的叶黄素。
附图简述
图1该图表显示通过超临界流体在60℃、压力300巴、350巴和400巴下直接从天然材料提取的粗制叶黄素的产率。
图2.图1中获得的粗制叶黄素的色谱图，其显示少量游离叶黄素和高量的叶黄素酯。
图3.该图显示通过超临界流体在根据本发明的温度和压力下（在修饰金盏花中的叶黄素酯后从天然材料）提取的粗制叶黄素的产率。
图4.图3中获得的粗制叶黄素的色谱图，其显示还被高度纯化的高量游离叶黄素。
发明详述
在本发明中，“粗制叶黄素”意指含有叶黄素作为成品的粗产物。
当本发明的方法应用于总叶黄素类/除叶黄类之外的其他色素时，“粗制叶黄素”意指叶黄素类/除叶黄素之外的其他色素的粗产物。因此，术语“叶黄素（lutein）”和“叶黄素类（xanthophylls）”在本发明自始至终是可互换的。
下文描述根据本发明从天然材料提取叶黄素的方法的细节。
用于提取天然叶黄素的方法包括：
a.含有叶黄素的天然材料的预处理，通过将天然材料中的天然叶黄素酯修饰成便于提取操作的游离叶黄素和/或低分子量叶黄素酯。
b.提取，其中所述提取包括使（a）中所述预处理的天然材料与超临界流体接触，通过在30-100℃、200-450巴之间选择最佳条件持续某段时间而调节温度和/或压力，以允许游离叶黄素和/或低分子量叶黄素酯在超临界流体中的最大溶解度。
c.在提取后从流体分离固体材料，并且调节温度和/或压力以使所提取的材料在流体中的溶解度最小化并收集作为粗制叶黄素的所述提取材料。
根据所述方法，所述天然材料可以选自金盏花的花，羽衣甘蓝，菠菜，藻类，包括细菌、酵母、真菌和微藻的微生物细胞。
根据所述方法，在使所述材料经历步骤（a）之前，将所述天然材料用低分子量酸水解并随后通过用水洗涤移除所述酸和/或干燥和/或碾磨。酸可以是有机酸例如乙酸，或者无机酸例如盐酸等。
在步骤（a）中叶黄素酯的修饰是广泛使用的皂化。例如，可以通过在取决于所用天然材料的最佳温度和时间使用KOH和乙醇进行所述皂化。叶黄素酯的修饰可以通过用低分子量酸即盐酸和乙醇酯化或使用KOH和甲醇的酯交换来实现。
本发明的流体可以选自二氧化碳、乙醇或其组合。然而，优选二氧化碳。
在一些情况下，取决于作为原料所用的天然材料，共溶剂如无毒天然油即棕榈油、大豆油，橄榄油或其组合可以与流体一起使用以便改善提取效率。
在步骤b）中，采用流体提取时，最佳条件是在40-70℃，300-400巴之间。这种条件产生最多粗制叶黄素，原因是与现存方法相比时温度和压力“不太高”。
另外，用于提取的方法还可以包含通过色谱纯化粗制叶黄素的步骤（d）。
本发明还涉及从前述提取方法获得的叶黄素粗产物和从色谱获得的纯化叶黄素。
重要的是指出，本发明不使用可能在溶剂移除期间造成（部分）降解的溶剂。本发明采用对天然材料中叶黄素酯直接修饰。这具有优点，即用流体提取 之前不浪费叶黄素。同时，提取法还应当提供平滑和更有效的流速，原因在于提取用靶化合物的分子量，原因在于降低重量的分子量。
下文是参考附图的实施例，但是不意味通过这些实施例限制本发明的范围。
实施例
水解
金盏花新鲜花瓣用低分子量酸即乙酸或盐酸水解30分钟，以便分解纤维素。将水解的花瓣用水洗涤并且随后干燥或晒干并研磨以形成粉末。
修饰（将天然材料中的叶黄素酯修饰成游离叶黄素或低分子量叶黄素酯）
在温度75℃添加1克水解的金盏花粉末连同2ml95%乙醇。随后添加2ml40%碱性溶液并在75℃温育4小时。将溶液冷却至65℃，并使用25%盐酸，将pH调节至7，以便终止皂化。随后将溶液干燥。
用超临界二氧化碳提取
在这个步骤中的，使用10ml超临界二氧化碳提取器（型号FX-220，ISCO）。将皂化的金盏花粉末（1g）在允许超临界二氧化碳与所述粉末接触之前添加至所述提取器。选择温度和/或压力至40-120℃，200-500巴之间的最佳条件持续4小时或其他持续时间，以便使游离叶黄素和/或具有低分子量的叶黄素酯在超临界二氧化碳中的溶解度最大化。最佳条件应当在35-45℃和300-400巴之间。该系统允许二氧化碳再循环或任选地释放二氧化碳至大气。
通过选择以下条件，申请人进行实验；
1)温度40℃，压力150、200、250、300、350和370巴
2)温度60℃，压力150、200、250、300和325巴
3)温度80℃，压力150、200、250和290巴
4)温度100℃，压力150、200、250和275巴
5)温度120℃，压力150、200和255巴
在图3的曲线中显示从以上实验获得的粗制叶黄素产物的结果。从图3可以见到，在的温度40℃和压力375巴，粗制叶黄素为98.5%，并且在温度60℃和压力330巴，粗制叶黄素还是98.5%。
总之，如果使用低温，则必须要求较高的压力以便使叶黄素的产率最大化。相反，如果使用较高温度，则可以应用较低的压力。然而，太高的温度和缺少 氧化保护剂将造成叶黄素以不可接受的水平降解或分解。
当比较图3中的本发明方法和图1中的方法时，显示在温度60℃，本发明的方法仅需要375巴处的压力并且产生粗制叶黄素高达98.5%，而图1中方法的压力必须在400巴并且粗制叶黄素产率仅是74.40%。可以得出结论本发明的方法更有效的。
该实验还通过上文提到的曲线指出，提取可以在低达30℃的温度进行。
残渣的分离和粗制叶黄素的收集
在提取完成后，分离残渣。将剩余溶液调节至允许所提取材料在二氧化碳中的最小溶解度的温度和/或压力。随后蒸发二氧化碳并且将作为叶黄素的粗提物收集在铝箔包裹的玻璃管中并在4℃避光贮藏。
纯化
使用35mm x240mm硅胶柱（100g二氧化硅）在正相色谱中纯化从游离叶黄素类酯和脂肪酸获得的游离叶黄素类。通过蠕动泵将由70:30己烷:乙酸乙酯组成的流动相以流速5-10毫升/分钟泵送至该柱。每隔10分钟收集样品。在流速10毫升/分钟时，将以产率46%获得纯度99.5%的叶黄素类，如图4中所显示。
图4显示如图3中存在的粗制叶黄素的色谱图，所述色谱图表明粗制叶黄素产物中叶黄素的量高于从根据图1的方法获得的粗制叶黄素产物中叶黄素的量。图4还显示粗制叶黄素产物几乎是纯叶黄素（100%），而通过图1方法获得的粗制叶黄素产物含有许多叶黄素酯，如图2的色谱图中所显示。
虽然在本实施例中使用金盏花作为天然材料的样品，但是本发明的方法也可以适用于其他含有叶黄素的天然材料，例如羽衣甘蓝、菠菜、微生物细胞（包括细菌、酵母、真菌和微藻）和藻类。
然而，本领域技术人员也可以修改本发明并且所述修改也视为处于本发明的范围内。
本领域技术人员还理解，通过调节条件以适于所述天然材料和选择的叶黄素类，本发明提取方法的原理可以适用于从含有叶黄素类的天然材料中提取叶黄素类（xanthothylls）（在具有或没有叶黄素(lutein)的情况下）。
最佳模式
如发明详述中描述。