技术领域
本发明属于生物技术领域，主要涉及一种核酸分子及其在人源化抗体制备中 的应用。
背景技术
抗体是一类重要的生物医药制品，在人类疾病的预防和治疗过程中发挥了重 要的作用。治疗性抗体的发展经历了鼠源抗体、嵌合抗体、改型抗体、表面重塑 抗体和全人源化抗体等不同的发展阶段。
全人源化抗体(FullHumanizedAntibody)，是指经过基因改造或转基因动 物免疫而获得的与人源抗体蛋白质序列完全一致的抗体。全人源化抗体由于不含 动物蛋白，因此副作用较低，作用效果更好，已成为当前和未来抗体工程的主要 研究和发展方向。目前全人源化抗体主要由噬菌体展示技术和转基因动物技术生 产而来。2002年，第一个由噬菌体展示技术生产的全人源化抗体Adalimumab (Humira)上市。2006年，第一个由转基因动物来源的全人源化抗体Panitumumab 在美国和欧洲批准上市。
噬菌体展示抗体(PhageDisplay-generatingAntibody)技术生产全人源化 抗体相对简单，技术相对成熟，但受抗体库容量和抗体翻译后修饰及有效折叠的 影响，利用该技术获得高亲合力抗体的难度很大。
转基因动物全人源化抗体(TransgenicHumanizedAntibody)是指将人类免 疫球蛋白基因全部或部分通过转基因或转人工染色体技术，转移至动物基因组中 [动物内源的抗体基因缺失(或失活)]，使动物表达人类抗体，从而获得全人源 化抗体。利用转基因动物生产全人源化抗体的最大优势是获得高亲合力抗体的机 率较大，同时利用一种转基因动物品系可针对不同的抗原生产不同类型的抗体， 无需像噬菌体展示技术，针对不同的抗原，每次都要重新构建噬菌体库。但随着 研究的深入，发现转入的人类免疫球蛋白基因片段虽然能在动物体内重排和表 达，但其产生人抗体蛋白的性能要低于未经基因改造前的动物自身抗体生产效 果。以小鼠为例，其原因主要是当抗体在B细胞发育的初级阶段作为B细胞表面 受体(BCR)时，其与鼠源的信号蛋白Igα和Igβ的相互作用并不是最优的(即 鼠源BCR与鼠源的Igα和Igβ或人BCR与人的Igα和Igβ相互作用效果是最好 的)，因此影响了抗体的类型转换、亲和力成熟和B细胞发育为成熟的生产抗体 的浆细胞。为克服这一难题，Lee等(Naturebiotechnology，2014；32(4)： 356-363)将三个人免疫球蛋白基因(IgH，Igκ和Igλ)的可变区替代小鼠的 免疫球蛋白可变区，而恒定区使用小鼠免疫球蛋白的相应片段，利用这种策略可 克服上述提到的问题，获得可变区为人源，恒定区为鼠源的嵌合抗体，再通过下 游的改造将鼠源的恒定区改造为人源的恒定区，得到全人源化抗体。这种方法存 在的缺点是需要进行二次改造才能获得全人源化抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种核酸分子，可以高效的制备全人源化抗体，其克 服了不同物种BCR与Igα和Igβ相互作用的不兼容性问题，同时相对Lee的方 法，其表达的人源化抗体无需进行二次改造。
本发明的目的是通过以下措施实现的：
本发明提供了一种核酸分子，包括了人免疫球蛋白基因或其片段，以及宿主 动物IgM恒定区的基因片段(即IgHCμ的基因片段)。
优选的，上述宿主动物IgM恒定区的基因片段位于(替代)人免疫球蛋白 IgM重链基因的相应恒定区。
上述宿主IgM恒定区基因片段为宿主动物IgHCμ的CH2部分序列、CH3、 CH4、TM1和TM2序列以及其之间的序列和相关PolyA信号序列。人CH1序列与 人Ig轻链结合，保证抗体结构，CH2部分区又保证人和小鼠C区正常转录和翻 译。当宿主为鼠时，用于取代的鼠IgM恒定区基因片段如SEQIDNO.1的<1>～ <4425>所示；被鼠源IgM恒定区基因片段替代的hIg序列如SEQIDNO.2所示。 当宿主为猪时，用于取代的猪IgM恒定区基因片段如SEQIDNO.3的<1>～<4386> 所示，被猪源IgM恒定区基因片段替代的hIg序列如SEQIDNO.4所示。
上述核酸分子中宿主动物IgM恒定区的基因片段的结构及其与人免疫球蛋 白IgM基因或其片段的连接结构如图1-1所示。进一步地，上述核酸分子还可以 包括FRT序列、人Ig内含子序列(如hIgM、hIgD)；所述核酸分子中宿主动物 IgM恒定区的基因片段与人免疫球蛋白IgM基因或其片段，以及与FRT、人Ig 内含子(如IgM、IgD)的连接结构如图1-2所示。当宿主为鼠时，所述FRT序 列如SEQIDNO.1<4426>～<4459>，人Ig内含子序列包括SEQIDNO.1<4460>～ <4717>；当宿主为猪时，FRT序列如SEQIDNO.3<4387>～<4420>，人Ig内含子 序列包括SEQIDNO.3<4421>～<4678>。
例如，具体地，人IgM的CH1和部分CH2序列，小鼠的CH2部分序列、CH3、 CH4、TM1和TM2序列以及其之间的序列和相关PolyA信号序列，与FRT、IgD内 含子、人的IgHG3的调控区(Sγ3)和IgHG3CH1序列依次链接，形成一个表达 嵌合人小鼠IgM和人IgG的基因载体(如图1-3)。或者，人IgM的CH1和部分 CH2序列，小鼠的CH2部分序列、CH3、CH4、TM1和TM2序列以及其之间的序列 和相关PolyA信号序列，与FRT、IgM内含子、人的IgD3的调控区(Sδ3)和 IgD3CH1序列链接，形成一个表达嵌合人小鼠IgM和人IgD的基因载体(图1-4)。
上述人免疫球蛋白基因包括了人免疫球蛋白重链基因的V区基因、D区基因、 J区基因。上述人免疫球蛋白重链基因还可以包括hCγ、hCα、hCδ和/或hCξ重 链基因和人的3’-调控区(hLCR)等。
例如，上述核酸分子的基因簇如图2所示(黑框位置为导入的宿主动物的 IgM恒定区基因部分序列(片段))。
通过以上的改造，上述核酸分子在动物体内发育的早期阶段表达与宿主动物 同源的IgM，该IgM作为BCR，有利于与动物自身的Igα和Igβ相互作用，促进 抗体的类型转换为IgG、亲和力成熟和B细胞发育。
一种表达载体，包含上述核酸分子。一种细胞，包含上述核酸分子或上述载 体。一种动物，如猪、鼠，包含上述核酸分子。一种人源化抗体，由上述核酸分 子重排、编码制得。上述核酸分子或载体或细胞在制备人源化抗体中的应用。上 述核酸分子或载体或细胞在制备转基因动物中的应用。
将经过上述改造的人免疫球蛋白基因转入动物体内获得转人免疫球蛋白转 基因动物，或进一步与自身免疫球蛋白基因不表达的动物进行杂交获得只表达人 抗体蛋白的基因工程动物。利用抗原免疫转入人免疫球蛋白基因(重链、轻链) 的动物，获得全人源化抗体。例如：
采用上述核酸分子或载体或细胞制备转基因动物的方法，包括以下步骤：
(1)所述核酸分子的获得；
(2)将所述核酸分子构建入载体；
(3)向宿主细胞(包括干细胞，诱导干细胞和体细胞)或胚胎导入含有所述 核酸分子的载体；
(4)将含有人Ig的细胞植入宿主动物的胚胎内(嵌合体制备)或体细胞克 隆；
(5)繁育杂合、纯合的转人Ig基因的动物。(包括与宿主内源免疫球蛋白 基因失活的动物杂交)。
上述宿主动物为哺乳动物，如鼠、兔、猪、牛、羊、鸡、马等。上述载体为 人工染色体(如酵母，细菌)、噬菌体、质粒等。上述载体导入宿主细胞的方法， 包括电穿孔、病毒感染、脂质体转染和显微注射等。
本发明所述宿主动物的IgM恒定区的基因片段、CH2部分序列是指编码可结 合宿主动物信号蛋白Igα和/或Igβ的核苷酸序列。
有益效果
1.本发明生产的全人源化抗体具有高亲和力。
2.本发明可利用一种转基因动物品系产生不同类型的各种抗体，且本发明适用 于多种动物。
3.本发明的宿主自身免疫球蛋白不表达或在检测限度以下。
4.本发明基因重排效率高，VDJC重排、突变和利用率与人体一致。
5.本发明直接生产全人源化抗体，不需进行二次改造，体内表达量可达到健康 成人水平。
附图说明
图1-1改造后宿主动物IgM恒定区的基因片段的结构及其与人免疫球蛋白IgM 恒定区基因或其片段的连接结构。
图1-2改造用的载体：包括宿主动物IgM恒定区的基因片段与人免疫球蛋白IgM 恒定区基因或其片段，以及与FRT、筛选基因、人Ig内含子(如IgM、IgD)的 等连接结构。
图1-3基因改造后宿主动物IgM恒定区基因片段结构及其与人IgM基因片段连 接结构以及其与其它的人Ig，如人IgG3基因或片段的连接结构
图1-4基因改造后宿主动物IgM恒定区基因片段结构及其与人IgM基因片段连 接结构以及其与其它的人Ig，如hlGD基因或片段的连接结构
图2实施例1的改造后人免疫球蛋白重链基因簇结构图
图3实施例1人免疫球蛋白Kappa轻链基因簇结构图
图4实施例1人免疫球蛋白lambda轻链基因簇结构图
图5实施例1小鼠免疫球蛋白重链基因簇
图6实施例1敲除小鼠免疫球蛋白重链基因的基因打靶
图7实施例1小鼠免疫球蛋白轻链基因簇
图8实施例1敲除小鼠免疫球蛋白轻链基因的基因打靶
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于 对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术 熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
将改造的人免疫球蛋白基因转入小鼠体内，再免疫含有人免疫球蛋白基因的 小鼠获得全人源化抗体，具体步骤如下：
1.人免疫球蛋白基因的优化改造
1)人免疫球蛋白重链基因的改造
将宿主动物IgM恒定区基因片段经同源重组转入含人Ig的YAC或BAC载体 上，构建人免疫球蛋白重链基因的基因簇如图2所示(黑框位置为导入的鼠的 IgM恒定区的基因片段)。包括了依次为人免疫球蛋白重链基因的V区、D区、J 区，hIgHCμ、hIgHCγ3、hIgHCγ1、hIgHCα1、hLCR；其中，hIgHCμ经基因改造， 鼠源IgHCμ的CH2部分序列、CH3、CH4、TM1和TM2序列以及其之间的序列和相 关PolyA信号序列等(DNA序列为SEQIDNO.1)取代了部分原hIgHCμ和IgHCδ 的相应区域(DNA序列为SEQIDNO.2)，其改造后的结构如图1-1和图1-3所示。
2)人免疫球蛋白Kappa轻链基因的改造
人免疫球蛋白kappa轻链基因包括了人免疫球蛋白kappa轻链基因全部或部 分V区、J区、C区，以及KDE区。基因簇如图3所示。
3)人免疫球蛋白lambda轻链基因的改造
人免疫球蛋白lambda轻链基因包括了人免疫球蛋白lambda轻链基因全部或 部分V区、J区和C区，同时包括末端的增强子结构。基因簇如图4所示。
2.人源化抗体转基因小鼠的培育
1)转人免疫球蛋白重链基因小鼠的培育
利用已有的常规转基因技术将步骤1的1)中构建的人免疫球蛋白重链基因 转入小鼠体内。通过PCR检测和ELISA检测双标准筛选获得的转人免疫球蛋白重 链转基因小鼠。
使用的PCR鉴定引物为：
PCR1
For：TGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTC
Rev：TTGCTTAACTCCACACCTGCTCCTG
PCRproductsize：329bp
PCR2
For：TTGAGGAGACTGTCCATCCTTCAC
Rev：GAGAGGGCATCTTGGTCTTCTTTC
PCRproductsize：471bp
使用的ELISA鉴定的抗体为：sigma(I1886)和sigma(A8792)，以健康成 年人和健康小鼠血清作为对照。
2)转人免疫球蛋白kappa轻链基因小鼠的培育
利用已有的常规转基因技术将步骤1的2)中构建的人免疫球蛋白kappa轻 链基因转入小鼠体内。通过PCR检测和ELISA检测双标准筛选获得的转人免疫球 蛋白kappa轻链转基因小鼠。
使用的PCR鉴定引物为：
PCR1：
FOR：TGCTCTGACCTCTGAGGACCTGTCTGTA
Rev：TTCAGGCAGGCTCTTACCAGGACTCA
PCRproductsize：616bp
PCR2：
For：CACCCAAGGGCAGAACTTTGTTACT
Rev：GAGGAAAGAGAGAAACCACAGGTGC
PCRproductsize：596bp
使用的ELISA鉴定的抗体为：sigma(K3502)和sigma(A7164)，以健康 成年人和健康小鼠血清作为对照。
3)转人免疫球蛋白lambda轻链基因小鼠的培育
利用已有的常规转基因技术将步骤1的3)中构建的人免疫球蛋白lambda 轻链基因转入小鼠体内。通过PCR检测和ELISA检测双标准筛选获得的转人免疫 球蛋白lambda轻链转基因小鼠。
使用的PCR鉴定引物为：
PCR1：
For：AGCACAATGCTGAGGATGTTGCTCC
Rev：ACTGACCCTGATCCTGACCCTACTGC
PCRproductsize：562bp
PCR2：
FOR：CTCTGCTGCTCCTCACCCTCCTCACTCAGG
REV：GAGAGTGCTGCTGCTTGTATATGAGCTGCA
PCRproductsize：462bp
使用的ELISA鉴定的抗体为：sigma(L1645)和sigma(A5175)，以健康 成年人和健康小鼠血清作为对照。
4)免疫球蛋白重链基因敲除小鼠的培育(图5、图6)
利用Crispr/Cas9技术，构建免疫球蛋白重链基因敲除小鼠。选择小鼠免疫 球蛋白重链基因的IgHCμ作为基因敲除位点(敲除位点及基因敲除效果见图6)， 获得免疫球蛋白重链基因敲除小鼠。通过PCR检测和ELISA检测双标准筛选获得 的免疫球蛋白重链基因敲除小鼠。
使用的PCR鉴定引物为：
For：AGCACCATTTCCTTCACCTGGAAC
Rev：CAAGGAGCAAATGACCATGTCTGG
PCR产物：760bp。然后用BstEII酶切，基因打靶的是753bp，没有基因打靶的是500bp 和260bp的两条带。
使用的ELISA鉴定的抗体为：sigma(M8644)和sigma(A8786)，以健康 成年人和健康小鼠血清作为对照。
5)免疫球蛋白kappa轻链基因敲除小鼠的培育(图7、图8)
利用常规基因敲除技术，敲除小鼠免疫球蛋白kappa轻链基因的整个恒定区 (C区)，获得免疫球蛋白kappa轻链基因敲除小鼠。通过PCR检测和ELISA检测 双标准筛选获得的小鼠免疫球蛋白kappa轻链基因敲除小鼠。
使用的PCR鉴定引物为：
PCR1：
For：CCCTTCCCTAGCCAAAGGCAACTA
Rev：CACAACGGGTTCTTCTGTTAGTCC
PCRproductsize：466
PCR2：
For：CACACCTCCCCCTGAACCTGAAAC
Rev：GTTGTGGGTAGTGCCCAGCCTTGC
PCRproductsize：464bp
使用的ELISA鉴定的抗体为：SouthernBiotech(1170-01)和SouthernBiotech (1170-05，以健康成年人和健康小鼠血清作为对照。
6)杂交组合获得人源化抗体转基因小鼠
将第二步1)，2)，3)，4)，5)步获得的小鼠进行杂交繁育，经过PCR和ELISA 检测，最终获得高表达人免疫球蛋白，而不表达(或低表达)鼠免疫球蛋白的人 源化抗体转基因小鼠用于下一步的研究。
3.全人源化抗体的获得
1)OVA免疫第2步6)获得的人源化抗体转基因小鼠
选择8周龄的小鼠进行免疫。
初免：
①用PBS稀释OVA(SigmaA7641)抗原，终浓度为5mg/ml，加入50ugCpG(ODN1826， tlrl-1826，Invivogen)，加入适量氢氧化铝(vac-alu-50，Invivogen)，使氢氧化铝浓度为 1％。
②将①中准备好的抗原0.75mL与CFA佐剂(SigmaF5881)按1∶1混合，用 MIXPACTM注射器使之乳化，每只小鼠，注射剂量为200ul(0.5mg)，进行皮下 注射免疫。
二免：
①初免后第16天进行二免，用PBS稀释抗原，终浓度为2.5mg/ml，加入25ugCpG， 加入适量氢氧化铝，使氢氧化铝浓度为1％。
②将①中准备好的抗原0.75mL与IFA佐剂按1∶1混合，用MIXPACTM注射器使 之乳化，每只小鼠注射剂量为200ul(0.25mg)，进行腹腔注射免疫。
三免：
①二免第16天后进行三免，用PBS稀释抗原，终浓度为1.25mg/ml，加入12.5ug CpG，加入适量氢氧化铝，使氢氧化铝浓度为1％。
②直接注射抗原蛋白，按①中方法配制，每只小鼠注射剂量为200ul(0.25mg)进 行腹腔注射免疫。
2)小鼠抗体检测
第3次免疫后10天，分别取编号为3554，3555，3556号小鼠取血进行ELISA 检测，以健康成年人和野生型小鼠作为对照，分别检测免疫后小鼠血清中鼠IgG 的含量和人IgG的含量，结果如下：
①小鼠IgG的含量检测
使用试剂盒为小鼠IgGELISA试剂盒(Abcam，ab157719)
3554：检测限度以下
3555：检测限度以下
3556：检测限度以下
健康成年人：检测限度以下
野生型小鼠：0.7mg/ml
结果显示：免疫后的人源化抗体小鼠的鼠源IgG表达量极低。
②小鼠血清中人IgG的检测
使用试剂盒为人IgGELISA试剂盒(Abcam，ab100547)
3554：10.3mg/ml
3555：8.1mg/ml
3556：8.2mg/ml
健康成年人：10.2mg/ml
野生型小鼠：<0.1ng/ml
结果显示：免疫后的人源化抗体小鼠的人源IgG表达量较高。
③OVA抗体亲和力测定
选取3556号小鼠，将其脾细胞和杂交瘤细胞融合，筛选单克隆抗体，ELISA筛 选表达量最高的3个细胞克隆，利用竞争性ELISA检测法(CEB459Ge， Cloud-CloneCorp)进行抗OVA抗体亲和力检测，结果显示最高亲和力的抗体为 230pM。
本发明对人免疫球蛋白基因的改造方案，在其它哺乳动物中同样适用，例如， 猪等哺乳动物作为宿主动物同样可实现本发明所述全人源化抗体表达的有益效 果。