一种嵌合核酸分子及其在人源化抗体制备中的应用.pdf

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510690809.6 (22)申请日 2015.10.21 C12N 15/13(2006.01) C07K 16/46(2006.01) C12N 15/85(2006.01) A01K 67/027(2006.01) (71)申请人 重庆市畜牧科学院 地址 402460 重庆市荣昌县昌龙大道 51 号 申请人 邹贤刚 (72)发明人 葛良鹏 刘作华 游小燕 邹贤刚 吴梦 杨松全 林保忠 刘雪芹 黄勇 丁玉春 (74)专利代理机构 重庆弘旭专利代理有限责任 公司 50209 代理人 文巍 (54) 发明名称 一种嵌合核酸分子及其

2、在人源化抗体制备中 的应用 (57) 摘要 一种核酸分子， 包括了人免疫球蛋白基因或 其片段， 其特征在于 ： 还包括宿主动物 IgM 恒定 区基因片段。本发明可以高效的制备全人源化抗 体， 其克服了不同物种BCR与Ig和Ig相互作 用的不兼容性问题， 同时其表达的人源化抗体无 需进行二次改造。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表20页 附图2页 CN 105441455 A 2016.03.30 CN 105441455 A 1.一种核酸分子， 包括了人免疫球蛋白基因或其片段， 其特征在于： 还包括宿主动物

3、IgM恒定区基因片段。 2.如权利要求1所述的核酸分子， 所述宿主动物IgM恒定区位于原人免疫球蛋白IgM 恒定区的相应区域。 3.如权利要求1或2所述的核酸分子， 所述宿主IgM恒定区基因片段为宿主IgHC 的CH2 部分序列、 CH3、 CH4、 TM1和TM2序列以及其之间的序列和相关PolyA信号序列。 4.如权利要求1-3任一所述的核酸分子， 所述人免疫球蛋白基因或其片段与宿主动物 IgM恒定区基因片段的连接结构如图1-1所示。 5.如权利要求1-4任一所述的核酸分子， IgM恒定区基因片段如SEQIDNO.1或SEQIDNO.3所示。 6.如权利要求1-5任一所述的核酸分子， 还包

4、括FRT序列、 人Ig内含子序列 （如hIgM、 hIgD） 。 7.如权利要求6所述的核酸分子， 所述FRT序列如SEQIDNO.1， 人Ig内 含子序列包括SEQIDNO.1； 或者FRT序列如SEQIDNO.3， 人Ig内含子序列包括SEQIDNO.3。 8.如权利要求1-5任一所述的核酸分子， 所述核酸分子中宿主动物IgM恒定区的基因 片段与人免疫球蛋白IgM基因或其片段， 以及与FRT、 人Ig内含子。 9.如权利要求1-8任一所述的核酸分子， 所述人免疫球蛋白基因或其片段敲除了人 IgHC 的CH2部分序列、 CH3、 CH4、 TM1和TM2序列以及其之间的序列和相关PolyA信

5、号序列。 10.如权利要求1-9任一所述的核酸分子， 所述人免疫球蛋白基因或其片段包括IgH的V 区基因、 D区基因、 J区基因。 11.如权利要求10所述的核酸分子， 所述人免疫球蛋白重链基因还包括hC、 hC 、 hC 和/或hC 重链基因和/或hLCR。 12.一种载体， 包含如权利要求1-11任意所述核酸分子。 13.一种细胞， 包含如权利要求1-11任意所述核酸分子或权利要求12所述载体。 14.一种人源化抗体， 由权利要求1-11任一核酸分子重排、 编码制得。 15.权利要求1-11任一所述核酸分子或权利要求12所述载体或权利要求13所述细胞在 制备人源化抗体中的应用。 16.权利

6、要求1-11任一所述核酸分子或权利要求12所述载体或权利要求13所述细胞在 制备转基因动物中的应用。 17.采用权利要求1-11任一所述核酸分子或权利要求12所述载体或权利要求13所述细 胞制备转基因动物的方法， 包括以下步骤： （1） 所述核酸分子的获得； （2） 将所述核酸分子构建入载体； （3） 向宿主细胞或胚胎导入含有所述核酸分子的载体； （4） 将含有人Ig的细胞植入宿主动物的胚胎内或体细胞克隆； （5） 繁育杂合、 纯合的转人Ig基因的动物。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105441455 A 2 一种嵌合核酸分子及其在人源化抗体制备中的应用 技术领域 0001 本发明属于生

7、物技术领域， 主要涉及一种核酸分子及其在人源化抗体制备中的应 用。 背景技术 0002 抗体是一类重要的生物医药制品， 在人类疾病的预防和治疗过程中发挥了重要的 作用。 治疗性抗体的发展经历了鼠源抗体、 嵌合抗体、 改型抗体、 表面重塑抗体和全人源化 抗体等不同的发展阶段。 0003 全人源化抗体(FullHumanizedAntibody)， 是指经过基因改造或转基因动物免 疫而获得的与人源抗体蛋白质序列完全一致的抗体。 全人源化抗体由于不含动物蛋白， 因 此副作用较低， 作用效果更好， 已成为当前和未来抗体工程的主要研究和发展方向。 目前全 人源化抗体主要由噬菌体展示技术和转基因动物技术生

8、产而来。 2002年， 第一个由噬菌体 展示技术生产的全人源化抗体Adalimumab(Humira)上市。 2006年， 第一个由转基因动物来 源的全人源化抗体Panitumumab在美国和欧洲批准上市。 0004 噬菌体展示抗体(PhageDisplay-generatingAntibody)技术生产全人源化抗体 相对简单， 技术相对成熟， 但受抗体库容量和抗体翻译后修饰及有效折叠的影响， 利用该技 术获得高亲合力抗体的难度很大。 0005 转基因动物全人源化抗体(TransgenicHumanizedAntibody)是指将人类免疫球 蛋白基因全部或部分通过转基因或转人工染色体技术， 转

9、移至动物基因组中动物内源的 抗体基因缺失(或失活)， 使动物表达人类抗体， 从而获得全人源化抗体。 利用转基因动物 生产全人源化抗体的最大优势是获得高亲合力抗体的机率较大， 同时利用一种转基因动物 品系可针对不同的抗原生产不同类型的抗体， 无需像噬菌体展示技术， 针对不同的抗原， 每 次都要重新构建噬菌体库。 但随着研究的深入， 发现转入的人类免疫球蛋白基因片段虽然 能在动物体内重排和表达， 但其产生人抗体蛋白的性能要低于未经基因改造前的动物自身 抗体生产效果。 以小鼠为例， 其原因主要是当抗体在B细胞发育的初级阶段作为B细胞表面 受体(BCR)时， 其与鼠源的信号蛋白Ig 和Ig 的相互作用

10、并不是最优的(即鼠源BCR与鼠源 的Ig 和Ig 或人BCR与人的Ig 和Ig 相互作用效果是最好的)， 因此影响了抗体的类型转 换、 亲和力成熟和B细胞发育为成熟的生产抗体的浆细胞。 为克服这一难题， Lee等(Nature biotechnology， 2014； 32(4)： 356-363)将三个人免疫球蛋白基因(IgH， Ig 和Ig )的可变区 替代小鼠的免疫球蛋白可变区， 而恒定区使用小鼠免疫球蛋白的相应片段， 利用这种策略 可克服上述提到的问题， 获得可变区为人源， 恒定区为鼠源的嵌合抗体， 再通过下游的改造 将鼠源的恒定区改造为人源的恒定区， 得到全人源化抗体。 这种方法存在

11、的缺点是需要进 行二次改造才能获得全人源化抗体。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种核酸分子， 可以高效的制备全人源化抗体， 其克服了 说明书 1/7 页 3 CN 105441455 A 3 不同物种BCR与Ig 和Ig 相互作用的不兼容性问题， 同时相对Lee的方法， 其表达的人源化 抗体无需进行二次改造。 0007 本发明的目的是通过以下措施实现的： 0008 本发明提供了一种核酸分子， 包括了人免疫球蛋白基因或其片段， 以及宿主动物 IgM恒定区的基因片段(即IgHC 的基因片段)。 0009 优选的， 上述宿主动物IgM恒定区的基因片段位于(替代)人免疫球蛋白IgM重链基

12、因的相应恒定区。 0010 上述宿主IgM恒定区基因片段为宿主动物IgHC 的CH2部分序列、 CH3、 CH4、 TM1和 TM2序列以及其之间的序列和相关PolyA信号序列。 人CH1序列与人Ig轻链结合， 保证抗体结 构， CH2部分区又保证人和小鼠C区正常转录和翻译。 当宿主为鼠时， 用于取代的鼠IgM恒定 区基因片段如SEQIDNO.1的所示； 被鼠源IgM恒定区基因片段替代的hIg序列 如SEQIDNO.2所示。 当宿主为猪时， 用于取代的猪IgM恒定区基因片段如SEQIDNO.3的所示， 被猪源IgM恒定区基因片段替代的hIg序列如SEQIDNO.4所示。 0011 上述核酸分子

13、中宿主动物IgM恒定区的基因片段的结构及其与人免疫球蛋白IgM 基因或其片段的连接结构如图1-1所示。 进一步地， 上述核酸分子还可以包括FRT序列、 人Ig 内含子序列(如hIgM、 hIgD)； 所述核酸分子中宿主动物IgM恒定区的基因片段与人免疫球蛋 白IgM基因或其片段， 以及与FRT、 人Ig内含子(如IgM、 IgD)的连接结构如图1-2所示。 当宿主 为鼠时， 所述FRT序列如SEQIDNO.1， 人Ig内含子序列包括SEQIDNO.1； 当宿主为猪时， FRT序列如SEQIDNO.3， 人Ig内含子序列 包括SEQIDNO.3。 0012 例如， 具体地， 人IgM的CH1和部

14、分CH2序列， 小鼠的CH2部分序列、 CH3、 CH4、 TM1和 TM2序列以及其之间的序列和相关PolyA信号序列， 与FRT、 IgD内含子、 人的IgHG3的调控区 (S3)和IgHG3CH1序列依次链接， 形成一个表达嵌合人小鼠IgM和人IgG的基因载体(如图 1-3)。 或者， 人IgM的CH1和部分CH2序列， 小鼠的CH2部分序列、 CH3、 CH4、 TM1和TM2序列以及 其之间的序列和相关PolyA信号序列， 与FRT、 IgM内含子、 人的IgD3的调控区(S 3)和IgD3 CH1序列链接， 形成一个表达嵌合人小鼠IgM和人IgD的基因载体(图1-4)。 0013

15、上述人免疫球蛋白基因包括了人免疫球蛋白重链基因的V区基因、 D区基因、 J区基 因。 上述人免疫球蛋白重链基因还可以包括hC、 hC 、 hC 和/或hC 重链基因和人的3 -调 控区(hLCR)等。 0014 例如， 上述核酸分子的基因簇如图2所示(黑框位置为导入的宿主动物的IgM恒定 区基因部分序列(片段)。 0015 通过以上的改造， 上述核酸分子在动物体内发育的早期阶段表达与宿主动物同源 的IgM， 该IgM作为BCR， 有利于与动物自身的Ig 和Ig 相互作用， 促进抗体的类型转换为 IgG、 亲和力成熟和B细胞发育。 0016 一种表达载体， 包含上述核酸分子。 一种细胞， 包含上

16、述核酸分子或上述载体。 一 种动物， 如猪、 鼠， 包含上述核酸分子。 一种人源化抗体， 由上述核酸分子重排、 编码制得。 上 述核酸分子或载体或细胞在制备人源化抗体中的应用。 上述核酸分子或载体或细胞在制备 转基因动物中的应用。 0017 将经过上述改造的人免疫球蛋白基因转入动物体内获得转人免疫球蛋白转基因 说明书 2/7 页 4 CN 105441455 A 4 动物， 或进一步与自身免疫球蛋白基因不表达的动物进行杂交获得只表达人抗体蛋白的基 因工程动物。 利用抗原免疫转入人免疫球蛋白基因(重链、 轻链)的动物， 获得全人源化抗 体。 例如： 0018 采用上述核酸分子或载体或细胞制备转基

17、因动物的方法， 包括以下步骤： 0019 (1)所述核酸分子的获得； 0020 (2)将所述核酸分子构建入载体； 0021 (3)向宿主细胞(包括干细胞， 诱导干细胞和体细胞)或胚胎导入含有所述核酸分 子的载体； 0022 (4)将含有人Ig的细胞植入宿主动物的胚胎内(嵌合体制备)或体细胞克隆； 0023 (5)繁育杂合、 纯合的转人Ig基因的动物。 (包括与宿主内源免疫球蛋白基因失活 的动物杂交)。 0024 上述宿主动物为哺乳动物， 如鼠、 兔、 猪、 牛、 羊、 鸡、 马等。 上述载体为人工染色体 (如酵母， 细菌)、 噬菌体、 质粒等。 上述载体导入宿主细胞的方法， 包括电穿孔、 病毒

18、感染、 脂 质体转染和显微注射等。 0025 本发明所述宿主动物的IgM恒定区的基因片段、 CH2部分序列是指编码可结合宿主 动物信号蛋白Ig 和/或Ig 的核苷酸序列。 0026 有益效果 0027 1.本发明生产的全人源化抗体具有高亲和力。 0028 2.本发明可利用一种转基因动物品系产生不同类型的各种抗体， 且本发明适用于 多种动物。 0029 3.本发明的宿主自身免疫球蛋白不表达或在检测限度以下。 0030 4.本发明基因重排效率高， VDJC重排、 突变和利用率与人体一致。 0031 5.本发明直接生产全人源化抗体， 不需进行二次改造， 体内表达量可达到健康成 人水平。 附图说明 0

19、032 图1-1改造后宿主动物IgM恒定区的基因片段的结构及其与人免疫球蛋白IgM恒定 区基因或其片段的连接结构。 0033 图1-2改造用的载体： 包括宿主动物IgM恒定区的基因片段与人免疫球蛋白IgM恒 定区基因或其片段， 以及与FRT、 筛选基因、 人Ig内含子(如IgM、 IgD)的等连接结构。 0034 图1-3基因改造后宿主动物IgM恒定区基因片段结构及其与人IgM基因片段连接结 构以及其与其它的人Ig， 如人IgG3基因或片段的连接结构 0035 图1-4基因改造后宿主动物IgM恒定区基因片段结构及其与人IgM基因片段连接结 构以及其与其它的人Ig， 如hlGD基因或片段的连接结

20、构 0036 图2实施例1的改造后人免疫球蛋白重链基因簇结构图 0037 图3实施例1人免疫球蛋白Kappa轻链基因簇结构图 0038 图4实施例1人免疫球蛋白lambda轻链基因簇结构图 0039 图5实施例1小鼠免疫球蛋白重链基因簇 0040 图6实施例1敲除小鼠免疫球蛋白重链基因的基因打靶 说明书 3/7 页 5 CN 105441455 A 5 0041 图7实施例1小鼠免疫球蛋白轻链基因簇 0042 图8实施例1敲除小鼠免疫球蛋白轻链基因的基因打靶 具体实施方式 0043 下面通过具体实施例对本发明进行具体描述， 在此指出以下实施例只用于对本发 明进行进一步说明， 不能理解为对本发明

21、保护范围的限制， 本领域的技术熟练人员可以根 据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。 0044 实施例1 0045 将改造的人免疫球蛋白基因转入小鼠体内， 再免疫含有人免疫球蛋白基因的小鼠 获得全人源化抗体， 具体步骤如下： 0046 1.人免疫球蛋白基因的优化改造 0047 1)人免疫球蛋白重链基因的改造 0048 将宿主动物IgM恒定区基因片段经同源重组转入含人Ig的YAC或BAC载体上， 构建 人免疫球蛋白重链基因的基因簇如图2所示(黑框位置为导入的鼠的IgM恒定区的基因片 段)。 包括了依次为人免疫球蛋白重链基因的V区、 D区、 J区， hIgHC 、 hIgHC3、 hI

22、gHC1、 hIgHC 1、 hLCR； 其中， hIgHC 经基因改造， 鼠源IgHC 的CH2部分序列、 CH3、 CH4、 TM1和TM2序 列以及其之间的序列和相关PolyA信号序列等(DNA序列为SEQIDNO.1)取代了部分原 hIgHC 和IgHC 的相应区域(DNA序列为SEQIDNO.2)， 其改造后的结构如图1-1和图1-3所 示。 0049 2)人免疫球蛋白Kappa轻链基因的改造 0050 人免疫球蛋白kappa轻链基因包括了人免疫球蛋白kappa轻链基因全部或部分V 区、 J区、 C区， 以及KDE区。 基因簇如图3所示。 0051 3)人免疫球蛋白lambda轻链基

23、因的改造 0052 人免疫球蛋白lambda轻链基因包括了人免疫球蛋白lambda轻链基因全部或部分V 区、 J区和C区， 同时包括末端的增强子结构。 基因簇如图4所示。 0053 2.人源化抗体转基因小鼠的培育 0054 1)转人免疫球蛋白重链基因小鼠的培育 0055 利用已有的常规转基因技术将步骤1的1)中构建的人免疫球蛋白重链基因转入小 鼠体内。 通过PCR检测和ELISA检测双标准筛选获得的转人免疫球蛋白重链转基因小鼠。 0056 使用的PCR鉴定引物为： 0057 PCR1 0058 For： TGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTC 0059 Rev： TTGCTTAACT

24、CCACACCTGCTCCTG 0060 PCRproductsize： 329bp 0061 PCR2 0062 For： TTGAGGAGACTGTCCATCCTTCAC 0063 Rev： GAGAGGGCATCTTGGTCTTCTTTC 0064 PCRproductsize： 471bp 0065 使用的ELISA鉴定的抗体为： sigma(I1886)和sigma(A8792)， 以健康成年人和健康 说明书 4/7 页 6 CN 105441455 A 6 小鼠血清作为对照。 0066 2)转人免疫球蛋白kappa轻链基因小鼠的培育 0067 利用已有的常规转基因技术将步骤1的2)

25、中构建的人免疫球蛋白kappa轻链基因 转入小鼠体内。 通过PCR检测和ELISA检测双标准筛选获得的转人免疫球蛋白kappa轻链转 基因小鼠。 0068 使用的PCR鉴定引物为： 0069 PCR1： 0070 FOR： TGCTCTGACCTCTGAGGACCTGTCTGTA 0071 Rev： TTCAGGCAGGCTCTTACCAGGACTCA 0072 PCRproductsize： 616bp 0073 PCR2： 0074 For： CACCCAAGGGCAGAACTTTGTTACT 0075 Rev： GAGGAAAGAGAGAAACCACAGGTGC 0076 PCRprod

26、uctsize： 596bp 0077 使用的ELISA鉴定的抗体为： sigma(K3502)和sigma(A7164)， 以健康成年人和健康 小鼠血清作为对照。 0078 3)转人免疫球蛋白lambda轻链基因小鼠的培育 0079 利用已有的常规转基因技术将步骤1的3)中构建的人免疫球蛋白lambda轻链基因 转入小鼠体内。 通过PCR检测和ELISA检测双标准筛选获得的转人免疫球蛋白lambda轻链转 基因小鼠。 0080 使用的PCR鉴定引物为： 0081 PCR1： 0082 For： AGCACAATGCTGAGGATGTTGCTCC 0083 Rev： ACTGACCCTGATC

27、CTGACCCTACTGC 0084 PCRproductsize： 562bp 0085 PCR2： 0086 FOR： CTCTGCTGCTCCTCACCCTCCTCACTCAGG 0087 REV： GAGAGTGCTGCTGCTTGTATATGAGCTGCA 0088 PCRproductsize： 462bp 0089 使用的ELISA鉴定的抗体为： sigma(L1645)和sigma(A5175)， 以健康成年人和健康 小鼠血清作为对照。 0090 4)免疫球蛋白重链基因敲除小鼠的培育(图5、 图6) 0091 利用Crispr/Cas9技术， 构建免疫球蛋白重链基因敲除小鼠。

28、选择小鼠免疫球蛋白 重链基因的IgHC 作为基因敲除位点(敲除位点及基因敲除效果见图6)， 获得免疫球蛋白重 链基因敲除小鼠。 通过PCR检测和ELISA检测双标准筛选获得的免疫球蛋白重链基因敲除小 鼠。 0092 使用的PCR鉴定引物为： 0093 For： AGCACCATTTCCTTCACCTGGAAC 0094 Rev： CAAGGAGCAAATGACCATGTCTGG 说明书 5/7 页 7 CN 105441455 A 7 0095 PCR产物： 760bp。 然后用BstEII酶切， 基因打靶的是753bp， 没有基因打靶的是 500bp和260bp的两条带。 0096 使用的E

29、LISA鉴定的抗体为： sigma(M8644)和sigma(A8786)， 以健康成年人和健康 小鼠血清作为对照。 0097 5)免疫球蛋白kappa轻链基因敲除小鼠的培育(图7、 图8) 0098 利用常规基因敲除技术， 敲除小鼠免疫球蛋白kappa轻链基因的整个恒定区(C 区)， 获得免疫球蛋白kappa轻链基因敲除小鼠。 通过PCR检测和ELISA检测双标准筛选获得 的小鼠免疫球蛋白kappa轻链基因敲除小鼠。 0099 使用的PCR鉴定引物为： 0100 PCR1： 0101 For： CCCTTCCCTAGCCAAAGGCAACTA 0102 Rev： CACAACGGGTTCTT

30、CTGTTAGTCC 0103 PCRproductsize： 466 0104 PCR2： 0105 For： CACACCTCCCCCTGAACCTGAAAC 0106 Rev： GTTGTGGGTAGTGCCCAGCCTTGC 0107 PCRproductsize： 464bp 0108 使用的ELISA鉴定的抗体为： SouthernBiotech(1170-01)和SouthernBiotech (1170-05， 以健康成年人和健康小鼠血清作为对照。 0109 6)杂交组合获得人源化抗体转基因小鼠 0110 将第二步1)， 2)， 3)， 4)， 5)步获得的小鼠进行杂交繁育，

31、经过PCR和ELISA检测， 最 终获得高表达人免疫球蛋白， 而不表达(或低表达)鼠免疫球蛋白的人源化抗体转基因小鼠 用于下一步的研究。 0111 3.全人源化抗体的获得 0112 1)OVA免疫第2步6)获得的人源化抗体转基因小鼠 0113 选择8周龄的小鼠进行免疫。 0114 初免： 0115 用PBS稀释OVA(SigmaA7641)抗原， 终浓度为5mg/ml， 加入50ugCpG(ODN1826， tlrl-1826， Invivogen)， 加入适量氢氧化铝(vac-alu-50， Invivogen)， 使氢氧化铝浓度为 1。 0116 将中准备好的抗原0.75mL与CFA佐剂(

32、SigmaF5881)按11混合， 用MIXPACTM注 射器使之乳化， 每只小鼠， 注射剂量为200ul(0.5mg)， 进行皮下注射免疫。 0117 二免： 0118 初免后第16天进行二免， 用PBS稀释抗原， 终浓度为2.5mg/ml， 加入25ugCpG， 加 入适量氢氧化铝， 使氢氧化铝浓度为1。 0119 将中准备好的抗原0.75mL与IFA佐剂按11混合， 用MIXPACTM注射器使之乳化， 每只小鼠注射剂量为200ul(0.25mg)， 进行腹腔注射免疫。 0120 三免： 0121 二免第16天后进行三免， 用PBS稀释抗原， 终浓度为1.25mg/ml， 加入12.5ug

33、 说明书 6/7 页 8 CN 105441455 A 8 CpG， 加入适量氢氧化铝， 使氢氧化铝浓度为1。 0122 直接注射抗原蛋白， 按中方法配制， 每只小鼠注射剂量为200ul(0.25mg)进行 腹腔注射免疫。 0123 2)小鼠抗体检测 0124 第3次免疫后10天， 分别取编号为3554， 3555， 3556号小鼠取血进行ELISA检测， 以 健康成年人和野生型小鼠作为对照， 分别检测免疫后小鼠血清中鼠IgG的含量和人IgG的含 量， 结果如下： 0125 小鼠IgG的含量检测 0126 使用试剂盒为小鼠IgGELISA试剂盒(Abcam， ab157719) 0127 35

34、54： 检测限度以下 0128 3555： 检测限度以下 0129 3556： 检测限度以下 0130 健康成年人： 检测限度以下 0131 野生型小鼠： 0.7mg/ml 0132 结果显示： 免疫后的人源化抗体小鼠的鼠源IgG表达量极低。 0133 小鼠血清中人IgG的检测 0134 使用试剂盒为人IgGELISA试剂盒(Abcam， ab100547) 0135 3554： 10.3mg/ml 0136 3555： 8.1mg/ml 0137 3556： 8.2mg/ml 0138 健康成年人： 10.2mg/ml 0139 野生型小鼠： 0.1ng/ml 0140 结果显示： 免疫后的

35、人源化抗体小鼠的人源IgG表达量较高。 0141 OVA抗体亲和力测定 0142 选取3556号小鼠， 将其脾细胞和杂交瘤细胞融合， 筛选单克隆抗体， ELISA筛选表 达量最高的3个细胞克隆， 利用竞争性ELISA检测法(CEB459Ge， Cloud-CloneCorp)进行抗 OVA抗体亲和力检测， 结果显示最高亲和力的抗体为230pM。 0143 本发明对人免疫球蛋白基因的改造方案， 在其它哺乳动物中同样适用， 例如， 猪等 哺乳动物作为宿主动物同样可实现本发明所述全人源化抗体表达的有益效果。 说明书 7/7 页 9 CN 105441455 A 9 0001 序列表 1/20 页 1

36、0 CN 105441455 A 10 0002 序列表 2/20 页 11 CN 105441455 A 11 0003 序列表 3/20 页 12 CN 105441455 A 12 0004 序列表 4/20 页 13 CN 105441455 A 13 0005 序列表 5/20 页 14 CN 105441455 A 14 0006 序列表 6/20 页 15 CN 105441455 A 15 0007 序列表 7/20 页 16 CN 105441455 A 16 0008 序列表 8/20 页 17 CN 105441455 A 17 0009 序列表 9/20 页 18 CN

37、 105441455 A 18 0010 序列表 10/20 页 19 CN 105441455 A 19 0011 序列表 11/20 页 20 CN 105441455 A 20 0012 序列表 12/20 页 21 CN 105441455 A 21 0013 序列表 13/20 页 22 CN 105441455 A 22 0014 序列表 14/20 页 23 CN 105441455 A 23 0015 序列表 15/20 页 24 CN 105441455 A 24 0016 序列表 16/20 页 25 CN 105441455 A 25 0017 序列表 17/20 页 26 CN 105441455 A 26 0018 序列表 18/20 页 27 CN 105441455 A 27 0019 序列表 19/20 页 28 CN 105441455 A 28 0020 序列表 20/20 页 29 CN 105441455 A 29 图1-1 图1-2 图1-3 图1-4 图2 图3 说明书附图 1/2 页 30 CN 105441455 A 30 图4 图5 图6 图7 图8 说明书附图 2/2 页 31 CN 105441455 A 31