技术领域
本发明涉及生物检测技术，具体涉及一种用于检测Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的PCR引物对、探针和试剂盒。
背景技术
Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒（Porcine Lymphotropic herpesviruses 3 ,PLHV3）属于疱疹病毒科γ疱疹病毒属。可以感染猪的一种传染病，通过异体移植猪的细胞、组织和器官可能将这种病毒传染给人。猪嗜淋巴疱疹病有三个亚型，分别为PLHV-1、PLHV-2和PLHV-3。PLHV-1和PLHV-2由EhLers等人于1999年发现，PHLV-3由ChmieLewicz于2003年发现。目前对该病毒的流行病学尚知甚少。作为嗜淋巴病毒成员，在血液的外周血细胞、淋巴结、脾脏和扁桃体等组织经常可检测到PLHV序列片段。猪是人类器官移植的动物代替源中最有发展前景的供体，已有猪源器官成功移植入人体的先例。但猪也是各类病毒的携带者，从猪体内发现过多种可以感染人的病毒，但这些病毒在猪体内并不发病，不容易被人类所认识，只有通过不断的试验和验证，才能确保猪源器官的安全性。已经确认Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒可以通过移植猪的细胞、组织和器官传染给人，可能导致接受移植的人体内发生病症。如何对供移植的猪器官和组织在移植前进行猪嗜淋巴疱疹病毒检测，从而从源头确保移植器官和组织的安全性，是一个具有现实的临床医学和经济研究价值的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明公开一种能准确、快速检测Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的引物对。
本发明的另一目的是提供一种与上述引物对配合使用的荧光探针。
本发明的第三个目的是提供检测Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的检测试剂、试剂盒及其反应体系。
本发明的第一个目的通过以下技术方案实现：一种用于检测Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的PCR引物对，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二个目的通过以下技术方案实现：一种与上述引物对配合使用的荧光探针，其序列为PLHV3 D P1如EQ ID NO.3所示；所述探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。
所述荧光报告基团为FAM、VIC中的任意一种；所述荧光淬灭基团为TAMRA、Eclipse中的任意一种。
本发明中，所述探针为TaqMan探针。
本发明通过NCBI数据库中获得与Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒标准株(GeneBankNo.AY170316) 的所有同源基因序列，并采用MegAlign软件筛选出PLHV3 DNA聚合酶基因（GeneBankNo.AAO12315.1）中一段高度保守序列（如SEQ ID NO.3所示），并以之作为模板，用primer Express3.0 软件，设计出引物及TaqMan 探针。
本发明所述检测PLHV3的引物对并不像常规的基因引物设计一样，只要以PLHV3的基因组序列为基础，采用本领域熟知的引物设计软件设计引物，并通过合乎逻辑的分析、推理和有限的试验，就能够获得特异性强的检测引物。因为PLHV3的基因组序列不太保守，与PLHV1和PLHV2只有66%的氨基酸序列同源性。虽有报道PLHV1与PLHV2间的DNA聚合酶（DPOL）的编码基因较为保守，但二者间仍存在50个碱基对的差异。与上述二者相比，PLHV-3的DPOL编码基因更存在245个碱基对的差异因此，设计能特异性检测PLHV-3的引物是非常困难的，这也是现有技术一直无法解决的困难，本发明通过通过对III型病毒标准株的DPOL基因与Ⅰ型和Ⅱ型的同源基因序列进行对比（Ⅰ型的GeneBankNo.AY177148和AF478169，Ⅱ型的GeneBankNo.AF191043、AY170314和AY170317），筛选出在如SEQ ID NO.4所示的PLHV3中存在的保守序列——PLHV3 DPOL编码基因中一段高度保守的17个碱基对的序列PLHV3 DPOL基因保守片段，进而设计出一对能特异性检测PLHV3的特异性引物。
PLHV3的引物设计比较复杂，且对引物扩增去的要求较高。所以本发明的引物设计没有普通引物设计那么简单，要设计出优良的引物，需要在各种生物信息软件评估的基础上进行费时的筛选。由于所设计的引物具有高度的选择特异性，在进行对PLHV3的检测时，要求引物所针对的靶序列位点应当相当保守，这样所建立的反应体系才具有普遍的适用性。研究中也可以设计一些兼并引物以增强应用的广泛性，但兼并度过高的引物会对扩增造成负面影响。发明人在研究中发现，本发明中靶序列的长度应当控制在210bp左右，才有利于扩增反应的进行，过长会给反应起始物的形成与后期循环反应带来困难，有时甚至在1 h 内没有明显扩增。对于一些具有GC 含量高、变异性强、保守区离散等特点的目的序列，没有办法设计出非常适用的引物，使PCR技术的应用受到限制。
通过不断的试验优化，分别在反应体系和反应条件两方面进行摸索，以期得到最佳的试剂浓度和反应温度。反应体系方面：针对Mg2+浓度、引物使用浓度和探针的使用浓度进行反复试验，分别对相关试剂进行倍比稀释，得到其在体系中的最佳使用浓度。比如Mg2+ 对于稳定碱基配对，维持聚合酶的反应活性都有重要作用，它对PCR 的影响方式与LAMP相似，浓度太高或太低都使反应无法进行或时间延长同时反应过程中焦磷酸镁沉淀的析出使反应体系中Mg2+ 的浓度不断下降，因此摸索Mg2+ 最佳浓度很有意义。经过多次试验筛选，本发明的PCR 反应体系中Mg2+ 浓度优选1.0-1.8mM，最佳为1.5mM。反应条件方面，参考相关方法的反应温度和时间，进行多次调整，确定合适的反应条件。并在实验过程中，对重复性、灵敏性、特异性进行了摸索和验证。
本发明同时提供一种上述引物对和荧光探针在制备Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的检测试剂盒或诊断试剂盒中的应用。
具体的，上述应用是将纯水13.8μL，10×PCR反应缓冲液2μL，25mM镁离子1.2μL（一般用MgCL2），25mM dNTPs混合溶液（包括等比例的dATPs、dTTPs、dGTPs、dCTPs） 0.5μL，10μM PLHV3 D F1 0.5μL，10μM PLHV3 D R1 0.5μL，20μM Taqman 荧光探针0.3μL，5 u /μL的Taq酶 0.2μL，待测样品DNA模板1μL构成20μL的检测反应体系。
具体的，上述应用中试剂盒工作条件为95℃，2min ；95℃，10s ；60℃，40s，共做40 个循环，然后终止。
本发明的第三个目的通过一下技术方案实现：一种Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的诊断试剂，其含有上述的引物及荧光探针。
本发明还提供一种Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的检测试剂盒，其上述的引物及荧光探针。
进一步的，所述检测试剂盒其20μL反应体系的具体配置为纯水13.8μL，10×PCR反应缓冲液2μL，25mM镁离子1.2μL，25mM dNTPs混合溶液 0.5μL，10μM PLHV3 D F1 0.5μL，10μM PLHV3 D R1 0.5μL，20μM PLHV3 D P1 0.3μL，5 u /μL的Taq酶 0.2μL，待测样品DNA模板1μL。
具体的，其工作条件为95℃，2min ；95℃，10s ；60℃，40s，共做40 个循环，然后终止。
本发明中，当探针完整的时候，5’端报告基因所发射的荧光能量被3’端淬灭基团吸收，仪器检测不到荧光信号；随着实时荧光定量PCR 的进行，Taq 酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’→ 3’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团游离出探针，游离的报告基团远离淬灭基团，激发的能量不能被吸收，故发出的荧光信号被仪器检测到，每个循环接收采集数据，故每经过一个PCR 循环，荧光信号随着目的片段的延伸有一个同步指数增长的过程，反应结束后根据扩增曲线判定结果，从而实现对Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的检测和定量。
此外还可以利用上述引物对对样品进行PCR扩增，再对反应产物进行电泳，如果电泳在170bp处出现条带，则检测结果为阳性。
本发明更提供一种采用所述试剂盒检测供移植猪组织或器官的方法，包括如下步骤：a.从待移植的猪组织或器官内提取其总DNA；b.采用权利要求5所述的试剂盒，以总DNA为模板进行实时荧光定量PCR 反应，每个循环结束后采集数据，反应结束后根据扩增曲线和标准曲线判定结果。
PLHV3在活猪的体内并不表达，但移植至人体后，则容易发病。当采用本发明对待移植的猪组织或器官中PLHV3检测结果为阳性时，应当杜绝采用该受感染的组织或器官进行器官移植手术。
本发明针对PLHV3的基因中保守区域设计特异性探针和扩增引物。通过实验室条件优化，建立了针对PLHV3的简便、准确、快速的检测体系以及以该体系为基础构建的灵敏度高、特异性强的检测试剂盒。与现有技术相比，本发明主要具有如下优点：
1.高特异性：采用本发明提供的PCR反应体系对感染PLHV3的活猪组织总DNA 为模板，以其他常见存在于活猪体内的DNA病毒为对照，通过实时荧光定量PCR 检测荧光强度变化，结果显示，从患病组织提取的DNA为模板，通过实时荧光定量PCR 检测可观察到明显的荧光强度变化和很好的阳性扩增结果，而其他种类病毒提取的DNA模板荧光强度没有变化。
2.灵敏度高：扩增模板可达8.2拷贝，比常规PCR 法高1 至3 个数量级，能够精确地检测出样品中的PLHV3，防止感染样品被用于人体治疗。
3.反应时间较短、测试效率高：本发明中每个循环的周期为40S，低于一般PCR的反应周期，从而促进测试效率的提高。
4.应用范围广：本发明所提供的PLHV3特异性引物及探针，可在现有的设备下完成对样品的检测；同时本发明所提供的特异性引物所扩增的目的基因亦可采用普通的凝胶电泳进行检测，这些都使该技术在小型研究所、兽医站乃至普通养殖户有着更广阔的应用前景。
本发明引物和探针特异性好，制备成试剂盒用于Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的检测灵敏度、准确性高和特异性强；本发明检测方法可以快速检测出样品是否含有Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒，并能准确测定样品中Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的拷贝数含量。
附图说明
图1 为实施例3 中实时荧光定量PCR 检测Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的标准曲线；
图2 为实施例4 中实时荧光定量PCR 检测Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的结果；
其中，1 为样品中Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的实时荧光定量PCR 扩增结果，2 为猪伪狂犬病毒的实时荧光定量PCR 扩增结果，3 为猪2型圆环病毒的实时荧光定量PCR 扩增结果；
图3 为实施例5 中实时荧光定量PCR 检测Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的灵敏度实验；
其中，1 表示Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的量为8.2×104 拷贝/μL，2 表示Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的量为8.2×103 拷贝/μL，3 表示Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的量为8.2×102 拷贝/μL，4表示Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的量为8.2×101 拷贝/μL，5 表示Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的量为8.2拷贝/μL，6 为阴性对照。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员理解，下面将结合附图以及实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1引物及探针的设计和合成
从GenBank 下载Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒所有同源基因序列，引物和探针由Invitrogen公司合成。将型猪嗜淋巴疱疹病毒标准株(GeneBankNo.AY170315) 的序列与其同源序列与Ⅰ型和Ⅱ型的同源基因序列进行对比（Ⅰ型的GeneBankNo.AY177148和AF478169，Ⅱ型的GeneBankNo.AF191043、AY170314和AY170317），用MEGA软件进行同源性比对，用primer Express3.0 软件，设计出引物及TaqMan 探针，
扩增目的片段长度为170bp。
上游引物核苷酸序列如PLHV3 D F1所示；
下游引物核苷酸序列如PLHV3 D R1 所示；
与上述引物配合使用的探针的核苷酸序列如PLHV3 D P1 所示。该探针5’端标记有报告FAM 荧光染料，另3’端标记有淬灭TAMRA 荧光染料。
实施例2 总DNA 的提取步骤如下：
加等量的抗凝血缓冲液或是用抗凝血采血管采集猪血样3～5Ml,混匀，2～8℃保存3天。将血样5000r/min离心5min，去掉上清液，吸取红细胞上层的白细胞，移入无污染或无生物毒性的离心管备用。按北京天根生物科技公司病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（DP315）使用说明提取病毒DNA（本试验提取DNA只是基于DP315试剂盒，其它商品化的病毒DNA提取试剂盒均适用），直接使用或于-20℃冰箱保存备用。
实施例3 实时荧光定量PCR 扩增方法的建立
1、实时荧光定量PCR 反应体系
以总DNA 为模板，进行实时荧光定量PCR 反应，即在20μL 反应体系中含：10× 荧光定量PCR 缓冲液2μL，0.5μL dNTPs(25mmol/L)，0.5μL引物PLHV3 D F1 (10umol/L)，0.5μL 引物PLHV3 D R1 (10umol/L)，1.2μL 镁离子(25mmol/L)，0.3μL 荧光探针(20umol/L)， 1μL DNA模板，0.2μL Taq 酶(5U)，并用DEPC 处理水补充到20μL。
2、实时荧光定量PCR 反应条件
将样品管放入ABI 公司7500 荧光PCR 仪后，设置如下条件进行：95℃，2min ；90℃，10s ；60℃，40s 共做40 个循环。每个循环结束后采集数据。反应结束后根据扩增曲线和标准曲线判定结果。
3. 实时荧光定量PCR 标准曲线的建立将Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒116bp 基因片段克隆到PCR2.1-TOPO 载体中构建成阳性质粒，调整质粒至1×1010 拷贝/μL。然后以10 倍系列稀释的阳性质粒为定量阳性标准模板，建立Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的实时荧光定量PCR 反应。结果显示在8.2～8.2×104 拷贝范围内Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒检测的标准曲线有很好的线性关系( 图1)。
实施例4 Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒实时荧光定量PCR 方法的特异性确定
以污染病毒的活猪组织总DNA 为模板，以猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒为对照，通过实时荧光定量PCR 检测荧光强度变化。结果显示，从阳性质粒提取的DNA为模板，通过实时荧光定量PCR 检测可观察到明显的荧光强度变化和很好的阳性扩增结果，而猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒提取的DNA模板荧光强度没有变化。提示本发明所建立的实时荧光定量PCR 体系对Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒有很好的特异性( 图2)。
实施例5 灵敏度实验
用DEPC 处理水分别稀释Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒阳性模板，通过实时荧光定量PCR 检测荧光强度变化。实验结果显示，实时荧光定量PCR 检测可观察到明显的荧光强度变化和很好的阳性扩增结果，实时荧光定量PCR 动力学曲线显示，浓度在8.2拷贝以上的反应体系有明显的荧光增长，而低于8.2拷贝和阴性对照均无荧光增长，因此该实时荧光定量PCR 检测体系的最低检出限为8.2 拷贝，即其灵敏度为8.2拷贝/μL( 图3)。
实施例6一种Ⅲ型猪嗜淋巴疱疹病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒
所述试剂盒由以下试剂组成：纯水，10×PCR反应缓冲液，25mM镁离子，25mM dNTPs混合溶液，10μM PLHV3 D F1，10μM PLHV3 D R1，20μM PLHV3 D P1，5 u /μL的Taq酶。所述PCR缓冲液可以是任一种市售的荧光定量PCR反应缓冲液，每一种试剂都独立分装在试剂瓶中，和使用说明书一起封装在试剂盒内。
试剂盒的荧光定量PCR其20μL反应体系的具体配置为纯水13.8μL，10×PCR反应缓冲液2μL，25mM镁离子1.2μL，25mM dNTPs混合溶液 0.5μL，10μM PLHV3 D F1 0.5μL，10μM PLHV3 D R1 0.5μL，20μM PLHV3 D P1 0.3μL，5 u /μL的Taq酶 0.2μL，待测样品DNA模板1μL。
其反应条件为：95℃，2min ；95℃，10s ；60℃，40s，共做40 个循环，然后终止。
以上为本发明的其中具体实现方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些显而易见的替换形式均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 惠州出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心
<120> 一种用于检测Ⅲ型猪嗜淋巴泡疹病毒的PCR引物对、探针和试剂盒
<130> 2013
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> PLHV3 D F1
<400> 1
ttatcaattt ccctcagagc tt 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> PLHV3 D R1
<400> 2
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<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> PLHV3 D P1
<400> 3
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<210> 4
<211> 170
<212> DNA
<213> Ⅲ型猪嗜淋巴泡疹病毒DPOL基因保守片段
<400> 4
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