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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510948562.3 (22)申请日 2015.12.17 C12N 15/82(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12N 1/13(2006.01) C12R 1/89(2006.01) (71)申请人 新乡医学院 地址 453003 河南省新乡市金穗大道 601 号 (72)发明人 贾岩龙 高利洁 崔柳苏 郜惠苹 郭潇 王喜成 邱乐乐 武俊芳 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 (54) 发明名称 盐藻的光调控基因表达载体及其制备方法与 应用 (57) 摘。
2、要 本发明涉及光调控基因表达载体， 具体公开 了一种适用于盐藻的光调控基因表达载体及其应 用。所述载体包括两个基因表达盒 ： 1) 光敏转录 因子 GAVPO 表达盒 ： 包括盐藻肌动蛋白启动子、 光 敏转录因子 GAVPO ； 2) 受光敏转录因子 GAVPO 调 控的目的基因表达盒。本发明进一步提供了所述 光调控基因表达载体在盐藻中通过光调控表达目 的基因的应用， 转染了所述光调控基因表达载体 的盐藻细胞可通过蓝光有效调控目的基因的表 达， 且表达效率高。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表4页 附图5页 。
3、CN 105441476 A 2016.03.30 CN 105441476 A 1.一种用于盐藻的光调控基因表达载体， 其特征在于， 所述载体包括两个基因表达盒： 1)光敏转录因子GAVPO表达盒： 包括盐藻肌动蛋白启动子和光敏转录因子GAVPO； 2)受光敏转录因子GAVPO调控的目的基因表达盒。 2.根据权利要求1所述的光调控基因表达载体， 其特征在于， 所述载体包括依次连接的 光敏转录因子GAVPO-盐藻肌动蛋白启动子-5 UAS转录元件-目的基因。 3.根据权利要求1或2所述的光调控基因表达载体， 其特征在于， 其制备方法包括如下 步骤： S1、 扩增光敏转录因子GAVPO表达盒： 。
4、S11、 以盐藻肌动蛋白(actin)启动子序列为模板， 扩增启动子序列并回收纯化； 以 pGAVPO质粒为模板， 扩增GAVPO序列并回收纯化； S12、 以S11获得的两段序列为模板， 利用PCR扩增获得含有盐藻肌动蛋白启动子序列和 光敏转录因子GAVPO的光敏转录因子GAVPO表达盒； S2、 构建中间载体： 将pU5-Cre载体酶切成线性pU5-Cre载体片段后， 与目的基因进行连接， 获得中间载体； S3、 构建光调控基因表达载体： 将中间载体酶切成线性中间载体后， 与S12获得的光敏转录因子GAVPO表达盒进行连 接， 获得光调控基因表达载体。 4.根据权利要求3所述的光调控基因表。
5、达载体， 其特征在于， S2具体为： 在目的基因的 两端引入NheI和BamHI酶切位点， 并使用NheI和BamHI对pU5-Cre载体进行双酶切， 回收 纯化酶切后获得的线性pU5-Cre载体片段， 与引入酶切位点的目的基因进行连接、 转化、 筛 选重组子并提取质粒， 进行酶切鉴定和测序验证是否成功构建中间载体。 5.根据权利要求3所述的光调控基因表达载体， 其特征在于， S3具体为： 在GAVPO表达盒 基因的两端引入NotI和NruI酶切位点， 并使用NotI和NruI对中间载体进行双酶切， 回 收纯化酶切后的GAVPO表达盒基因DNA片段和线性中间载体， 进行连接、 转化、 筛选重组。
6、子并 提取质粒， 通过酶切鉴定和测序验证是否成功构建光调控基因表达载体。 6.含有权利要求15所述的光调控基因表达载体的盐藻。 7.权利要求15所述的光调控基因表达载体在盐藻中通过光调控表达目的基因的应 用。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 将所述光调控基因表达载体通过玻璃珠法 介导导入盐藻细胞中， 转化的盐藻细胞可通过蓝光照射调控实现目的基因表达的开启和关 闭。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105441476 A 2 盐藻的光调控基因表达载体及其制备方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及光调控基因表达载体， 具体地说， 涉及一种适用于盐藻的光调控基因 表达载体。 背景。
7、技术 0002 基因表达系统主要分为组成型和诱导型两种， 前一种用于基因表达是持续表达无 法进行调控的， 而诱导型基因表达系统可以精确控制基因表达的开启/关闭。 目前已有多种 化学物质诱导的基因表达系统， 然而这些表达系统无法特异性地针对专一细胞或组织进行 调控， 且存在不可避免的潜在毒性。 WangXue等开发了一种光调控的基因表达系统-LighOn 系统(WangX， ChengX， YangY.Spatiotemporalcontrolofgeneexpressionbya light-switchabletransgenesystem.NatrueMethods， 2012， 9(3)。
8、:266-269)。 该系统含 有两个表达载体， 通过共转染哺乳动物细胞后利用可见光-蓝光激活目的基因的表达。 这一 过程无需加入对环境有污染的诱导剂， 同时也避免了潜在的毒性。 更为重要的是， 利用光可 以特异性地从时间和空间上调控基因的表达。 这为重组基因的表达应用和基因治疗等方面 提供了一种非常有利的工具。 0003 公开号为CN103509755A的中国专利申请公开了一种胶质瘤细胞系， 所述胶质瘤细 胞系为感染了病毒载体的胶质瘤细胞； 所述病毒载体中包括依次连接的ITR、 启动子、 光敏 基因、 绿色荧光标记基因和ITR。 所述细胞系虽可通过光进行选择性特异调控， 但由于其构 建的为病。
9、毒载体， 主要通过光的诱导刺激使细胞发生凋亡和存活率下降， 属于基因治疗的 范畴， 不能在真核细胞中用于重组基因的表达调控。 0004 杜氏盐藻(Dunaliellasalina， 以下简称盐藻)是一种无细胞壁的单细胞真核绿 藻， 其自身无毒无害且培养条件简单， 便于进行遗传改造， 因此用其作为转基因的宿主已被 开发作为一种新型的生物反应器用于重组蛋白的表达(XueL， PanW， JiangG， Wang J.TransgenicDunaliellasalinaasabioceactor， 美国专利号： 7081567)。 盐藻反应器 较之转基因动物、 植物和细菌等反应器用于基因表达， 具有。
10、成本低、 高效低廉的特点， 为大 规模生产外源性蛋白提供了优越的条件保证。 0005 近年来， 盐藻作为生物反应器用于基因表达已取得了一些研究成果。 冯书营等构 建了pU-Can-Bar载体在盐藻中表达了人canstatin基因并能在转化藻株中稳定遗传； 用玻 璃珠转化法将质粒pBI221-bar转入盐藻细胞中， 实现了外源报告基因GUS的有效表达。 李杰 等构建了盐藻表达载体DCA1-bar(D-B)， 在内源性双拷贝碳酸酐酶启动子DCA1启动子驱动 下， 报告基因bar的表达强度明显高于在外源性启动子驱动下bar的表达。 这些研究工作表 明， 盐藻能够作为宿主用于外源基因的表达。 0006。
11、 但是， 外源基因的表达效率不高， 且无法对表达进行调控等问题仍是制约盐藻作 为宿主用于外源基因高效表达的主要瓶颈。 发明内容 说明书 1/5 页 3 CN 105441476 A 3 0007 为了解决现有技术中存在的问题， 本发明的目的是提供一种适用于盐藻的光调控 基因表达载体。 0008 为了实现本发明目的， 本发明的技术方案如下： 0009 第一方面， 本发明提供一种用于盐藻的光调控基因表达载体， 所述载体包括两个 基因表达盒： 0010 1)光敏转录因子GAVPO表达盒： 包括盐藻肌动蛋白启动子(GenBankNo.AF541875) 和光敏转录因子GAVPO； 0011 2)受光敏。
12、转录因子GAVPO调控的目的基因表达盒。 0012 所述目的基因表达盒由5 UAS转录元件驱动目的基因的表达。 0013 其中， 所述光敏转录因子GAVPO来自pGAVPO质粒， 所述pGAVPO质粒由华东理工大学 杨弋教授惠赠。 0014 所述光敏转录因子GAVPO的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。 0015 所述5 UAS转录元件的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。 0016 更为具体的， 为了更好的实现光调控目的基因表达的功能， 所述载体包括依次连 接的光敏转录因子GAVPO-盐藻肌动蛋白启动子-5 UAS转录元件-目的基因。 0017 进一步地， 所述光调控基因表达载体的制备方法。
13、包括如下步骤： 0018 S1、 扩增光敏转录因子GAVPO表达盒： 0019 S11、 以盐藻肌动蛋白(actin)启动子(No.AF541875)序列为模板， 扩增启动子序列 并回收纯化； 以pGAVPO质粒为模板， 扩增GAVPO序列(含有SV40polyA)并回收纯化； 0020 S12、 以S11获得的两段序列为模板， 利用PCR扩增获得含有盐藻肌动蛋白启动子序 列和光敏转录因子GAVPO的光敏转录因子GAVPO表达盒； 0021 S2、 构建中间载体： 0022 将pU5-Cre载体酶切成线性pU5-Cre载体片段后， 与目的基因进行连接， 获得中间 载体； 0023 S3、 构建。
14、光调控基因表达载体： 0024 将中间载体酶切成线性中间载体后， 与S12获得的光敏转录因子GAVPO表达盒进行 连接， 获得光调控基因表达载体。 0025 其中， pU5-Cre载体由华东理工大学杨弋教授惠赠。 0026 更进一步地， S2具体为： 在目的基因的两端引入NheI和BamHI酶切位点， 并使用 NheI和BamHI对pU5-Cre载体进行双酶切， 回收纯化酶切后获得的线性pU5-Cre载体片段， 与引入酶切位点的目的基因进行连接、 转化、 筛选重组子并提取质粒， 进行酶切鉴定和测序 验证是否成功构建中间载体。 0027 更进一步地， S3具体为： 在GAVPO表达盒基因的两端引。
15、入NotI和NruI酶切位点， 并使用NotI和NruI对中间载体进行双酶切， 回收纯化酶切后的GAVPO表达盒基因DNA片段 和线性中间载体， 进行连接、 转化、 筛选重组子并提取质粒， 通过酶切鉴定和测序验证是否 成功构建光调控基因表达载体。 0028 可选的， 将GAVPO表达盒基因片段回收纯化后连接到pUC57载体上， 并在基因片段 的两端引入NotI和NruI酶切位点， 使用NotI和NruI对中间载体和pUC57克隆载体进行 双酶切， 回收纯化酶切后的GAVPO表达盒基因DNA片段和线性中间载体， 进行连接、 转化、 筛 说明书 2/5 页 4 CN 105441476 A 4 选。
16、重组子并提取质粒， 通过酶切鉴定和测序验证是否成功构建光调控基因表达载体。 0029 其中， pUC57载体为本领域常规质粒， 可购自Biovector中国质粒载体菌株细胞株 基因保藏中心。 0030 为了清晰且直观地验证上述重组表达载体中的目的基因可受光调控， 在本发明的 具体实施方式中， 所述目的基因为绿色荧光蛋白基因(EGFP)， 该基因为本领域技术人员常 用基因， 可由pEGFP-C1载体酶切得到， 也可通过其他本领域常规技术手段获得， 本发明不作 限制。 0031 第二方面， 本发明提供了含有所述光调控基因表达载体的盐藻， 导入有本发明前 述光调控基因表达载体的盐藻均在本发明的保护范。
17、围之内。 0032 第三方面， 本发明提供了所述光调控基因表达载体在盐藻中通过光调控表达目的 基因的应用。 0033 具体为， 将所述光调控基因表达载体通过玻璃珠法介导导入盐藻细胞中， 转化的 盐藻细胞可通过蓝光照射调控实现目的基因表达的开启和关闭。 0034 在本发明的具体实施方式中， 当目的基因为绿色荧光蛋白基因(EGFP)时， 转染该 光调控基因表达载体的盐藻细胞， 在经过蓝光照射后， 倒置荧光显微镜下观察目的基因 EGFP表达情况。 结果显示： 蓝光照射可调控目的基因表达的开启和关闭。 无光暗培养条件 下， 镜下未见目的基因EGFP的表达， 蓝光照射后， 镜下可见目的基因EGFP在盐藻。
18、细胞中的高 效和稳定表达。 0035 所述蓝光照射是使用含有180个小灯珠的LED蓝光灯带(460-470nm)在转化盐藻细 胞培养板下方进行连续光照， 光照强度约为0.8W/m2， 即可调控目的基因的表达。 0036 本发明的有益效果在于： 0037 本发明所述的光调控基因表达载体在盐藻中的表达快速高效稳定、 易于控制； 盐 藻培养条件简单可进行露天大规模培养， 目的蛋白生产成本低； 盐藻本身营养丰富无细胞 壁容易进行目的蛋白的分离纯化； 盐藻为真核细胞用于目的蛋白表达不需要进行翻译后加 工修饰即有生物活性。 0038 本发明提供了一种适用于盐藻的光调控基因表达载体。 可通过蓝光有效调控目的。
19、 基因的表达， 且表达效率高。 这为盐藻作为生物反应器的开发利用提供了一种新的途径。 附图说明 0039 图1为盐藻光调控表达载体pU5DSJ1构建策略； 0040 图2为PCR扩增获得的GAVPO表达盒基因DNA片段连接到pUC57克隆载体上酶切鉴定 结果： M， DNAMarker； 1为重组质粒； 2为重组质粒用NotI和SpeI双酶切获得线性载体和盐 藻肌动蛋白启动子DNA片段(约730bp)； 0041 图3为构建的中间载体pU5-EGFP图谱示意图； 0042 图4为构建的中间载体pU5-EGFP酶切鉴定结果， 其中： 1为重组质粒； 2为重组质粒 用NheI和BamHI双酶切获得。
20、线性载体和EGFP的DNA片段(约800bp)； M， DNAMarker； 0043 图5为构建的盐藻光调控表达载体pU5DSJ1图谱示意图； 0044 图6为盐藻光调控表达载体pU5DSJ1酶切鉴定结果， 其中： A为NotI+SacI双酶切 鉴定结果， 1为重组质粒酶切结果， 2为重组质粒； B为BamHI酶切鉴定结果， 3为重组质粒， 4 说明书 3/5 页 5 CN 105441476 A 5 为重组质粒酶切结果； M， DNAMarker； 0045 图7为玻璃珠法导入表达载体pU5DSJ1的盐藻转化株中目的基因EGFP在暗培养和 蓝光照射后的表达结果。 0046 A组为正常培养盐。
21、藻细胞观察结果， 其中： A1为蓝光激发绿色荧光结果， A2为绿光 激发红色荧光结果， A3为正常光学显微镜下观察盐藻细胞； 0047 第一次(B组)、 第二次(C组)、 第三次(D组)盐藻转化细胞中EGFP表达观察结果： B1- D1为转化后无光照暗培养48h的盐藻细胞中EGFP表达情况， B2-D2为盐藻转化细胞暗培养 48h后继续蓝光照射培养48h的EGFP表达情况， B3-D3为盐藻转化细胞暗培养48h后继续蓝光 照射培养96h的EGFP表达情况。 具体实施方式 0048 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。 需要理解的是以下实 施例的给出仅是为了起到说明的目的， 并不。
22、是用于对本发明的范围进行限制。 本领域的技 术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下， 可以对本发明进行各种修改和替换。 0049 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0050 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0051 实施例1扩增光敏转录因子GAVPO表达盒及TA克隆 0052 从GenBank中查找盐藻肌动蛋白(actin)启动子序列(No.AF541875)为模板进行序 列合成并以合成序列为模板， 设计合成引物PCR扩增基因片段并回收纯化。 以pGAVPO质粒为 模板， 设计并合成引物PCR法扩增获得GAVPO基因序列(含。
23、有SV40polyA)， 回收并纯化扩增 的基因DNA片段。 0053 引物序列如下： 0054 ActinF： 5 -TACCTCGCGAATGCATCTAGATGCGGCCGCGGCGCGCCACGGCTCACCATCTTGTTTC CCGA-3 (划线部分为NotI酶切位点)； 0055 ActinR： 5 -AACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTCCAATGCTAGCACTAGTTTGATCTC- 3 ； 0056 GAVPOF： 5 -GGAAGGGGTGACAGAGAGATCAAACTAGTGCTAGCGCTATGAAGCTACTGTCTTCT- 3 ； 00。
24、57 GAVPOR： 5 -AACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTTCGCGACTTAAGATACATT-3 (划线 部分为NruI酶切位点)。 0058 以上述两段DNA序列为模板， 用ActinF和GAVPOR引物重叠PCR法扩增获得光敏转 录因子GAVPO表达盒基因片段， 上下游分别引入NotI和NruI酶切位点。 回收并纯化扩增的 基因片段， 并将其连接到pUC57克隆载体上， 转化感受态大肠杆菌DH5 并涂布于加有氨苄 (Amp,100 g/ml)的平板上， 于37过夜培养， 挑取Amp抗性单个菌落进行液体扩大培养， 采 用碱裂解法质粒提取试剂盒提取质粒DNA。。
25、 重组质粒用NotI和SpeI双酶切(线性载体+约 730bp盐藻肌动蛋白启动子DNA片段)进行鉴定， 酶切结果经1琼脂糖凝胶电(图2)。 鉴定正 确的重组质粒再进行测序验证。 0059 实施例2中间载体pU5-EGFP的构建 0060 将pEGFP-C1和pU5-Cre载体分别用NheI和BamHI进行双酶切， 回收纯化酶切后 说明书 4/5 页 6 CN 105441476 A 6 EGFP基因DNA片段以及线性pU5-Cre载体片段。 线性载体和EGFP基因片段按1:5的比例用连 接试剂在16进行连接， 按实施例1的方法进行转化、 培养、 挑取单个菌落扩大培养、 提取质 粒。 重组质粒用。
26、NheI和BamHI双酶切(获得线性载体和约800bp的EGFP片段)进行鉴定， 酶 切结果经1琼脂糖凝胶电(如图4所示)。 将鉴定正确的重组质粒再进行测序以确认EGFP基 因序列的正确性。 这样通过酶切鉴定和测序的方法获得成功构建的重组质粒载体pU5-EGFP (图3)。 0061 实施例3真核表达载体pU5DSJ1的构建 0062 将实施例1克隆载体和实施例2构建的pU5-EGFP载体分别用NotI和NruI进行双 酶切， 回收纯化酶切后的光敏转录因子GAVPO表达盒和线性pU5-EGFP载体， 线性载体和基因 片段按1:5的比例用连接试剂在16进行连接， 按实施例1的方法进行转化、 培养。
27、、 挑取单个 菌落扩大培养、 提取质粒。 重组质粒用NotI+SacI双酶切或HindIII单酶切进行鉴定， 酶 切结果经1琼脂糖凝胶电(如图6所示)。 将鉴定正确的重组质粒再进行测序以确认各连接 基因序列的正确性。 这样通过酶切鉴定和测序的方法获得成功构建的重组表达载体 pU5DSJ1(图5)。 0063 实施例4玻璃珠法转化盐藻 0064 将用无内毒素质粒提取试剂盒提取实施例3成功构建的真核表达载体pU5DSJ1质 粒， 采用玻璃珠法介导将质粒导入盐藻细胞进行表达验证， 具体操作方法如下： 0065 盐藻细胞达到对数生长期时计数(浓度为106个细胞/ml)， 取盐藻藻液800 l， 500。
28、rpm离心2分钟， 弃上清， 盐藻细胞用1ml新鲜的盐藻液体培养基轻轻混匀后离心， 重复三 次。 盐藻细胞用800 l液体培养基重悬， 终浓度为105个细胞/ml。 加入150 lPEG6000使其终 浓度为3.5-5， 轻轻混匀后加入90 l的质粒DNA(0.55 g/ l)， 随后加入300 g经过高温高 压灭菌处理的玻璃珠(预先经过酸处理， 直径425-600 m)并轻轻地上下颠倒混合。 在1.5ml EP离心管中2400rpm涡旋12-18s。 待玻璃珠沉淀后将转化后的盐藻细胞转移至24孔板， 暗培 养48小时， 随后用蓝光照射48-96小时。 0066 实施例5目的基因EGFP在盐藻。
29、转化株中的表达检测 0067 用倒置荧光显微镜观察检测转染后的盐藻细胞是否可通过蓝光照射调控实现目 的基因表达的开启和关闭以及目的基因EGFP在盐藻转化株中的表达情况。 具体方法如下： 在暗培养后或蓝光照射培养一段时间后， 将转化的盐藻细胞置于倒置荧光显微镜下(设置 蓝光激发绿光， 曝光时间为60s-80s)， 观察并记录目的基因EGFP在盐藻细胞中的表达情况。 0068 所述蓝光照射是使用含有180个小灯珠的LED蓝光灯带(460-470nm)在转化盐藻细 胞培养板下方进行连续光照， 光照强度约为0.8W/m2， 即可调控目的基因的表达。 0069 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方。
30、案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说明书 5/5 页 7 CN 105441476 A 7 0001 序列表 1/4 页 8 CN 105441476 A 8 0002 序列表 2/4 页 9 CN 105441476 A 9 0003 序列表 3/4 页 10 CN 105441476 A 10 0004 序列表 4/4 页 11 CN 105441476 A 11 图1 图2 说明书附图 1/5 页 12 CN 105441476 A 12 图3 图4 说明书附图 2/5 页 13 CN 105441476 A 13 图5 说明书附图 3/5 页 14 CN 105441476 A 14 图6 说明书附图 4/5 页 15 CN 105441476 A 15 图7 说明书附图 5/5 页 16 CN 105441476 A 16 。