技术领域
本发明属于重金属污染修复技术领域。更具体地，涉及一种利用地表球囊霉 降低金银花的镉积累并提高其产量的方法。
背景技术
由于农田污灌、固体废弃物施用以及矿山开采与冶炼等人类活动，土壤镉污 染越来越严重。镉在土壤中移动性大、毒性高，是环境中最毒的无机污染物之一。 镉被植物吸收后进入植物体，可通过食物链富集进入人体，严重威胁着农业生产 和人类健康。针对大面积中轻度污染的耕地，目前尚缺乏经济可行的技术手段彻 底清除土壤重金属。我国人口多与耕地少的矛盾突出，将大面积重金属污染土地 实行休耕会影响农作物生产和国家安全稳定，在我国这是不现实的。因此，必须 采取措施降低农作物中重金属含量以保障农业生产安全。
金银花(Lonicerajaponica)是忍冬科忍冬属多年生半常绿藤本植物，广泛 分布于热带和亚热带地区，其地上部分为药用部分，具有很高的药用和经济价值。 另外，金银花具有生物量大、生长快、寿命长、根系发达、抗性强、适应性广、 对土壤要求不严格等特点。但是，最近研究表明金银花积累镉的能力很强(Liu 等，2009；刘周莉等，2009；Liu等，2012；Jia等，2013；贾莲等，2013)， 有研究称可利用其治理镉污染土壤，但是从另一个角度看，这对金银花的生产和 应用带来十分不良的影响。因此，降低金银花镉积累的研究是实现金银花在镉污 染土地上安全生产的重要环节。向言词等(2013)采用苔藓、黑炭土、植物果制 吸咐剂和稻草屑作为基质栽培金银花，这些基质既可为植物生长提供丰富营养， 又可吸附固定土壤重金属，减少重金属的生物有效性，阻止重金属从污染土壤传 递进入金银花体内，实现在污染土壤中安全栽培与生产金银花，然而该方法却不 适用于大面积的土壤栽培。
现有技术中，利用生物、物理化学或者农业生态措施可以降低镉在植物中的 积累，是实现在镉污染土壤中进行安全农业生产的重要措施。其中，施用土壤改 良剂是控制土壤镉污染的有效手段，其目的是降低土壤镉的生物有效性，达到原 位抑制作物吸收镉的目的。此方法成本低、易于实践，是在镉污染土壤上进行安 全生产的有效途径之一。但是，目前常用的镉污染土壤改良剂，多数存在效果不 稳定或对土壤性质、结构造成不利影响等缺陷，直接影响土壤改良剂的实际持续 应用。而利用菌根真菌降低植物重金属吸收量是一种行之有效、环境友好的技术 手段。自1981年Bradley等(1981)报道石楠(Callunavulgaris)菌根降低植 物对过量铜和锌的吸收以后，人们对菌根与重金属污染的研究产生了浓厚的兴 趣。Amir等(2013)也报道Glomusetunicatum的定殖显著(p<0.05)降低了其宿 主植物Sorghumvulgare根部以及地上部分的Ni浓度而促进了生长。Lins等 (2006)也发现接种Glomusetunicatum的银合欢(Leucaenaleucocephala)地上 部分Cu含量比不接种处理低。
目前，尚未见有利用菌根真菌降低金银花中镉积累的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中降低金银花镉积累方法的不足， 提供一种利用地表球囊霉(Glomusversiforme)降低金银花的镉积累并提高金银 花产量的方法。利用地表球囊霉和金银花共生，不仅可以改善金银花的矿质营养 状况，尤其是P素营养，从而促进金银花生长，增加生物量尤其是地上部生物量； 更重要的是，可以降低金银花地上部分(茎、叶和花)和地下部分(根)的镉浓 度，也降低了Cd对金银花的毒害。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
首先，本发明公开了地表球囊霉在降低金银花的镉积累和/或提高金银花产 量方面的应用，该应用均应在本发明的保护范围之内。
在此基础上，本发明提供了一种利用地表球囊霉降低金银花镉积累并提高其 产量的方法，是利用地表球囊霉和金银花共生栽培。
优选地，所述地表球囊霉是地表球囊霉菌剂。
所述地表球囊霉菌剂可以为常见的地表球囊霉菌剂。
作为一种优选的实施方式，所述地表球囊霉菌剂为包括地表球囊霉宿主植物 根段、菌丝、菌根真菌孢子和/或栽培基质的混合物。
更优选地，上述利用地表球囊霉降低金银花镉积累并提高其产量的方法具体 是：先利用宿主植物将地表球囊霉进行扩繁培养后，收获含有宿主植物根段、真 菌菌丝、菌根真菌孢子和栽培土壤的混合物，即为地表球囊霉菌剂；再将地表球 囊霉菌剂接种于栽培基质中，进行金银花的栽培。
其中，优选地，所述宿主植物为摩西球囊霉的宿主植物。
更优选地，所述摩西球囊霉的宿主植物为玉米、紫云英、高粱、三叶草或苏 丹草等。
优选地，所述地表球囊霉为地表球囊霉BGCGD01C。
优选地，所述利用宿主植物将地表球囊霉进行扩繁培养所用的基质为沙土。
更优选地，所述沙土为灭菌的重量比1：1的沙和土混合物。
另外，上述扩繁培养时，地表球囊霉的接种量为0.1～20w/w％。
优选地，扩繁培养时，所述地表球囊霉的接种量为1～5w/w％。
更优选地，扩繁培养时，所述地表球囊霉的接种量为3～4w/w％。
优选地，金银花栽培时，所述地表球囊霉菌剂的接种量为0.1～20w/w％。
更优选地，金银花栽培时，所述地表球囊霉菌剂的接种量为1～5w/w％。
最优选地，金银花栽培时，所述地表球囊霉菌剂的接种量为3～4w/w％。
作为一种优选的可实施方案，上述地表球囊霉菌剂的具体制备方法如下：
按照0.1～20w/w％的接种量，将地表球囊霉接种剂均匀平铺在沙土基质上， 覆盖一层灭菌沙土基质，浇水，播种地表球囊霉宿主的种子，再覆盖一层灭菌沙 土基质，培养3～6个月，除去植株地上部分茎叶后，置于温度和湿度相对稳定 的空间干燥10～15天，然后收获所有培养物，包括植物根段、菌丝、菌根真菌 孢子和栽培基质，剁碎混匀，即得到地表球囊霉菌剂。其中，优选地，所述接种 量为1～5w/w％。更优选地，所述接种量为3～4w/w％。优选地，所述沙土基质 为灭菌的重量比1：1的沙和土混合物。
另外，上述收获所有培养物后的操作尽量做到无菌，具体可为：操作桌面先 用酒精(如70％酒精)擦拭消毒；桌面上覆盖若干层(如3层)干净的纸，将收 获的培养物倒在纸上，用火焰消毒的短柄斧剁碎；用两张纸卷起剁碎了的培养物， 纸筒的一端插入预先准备的能封口的干净塑料袋中；当所有的培养物都转移入袋 中后，轻轻取出纸，封上袋，任何时候都不要让手接触到一点盆栽培养物，再在 外面套一个相同的塑料袋，然后放置在4℃冰箱中保藏。
更具体地，所述地表球囊霉菌剂的制备方法如下：
装灭菌的沙土(按照重量比，沙：土＝1：1)培养基至塑料盆的4/5；按照4 w/w％的接种量，将地表球囊霉接种剂均匀平铺在基质上一薄层。再覆灭菌基质 2cm，浇水，播种玉米种子10～15粒/盆。覆盖0.5cm灭菌基质，然后移至温室 培养；
盆栽5个月后进行收获；收获时，先剪去植物株地上部分茎叶，将盆置于温 度湿度相对稳定的房间干燥两周，然后收获盆中所有培养物(包括植物根系、菌 丝、孢子和基质)；
操作桌面先用70％酒精擦拭消毒；桌面上覆盖3层干净的纸，将盆中培养物 倒在纸上，用火焰消毒的短柄斧剁碎；用两张纸卷起剁碎了的培养物，纸筒的一 端插入预先准备的能封口的干净塑料袋中；当所有的培养物都转移入袋中后，轻 轻取出纸，封上袋，任何时候都不要让手接触到一点盆栽培养物，再在外面套一 个相同的塑料袋，然后放置在4℃冰箱中保藏。
另外，一种包含有地表球囊霉的适用于镉污染土壤上种植金银花的土壤改良 剂也应在本发明的保护范围之内。所述地表球囊霉可为上述的地表球囊霉菌剂。
优选地，所述土壤改良剂中，地表球囊霉菌剂的含量为0.1～20w/w％，所 述土壤改良剂的使用量为3.4～668公斤/亩。
更优选地，所述土壤改良剂中，地表球囊霉菌剂的含量为1～5w/w％，所述 土壤改良剂的使用量为34～167公斤/亩。
最优选地，所述土壤改良剂中，地表球囊霉菌剂的含量为3～4w/w％，所述 土壤改良剂的使用量为100公斤/亩。
另外，还需强调的是，以本发明所公开的根内球囊霉在降低金银花的镉积累 和/或提高金银花产量方面的应用为基础，所衍生、替换、组合出的其他方案， 均应在本发明的保护范围之内。
本发明以金银花为实验植物，以地表球囊霉为接种剂，在不同Cd浓度(0、 10和20mgCdKg-1)的土壤中，通过盆栽实验研究接种地表球囊霉降低金银花 积累镉的潜力，结果表明，接种地表球囊霉(Gv)提高了金银花吸收P的能力， 促进了金银花生长，生物量大幅度增加；而且，接种Gv可以降低金银花地上部 分(茎、叶和花)和地下部分(根)的镉浓度，实现了在镉污染土壤上生产金银 花的目的。
本发明具有以下有益效果：
本发明利用地表球囊霉与金银花共生，不仅可以改善金银花的矿质营养状 况，尤其是P素营养，从而促进金银花生长，增加生物量尤其是地上部生物量， 提高金银花的产量；更重要的是，可以降低金银花地上部分(茎、叶和花)和地 下部分(根)的镉浓度，为在镉污染土壤中安全生产金银花提供了一个途径，对 金银花的生产及应用具有重要的意义。
另外，本发明还实现了地表球囊霉的一种新应用，为地表球囊霉的开发和应 用提供了一个新的思路和方向。
本发明的方法与传统的化学与农业措施相比，接种地表球囊霉的措施具有效 果好、无二次污染、运行成本低等特点。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形 式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试 剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
1、供试菌株扩繁培养和菌剂的制备
地表球囊霉(Glomusversiforme，简称Gv)BGCGD01C北京市农林科学院 植物营养与资源研究所提供。
利用玉米(Zeamays)作为宿主植物进行盆栽扩繁后，将含有宿主植物根段、 真菌菌丝、菌根真菌孢子和盆栽土壤的混合物作为接种菌剂。具体过程如下：
装灭菌的沙土(按照重量比，沙：土＝1：1)培养基至塑料盆的4/5。按照 4％的接种量(w：w)将地表球囊霉接种剂均匀平铺在基质上一薄层。再覆灭菌 基质2cm，浇水，播种玉米种子10～15粒/盆。覆盖0.5cm灭菌基质，然后移至 温室培养。
盆栽5个月后进行收获。收获时，先剪去植物株地上部分茎叶，将盆置于温 度湿度相对稳定的房间干燥两周，然后收获盆中所有培养物(包括植物根系、菌 丝、孢子和基质)。
操作桌面先用70％酒精擦拭消毒。桌面上覆盖3层干净的纸，将盆中培养物 倒在纸上，用火焰消毒的短柄斧剁碎。用两张纸卷起剁碎了的培养物，纸筒的一 端插入预先准备的能封口的干净塑料袋中。当所有的培养物都转移入袋中后，轻 轻取出纸，封上袋，任何时候都不要让手接触到一点盆栽培养物，再在外面套一 个相同的塑料袋，然后放置在4℃冰箱中保藏。
2、供试植物
供试植物为金银花。
2014年4月，采集二年生金银花枝条作为插穗。选取长度30cm左右、粗 细一致的枝条，枝条上端不留叶，下端削成平滑斜面。砂培扦插培养6周，待 到营养叶长出2～3片时，挑选长势一致的幼苗，经0.3％KMnO4溶液对其根 部消毒5s后，用自来水和蒸馏水依次冲洗数次。
3、供试土壤
土壤采自华南师范大学生物园。
土壤的基本理化性质如下：pH6.65，有机物质1.45％，有效磷52mg/kg， 总Cd0.14mg/kg，DTPA-Cd0.063mg/kg。
将土壤经自然风干后磨碎，过1mm筛后，121℃高温高压蒸汽灭菌2h，分 别加入不同浓度的CdCl2使Cd浓度达到10mg/kg和20mg/kg。
为了让土壤中Cd分布均匀且稳定，加去离子水浸润一周后风干两周，循环 两次。
4、地表球囊霉接种金银花的应用
(1)实验设计：试验分为3组：三种土壤重金属Cd浓度分别为：0mg/kg、 10mg/kg、20mg/kg。每组均设计接种和不接种两种处理。
(2)试验盆为容量3kg土的塑料花盆，按3w/w％的接种量将地表球囊霉菌 剂与土壤均匀混合后装盆，不接种对照中接入等量的经过两次灭菌之后的地表球 囊霉灭活菌剂，以及菌剂经过滤纸(whatmanNo.1，孔径：11μm)滤除地表球 囊霉之后的菌悬液(补充灭活菌剂中细菌的损失)。每盆移栽3株生长状况良好 并且生长状况一致的金银花幼苗，每个处理重复5次。
(3)将盆栽随机摆放在温室中进行培养，光照14h，温度为22℃～28℃， 每两天浇一次无菌水。培养14个月后收获植物。
5、实验指标测定
(1)浸染率的测定
用蒸馏水将根洗净，剪成约1cm长的小段，放入15％的KOH溶液中，90℃ 恒温水浴30min，用蒸馏水轻轻漂洗根样；用10％的H2O2漂白30min，用蒸馏 水冲洗；再将根浸入1％的HCl溶液中静置3min，用蒸馏水洗去HCl溶液后， 加入0.05％的Trypanblue染液，90℃水浴下染色30min，染色后，用酸性甘油(乳 酸：甘油＝1：1)洗去根的浮色，随机挑取50条根段于显微镜下观察侵染情况。 参照Giovannetti等(1980)的方法计算地表球囊霉侵染强度。
(2)金银花生物量的测定
将植物收获后，用去离子水冲洗干净，分开植物地上(茎、叶和花)和地下 部分，置于80℃烘箱中72h质恒重，称干重。
(3)金银花Cd含量的测定
总Cd含量采用HNO3-HClO4-HF消解，用TAS-986火焰型原子吸收仪测定 溶液中Cd含量。
(4)土壤有效态Cd含量测定
参照Lindsay和Norvell(1978)，用DTPA提取-AAS法测定土壤中有效Cd。
(5)植物体磷含量测定
将植株根茎叶各部分用清水洗干净，然后放入烘箱内75℃烘48h，直至恒 重。分别称取烘干的根茎叶各部分用硫酸-过氧化氢进行消化，冷却稀释后，P 含量采用钼锑抗分光光度法测定。
(6)植物抗氧化指标测定
取植物的叶片0.5g，于液氮中迅速研磨至粉末状，加6ml预冷的50mmol/L pH7.8的磷酸缓冲液(含质量百分比浓度为4％的PVPP和0.3％的TritonX-100)。 并以10000r/min离心20min，上清液即为酶液，4℃保存备用。
SOD活性参照Beyer和Fridovich(1987)的方法测定。以不加酶液同时不 加NBT的照光管为对照，以不加酶液同时加NBT的照光管为最大光还原管，以 抑止NBT光还原50％所需酶量为一个酶活性单位(U)。
APX活性参照Nakano等(1981)的方法测定。
GR活性参照Carlberg和Mannervik(1985)的方法测定。
CAT活性参照Aebi(1984)的方法测定。
MDA含量参照Heath和Packer(1968)的方法测定。
6、实验结果
(1)接种Gv对金银花生物量和P含量的影响，结果如表1所示。
结果表明：
1)未接种Gv处理中，金银花没有Gv侵染。土壤Cd浓度对Gv的侵染率 没有影响。
2)接种Gv明显促进了金银花的生长，地上和地下生物量明显增加，最大 增幅分别为224％和253％。
3)接种Gv显著提高了金银花P含量。
表1接种Gv对金银花生物量和P含量的影响(平均值±标准差，n＝5)
*表示接种与未接种之间差异显著(p<0.05)。
(2)接种Gv对金银花Cd浓度和土壤DTPA-Cd的影响，结果如表2所示。
结果表明：
1)接种Gv明显降低了金银花根、茎、叶和花的Cd浓度，降幅分别为68％、 49％、68％、70％(Cd10)和48％、67％、62％、73％(Cd20)；
2)接种Gv对根际土壤DTPA-Cd浓度没有显著影响。
表2接种Gv对金银花Cd浓度和土壤DTPA-Cd的影响(平均值±标准差， n＝5)
*表示接种与未接种之间差异显著(p<0.05)。
(3)接种Gv对金银花抗氧化酶和MDA的影响，结果如表3所示。
结果表明：
1)接种Gv显著提高了金银花叶片CAT、GR和APX活性，提高了抗氧化 能力，从而缓解了镉对金银花的毒害作用。
2)接种Gv对金银花叶片SOD活性没有显著影响。
3)接种Gv显著降低了金银花叶片MDA含量。
表3接种Gv对金银花抗氧化酶和MDA的影响(平均值±标准差，n＝5)
*表示接种与未接种之间差异显著(p<0.05)。SOD、CAT、GR、APX和 MDA分别为超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶、抗坏血酸过氧化 物酶和丙二醛。
综上所述，可得出如下结论及分析：
(1)在地表球囊霉－金银花共生体中，大量延伸到土壤中的根外菌丝扩大 了根系的吸收面积，改善金银花的矿质营养状况，尤其是P素营养，从而促进金 银花生长，增加生物量尤其是地上部生物量，提高金银花的产量。
(2)地表球囊霉提高金银花过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX) 和谷胱甘肽还原酶(GR)等抗氧化保护酶的抗氧化作用，降低MDA含量，从 而降低了Cd对金银花的毒害。
(3)地表球囊霉降低了金银花地上部分(茎、叶和花)和地下部分(根) 的镉浓度。