技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及提高马铃薯茎块抗氧化能力的基因及 其应用，可以赋予植物更多的积累四种单咖啡酰奎尼酸等，以及二种黄酮醇类三糖等物质， 并提高马铃薯抗氧化能力。
背景技术
单咖啡酰奎尼酸，是由咖啡酸（Caffeicacid）与奎尼酸（Quinicacid，1-羟基六 氢没食子酸）生成的缩酚酸，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素 类化合物主要存在于茄科植物，以及咖啡，苹果，及梨中。近20年来，国内外学者就单咖啡酰 奎尼酸的植物化学和药理学进行了深入研究，发现这类化合物具有一些重要的生物活性， 极具临床价值。根据咖啡酰在奎尼酸上的位置不同，从理论上讲，可分为1-咖啡酰奎尼酸， 3-咖啡酰奎尼酸，4-咖啡酰奎尼酸和5-咖啡酰奎尼酸（绿原酸）。在人体中，单咖啡酰奎尼酸 主要直接被小肠吸收(Williamsonetal.,2000)，并具有清除其中过氧自由基的能力 (Nardinietal.,2002）。
1-咖啡酰奎尼酸在NF-κB途径中作为潜在抑制子具有抗癌能力，不仅在免疫反应 的初期起作用，同样可以在免疫进程的各个阶段产生影响（Aggarwaletal.,2006;Khan etal.,2013)。3-咖啡酰奎尼酸作为人类饮食中最丰富的多酚类物质，具有预防肝脏疾 病，高血脂以及肥胖的生物学功能(Sakulnarmratetal.,2012;Huetal.,2015)。4- 咖啡酰奎尼酸是中药玫瑰茄中消炎的重要成分物质（Zhenetal.,2016)。5-咖啡酰奎尼 酸俗称绿原酸，主要生物活性包括（1）对透明质酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶的抑制作用；（2）对 自由基的清除及抗脂质过氧化作用；（3）抗诱变作用；（4）保肝利胆作用；（5）抗菌、抗病毒及 解痉等作用。
目前主要通过常规手段利用天然材料（银杏叶、洋葱、柠檬、各种中药材等）为基础 的化学方法获得，受到原材料来源不足、含量偏低、初提物成份复杂及相关药理毒性不清等 因素的严重限制，由少数公司控制下游产品的生产和销售，价格居高不下。
目前广泛种植的马铃薯仅含有少量的黄酮醇(其中黄酮醇类三糖近乎痕量）和单 咖啡酰奎尼酸。利用马铃薯作为生物反应器生产植物疫苗、化合物等正成为基因工程研究 的一个热点。马铃薯是重要的转基因受体植物，农杆菌介导的马铃薯茎段转化法从报道之 后一直得到广泛应用。但是如何能够提高马铃薯体内多种单咖啡酰奎尼酸及槲皮素-葡萄 糖-葡萄糖苷-鼠李糖苷及山萘酚-葡萄糖-葡萄糖苷-鼠李糖苷两种黄酮醇类三糖的含量， 进而提高马铃薯茎块抗氧化能力一直是现有常规技术无法解决的问题。
发明内容
本发明的目的就是针对上述存在的问题而提供一种提高马铃薯茎块抗氧化能力 的基因及其应用。本发明提供了一种以增加马铃薯茎块中积累单咖啡酰奎尼酸包括1-咖啡 酰奎尼酸（提高3.51倍）、3-咖啡酰奎尼酸（提高5.45倍）、4-咖啡酰奎尼酸（提高5.37倍）、5- 咖啡酰奎尼酸（绿原酸）（提高3.72倍）等，以及通过对葡萄糖基转移酶基因的调控提高槲皮 素-葡萄糖-葡萄糖苷-鼠李糖苷（提高13.50倍）及山萘酚-葡萄糖-葡萄糖苷-鼠李糖苷（提 高4.46倍）等黄酮醇类三糖物质含量，并提高马铃薯茎块抗氧化能力（2倍以上）的cDNA片 段CQAIP1，其基因序列如SEQIDNO：1所示，该片段从拟南芥中获得，本发明利用马铃薯自 身茎块特异性表达启动子Patatin-2，驱动外源基因CQAIP1在马铃薯茎块中特异表达，大大 提高了马铃薯茎块中4种单咖啡酰奎尼酸及2种黄酮醇类三糖类物质含量，从根本上大幅度 提高马铃薯茎块的抗氧化能力。
本发明以栽培型马铃薯作为生物反应器生产多种单咖啡酰奎尼酸及高含黄酮醇 类三糖生物制品，实行产业化；也可以此获得马铃薯的工程细胞，通过细胞培养方式生产四 种单咖啡酰奎尼酸及两种黄酮醇类三糖。同时本发明中马铃薯用的转化载体可以通过雌二 醇的诱导作用剔除筛选标记，得到具有食用安全性的马铃薯品种，进行品种培育。
本发明的提高马铃薯茎块抗氧化能力的基因及其应用技术方案为，本发明首先提 供了提高马铃薯茎块抗氧化能力的基因CQAIP1，其核酸序列如SEQIDNO：1所示：
。
本发明是通过特异引物CQAIP1F1，其基因序列如SEQIDNO：2所示：acttttgtgg tcagtggaata，和CQAIP1R1，其基因序列如SEQIDNO：3所示：aacggatcaatcaatatcat，采 用现有技术高保真扩增全长SEQIDNO：1基因，获得基因序列如SEQIDNO：1所示的基因片 段。
之后通过特异引物Patatin-2F1，其基因序列如SEQIDNO：4所示：atgactagtg ttcagtaattgaccggagac，和Patatin-2R1，其基因序列如SEQIDNO：5所示：atggaattca attttgttggtgctttgag，以马铃薯品种中蔬4号基因组DNA为模版，组合扩增出编码 Patatin-2启动子的DNA序列，其基因序列如SEQIDNO：6所示：
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在获得上述两段基因片段之后，采用XhoI-SpeI双酶切后去掉GFP片段并用上述两 段基因片段替换掉常用植物表达载体pX6-GFP中的GFP基因，最终即可获得植物表达载体 pX6-Patatin-2::CQAIP1。
获得的植物表达载体pX6-Patatin-2::CQAIP1，导入农杆菌工程菌株AGL1。通过茎 段法转化马铃薯品种Desiree,获得PCR转基因植株，通过特异引物CQAIP1F1，其基因序列 如SEQIDNO:2所示，和CQAIP1R1，其基因序列如SEQIDNO：3所示，扩增转入载体的 CQAIP1整体序列，验证转基因阳性植株。利用HPLC对转基因阳性株系的马铃薯茎块进行全 部单咖啡酰奎尼酸与两种黄酮醇类三糖含量检测，转基因材料的茎块中上述物质的含量都 有明显的提高，通过ABTS+方法测量马铃薯茎块的抗氧化能力相比野生型有明显的提高。采 用qRT-PCR（RealtimeQuantitativePCR)技术，通过葡萄糖基转移酶基因引物GF1，其基 因序列如SEQIDNO：7所示：ggatggaactcgattctgga，和GR1，其基因序列如SEQIDNO：8 所示：Caccttcaatttgcagacca，对葡萄糖基转移酶基因进行表达量分析，其基因序列如 SEQIDNO：9所示：
证实提高槲皮素-葡萄糖-葡萄糖苷-鼠李糖苷及山萘酚-葡萄糖-葡萄糖苷-鼠李糖苷 两种黄酮醇类三糖含量，主要原因在于葡萄糖基转移酶基因表达量的大幅度提高。
在上述技术的基础上，根据已经克隆的CQAIP1基因作探针，从cDNA和基因组文库 中筛选可得到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR（polymerasechainreaction）技 术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的CQAIP1基因以及任何感兴趣的一段 DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含CQAIP1基因的序列包括基因 片段的基本上相当于SEQIDNO：1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQIDNO：1所示序 列的亚片段，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞，产生转基因植物。
本发明的有益效果为：本发明首次提供了一种通过赋予茄科植物积累四种单咖啡 酰奎尼酸包括1-咖啡酰奎尼酸、3-咖啡酰奎尼酸、4-咖啡酰奎尼酸、5-咖啡酰奎尼酸（绿原 酸）；及黄酮醇类三糖包括槲皮素-葡萄糖-葡萄糖苷-鼠李糖苷及山萘酚-葡萄糖-葡萄糖 苷-鼠李糖苷等，进而大幅度提高茄科植物抗氧化能力的cDNA片段，该片段对上述两种黄酮 醇类三糖物质的调节主要由于该片段对葡萄糖基转移酶基因表达量的正向调控；该片段从 拟南芥中获得，包含提高马铃薯茎块抗氧化能力基因CQAIP1，本发明提供了该片段的分离 克隆、功能验证和应用的具体方法；本发明利用马铃薯茎块特异性表达启动子Patatin-2， 驱动CQAIP1在马铃薯茎块中特异表达，大大提高了马铃薯茎块中四种单咖啡酰奎尼酸及两 种黄酮醇类黄酮醇类三糖含量在此基础上大大提高了马铃薯茎块的抗氧化能力，验证了拟 南芥CQAIP1基因具有提高马铃薯茎块抗氧化能力的功能，并通过上调葡萄糖基转移酶基因 表达量达到提高上述两种黄酮醇类三糖含量的作用；同时建立在此基础上，以栽培型马铃 薯作为生物反应器生产四种单咖啡酰奎尼酸及黄酮醇类黄酮醇类三糖生物制品，实行产业 化；也可以此获得马铃薯的工程细胞，通过细胞培养方式生产多种单咖啡酰奎尼酸及上述 两种黄酮醇类三糖。同时本发明马铃薯中使用的转化载体可以通过雌二醇的诱导作用剔除 筛选标记，得到具有食用安全性的抗氧化马铃薯品种，进行品种培育。
附图说明
图1所示为本发明的抗氧化转基因马铃薯生产流程示意图；
图2为实施例1中Patatin-2启动子和CQAIP1基因PCR扩增后电泳图，
图2a中M为TaKaRaDNAMarkerDL2,000，1为CQAIP1基因，N为阴性对照，
图2b中M为TaKaRaDNAMarkerDL2,000，1为Patatin-2启动子，N为阴性对照；
图3所示为实施例1中中间载体pBS-Patatin-2:CQAIP1酶切后电泳图，其中M为 Trans2KTMPlusDNAMarker;1-3分别为XhoI/EcoRI,EcoRI/SpeI,XhoI/SpeI 双酶切结果；4为pBS空载体阴性XhoI/SpeI酶切对照；
图4所示为实施例1中重组质粒pX6-Patatin-2::CQAIP1的酶切后电泳图，其中M为 Trans2KTMPlusIIDNAMarker;1-3为重组质粒pX6-Patatin-2::CQAIP1XhoI/SpeI 双酶切结果；
图5所示为实施例2马铃薯遗传转化不同时期生长状况，其中A为愈伤组织诱导后；B为 分化产生不定芽时；C为再生苗生根；D，E为转基因再生马铃薯苗；F为苗移栽大田后植株；
图6所示为实施例3转基因植株中目的基因CQAIP1的PCR检测结果，其中M为TaKaRaDNA MarkerDL2,000，1为阴性对照，2-11为转基因阳性植株；
图7所示为野生型（WT）和转基因茎块(CQAIP1)提取液HPLC分析结果，其中S1为3-咖啡 酰奎尼酸，S2为1-咖啡酰奎尼酸，S3为5-咖啡酰奎尼酸，S4为4-咖啡酰奎尼酸（绿原酸），S5 为槲皮素-葡萄糖-葡萄糖苷-鼠李糖苷，S6为山萘酚-葡萄糖-葡萄糖苷-鼠李糖苷；
图8所示为野生型（WT）和三个不同转基因T1代株系茎块(CQAIP1-1，CQAIP1-2，CQAIP1- 3)葡萄糖基转移酶基因表达量上调倍数图；
图9所示为野生型（WT）和三个不同转基因T1代株系茎块(CQAIP1-1，CQAIP1-2，CQAIP1- 3)提取液抗氧化能力分析结果。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案。
本发明中所涉及的多种培养基具体如下：
MS培养基：100mL10×MSmax，10mL100×MSmin，10mL100×Fe2-EDTA，10mL100 ×PotatoVitamin，30g蔗糖，氢氧化钾或盐酸调pH至5.7-5.8，定容至1L。若为MS固体培 养基，加入0.8%琼脂粉。
共培养培养基M0：1×MS，蔗糖20g/L，NAA0.2mg/L，GA30.02mg/L，zeatin riboside2.5mg/L,琼脂粉8g/L，pH5.7-5.8。
愈伤诱导培养基M1：M0+cefotaxime500mg/L。
分化培养基M2：MS+NAA0.02mg/L,GA30.02mg/,zeatinriboside2mg/ L,cefotaxime500mg/L,kanamycin50mg/L。
生根培养基M2R：MS+cefotaxime500mg/L,kanamycin25mg/L，琼脂粉8g/L， pH5.7-5.8。
实施例1
茎块特异性Patatin-2启动子基因全长DNA和CQAIP1基因全长cDNA的克隆，植物表达载 体的构建：
1．马铃薯茎块特异性Patati-2启动子基因DNA和CQAIP1基因cDNA的克隆
以拟南芥Col-1来源的cDNA为模板,利用引物CQAIP1F1,其基因序列如如SEQIDNO：2 所示，和CQAIP1R1，其基因序列如如SEQIDNO：3所示，扩增出预期1.2kb片段（如说明书 附图图2所示）。PCR扩增的产物经XhoI和EcoRI对其进行双酶切并连接到pBS-XhoI-EcoRI- cut载体上，形成过渡载体pBS-CQAIP1。
以马铃薯中薯4号DNA为模板，引物Patatin-2F1，其基因序列如如SEQIDNO：4所 示，和Patatin-2R1，其基因序列如如SEQIDNO：5所示，组合扩增，得到预期1.5kb片段 （如说明书附图图2所示）。将扩增产物进行SpeI和EcoRI双酶切处理，并连接入SpeI和 EcoRI双酶切处理的过渡载体pBS-CQAIP1，生成新的过渡载体pBS-Patatin-2::CQAIP1。对 过渡载体使用XhoI/EcoRI,EcoRI/SpeI,XhoI/SpeI酶切验证，确认其携带目标片 段（说明书附图图3所示）。进一步采用双酶切和连接策略，通过XhoI和SpeI双酶切将上述过 渡载体中组装完成的Patatin-2::CQAIP1片段置换植物表达载体pX6-GFP中XhoI-SpeI区 间的片段，完成载体pX6-Patatin-2::CQAIP1的构建，对载体使用XhoI/SpeI酶切验证，确 认其携带目标片段（说明书附图图4所示）。
试验中用到的引物序列及说明如表1所示：
表1
2．植物表达载体pX6-Patatin-2::CQAIP1的构建
将克隆到的CQAIP1序列片段，经XhoI和EcoRI双酶切后电泳回收，并与相同酶切回收的 过渡载体pBS连接，形成过渡载体pBS-CQAIP1。
将克隆到的Patatin-2启动子片段，进行SpeI和EcoRI双酶切处理，并连接入SpeI 和EcoRI双酶切处理的过渡载体pBS-CQAIP1，生成新的过渡载体pBS-Patatin-2::CQAIP1。 对过渡载体使用XhoI/EcoRI,EcoRI/SpeI,XhoI/SpeI双酶切后电泳检测，重组子 酶切结果中均含有目标片段，表明过渡载体pBS-Patatin-2::CQAIP1构建成功（如说明书 附图图3）。进一步采用双酶切和连接策略，通过XhoI和SpeI双酶切将上述过渡载体中组装 完成的Patatin-2::CQAIP1片段置换植物表达载体pX6-GFP中XhoI-SpeI区间的片段，完成 载体pX6-Patatin-2::CQAIP1的构建，对载体使用XhoI/SpeI酶切验证，确认其携带目标 片段（如说明书附图图4）。该重组载体经测序重复验证后导入农杆菌菌株AGL1并进行马铃 薯遗传转化。
实施例2
农杆菌介导的马铃薯遗传转化及转基因植株PCR检测
1．农杆菌介导的马铃薯遗传转化
利用马铃薯茎段为外植体，采用农杆菌（AGL1菌株）介导的茎段转化法，将植物表达载 体pX6-Patatin-2::CQAIP1转化Desiree受体材料。一切操作均在严格的无菌环境下进行， 转基因操作基本程序如下：
1）选择生长到3到4周，健壮的马铃薯无菌苗，剪取无茎节茎段（长约0.5-0.8cm）。放置 于农杆菌悬浮液中，每20mL菌悬液放入30个左右的茎段，于黑暗条件下，24℃,42rpm摇床 上混合，使外植体与菌液充分接触，20分钟。
2）取出，用灭菌滤纸拭去表面菌液，转入共培养培养基M0中，于18℃暗处共培养 3d。
3）将转化材料转到M1的愈伤分化培养基上进行愈伤培养（置于人工气候箱在21 ±1℃、16h/d、光照强度2,000Lx条件下培养），愈培养12d。
4）转化材料转入分化培养基M2上进行选择性培养（置于人工气候箱在21±1℃、 16h/d、光照强度2,000Lx条件下培养），以后每两周转接到新鲜的培养基上。
5）约6周后，分化苗长到约2cm高时，剪下插置到Kan减半加有头孢霉素（Cef）的生 根培养基上进行生根筛选。
6）2周后切下茎顶端再次插入选择性生根培养基进行复选。待抗性植株根系健壮 后移至温室灭菌土中生长。
Desiree作为受体材料获得10株独立的T0代转基因植株（如说明书附图图5）。再生 苗生根后移栽温室，加强对黑胫，晚疫以及蝼蛄，蛴螬，地老虎等马铃薯常见病虫害的管理 和防治，适当追施肥料。
2．转基因植株PCR检测
选取幼嫩马铃薯叶片，利用CTAB法提取转基因和非转基因植株基因组DNA，以包含 CQAIP1基因全长DNA在内的外侧载体引物CQAIP1F1/R1进行PCR检测。PCR产物经1%琼脂糖 凝胶电泳分析，扩增出与pX6-Patatin-2::CQAIP1质粒扩增同样大小约1.5kp片段（图5）为 阳性植株，阳性植株有10株，阳性率为：67%。
实施例3
马铃薯茎块类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量HPLC分析
转基因马铃薯茎块表型及产量与非转基因植株并无明显差异。在10株转基因株系中选 取了3株（CQAIP-1,CQAIP-2，CQAIP-3）利用HPLC进行T2代阳性转基因株系中四种单咖啡酰 奎尼酸及两种黄酮醇类三糖含量含量检测
马铃薯块茎含量HPLC分析方法如下：待通过上述步骤获得的马铃薯茎块成熟收获后， 用冷冻干燥机（EYELAFDU-1100，TOKOYORIKAKIAICO.LTD）冷冻干燥后研成粉末。以每mg 冻干粉末溶于30μl70%甲醇的比例溶解后，置于-20℃3h进行复合代谢物质提取，提取液 经1600g离心后使用0.45μm滤膜过滤上清液，取20μl过滤液用于HPLC分析，按照Luo等 （2009）设置HPLC条件，标准品为单咖啡酰奎尼酸，槲皮素-葡萄糖-葡萄糖苷-鼠李糖苷与山 萘酚-葡萄糖-葡萄糖苷-鼠李糖苷（分别购自Sigma和Extrasynthese公司等）。
利用HPLC对阳性转基因株系进行了四种单咖啡酰奎尼酸及两种黄酮醇类三糖含 量检测，转基因材料均有明显提高。转基因茎块中1-咖啡酰奎尼酸含量最高达到55.15μg/ gDW，与对照相比提高了3.51倍；3-咖啡酰奎尼酸，4-咖啡酰奎尼酸分别与对照相比提高 了5.45和5.37倍；5-咖啡酰奎尼酸（绿原酸）含量最高达到2518.16μg/gDW，相比对照提高 了3.72倍。另外，槲皮素-葡萄糖-葡萄糖苷-鼠李糖苷提高了13.5倍；山萘酚-葡萄糖-葡萄 糖苷-鼠李糖苷的含量提高了4.46倍（请见表2）。
表2.Desire转基因马铃薯T2代四种单咖啡酰奎尼酸及两种黄酮醇类黄酮醇类三 糖含量统计。
。
实施例4
高含四种单咖啡酰奎尼酸及两种黄酮醇类三糖马铃薯茎块抗氧化能力分析含量
上述HPLC分析证明了转基因茎块中四种单咖啡酰奎尼酸及两种黄酮醇类三糖含量的 增加（图6、图7，表1）。马铃薯茎块抗氧化分析方法如下：待通过上述步骤获得的马铃薯成熟 收获后，用冷冻干燥机（EYELAFDU-1100，TOKOYORIKAKIAICO.LTD）冷冻干燥后研成粉 末。以每50mg冻干粉末溶于70%甲醇的溶解后，用测定抗氧化活性的ABTS+法对转基因及野 生型马铃薯茎块进行抗氧化分析能力测定。在酶标板上以Trolox为标准对照，能过酶标仪 （SYNERGYMX全波长多功能酶标仪，BIOTEK）测定抗氧化物质对预先制备的自由基ABTS+的 清除能力，将待测物质的清除自由基能力与Trolox清除自由基的能力相对比，确定相对抗 氧化活性，单位为抗氧化量TEAC，即可反应出茎块中提取抗氧化活性物质的效率。
利用ABTS+方法测定T2代阳性转基因茎块抗氧化能力，转基因材料抗氧化能力时显 增强，其中三个转基因株系提高倍数均在2倍（说明书附图图8）。
实施例5
马铃薯中两种黄酮醇类三糖含量提高的调控基因分析
上述分析证明了转基因块茎中两种黄酮醇三糖含量的增加（图6、图7，表1）。马铃薯块 茎中黄酮醇类黄酮醇类三糖调控基因分析方法如下：对三个株系转基因阳性植株的cDNA 进行荧光定量鉴定，利用TaRaKa公司的SYBRPremixExTaqTM以葡萄糖基转移酶基因的荧 光定量引物进行PCR扩增，反应条件与说明书一致。
利用荧光定量方法测定葡萄糖基转移酶基因的表达量，转基因马铃薯中葡萄糖基 转移酶的表达量平均上调了39倍。
SEQUENCELISTING
<110>山东宇泰生物科技有限公司
<120>提高马铃薯茎块抗氧化能力的基因及其应用
<130>无
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