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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510953549.7 (22)申请日 2015.12.15 C12N 9/22(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12R 1/32(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 地址 150001 黑龙江省哈尔滨市南岗区马端 街 427 号 (72)发明人 刘思国 陈利苹 宋宁宁 (74)专利代理机构 北京科龙寰宇知识产权代理 有限责任公司 11139 代理人 孙皓晨 马鑫 (54) 发明名称 一种新型的结核分枝杆菌胞外核酸酶及其用 途 (57) 摘要 本发明公开了一种新型的结核分枝杆。
2、菌胞外 核酸酶及其用途。 本发明证实了Rv0888是结核分 枝杆菌的一个胞外核酸酶。 基于序列分析， Rv0888 核酸酶与已知的胞外核酸酶没有同源性， 表明 Rv0888是一个新型的胞外核酸酶。 Rv0888蛋白的 活性发挥需要二价离子的辅助， 其最佳的温度和 pH分别为41和6.5。 本发明还提出了橄榄苦苷， 6- 姜酚， 补骨脂乙素以及类叶升麻苷这四种中药 单体在抑制该核酸酶中的用途。定点突变研究显 示 H353,D387 和 D438 残基对 Rv0888 的活性起着 催化作用。体内感染试验证实了重组耻垢构分枝 杆菌 Rv0888NS/MS 和 Rv0888S/MS 在小鼠肺中的 持留。
3、能力明显高于 pMV262/MS， 并且 Rv0888NS/MS 和 Rv0888S/MS 在小鼠的肺中能产生明显的病理 变化， 表明 Rv0888 是分枝杆菌感染和致病性所必 须的。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 序列表5页 附图6页 CN 105420212 A 2016.03.23 CN 105420212 A 1/1 页 2 1.一种新型的结核分枝杆菌胞外核酸酶， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.3 或 SEQ ID NO.5 所示。 2.编码权利要求 1 所述的结核分枝杆。
4、菌胞外核酸酶的核苷酸序列。 3.如权利要求 3 所述的核苷酸序列， 其特征在于所述的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.4 或 SEQ ID NO.6 所示。 4.一种表达载体， 其特征在于含有权利要求 2 或 3 所述的核苷酸序列。 5.一种宿主细胞， 其特征在于含有权利要求 4 所述的表达载体。 6.权利要求 1 所述的结核分枝杆菌胞外核酸酶在降解核酸中的用途。 7.如权利要求6所述的用途， 其特征在于所述的核酸包括线性双链DNA， 环状质粒DNA， 染色体 DNA 或者 RNA。 8.橄榄苦苷， 6- 姜酚， 补骨脂乙素或类叶升麻苷在抑制权利要求 1 所述的结核分。
5、枝杆 菌胞外核酸酶中的用途。 权 利 要 求 书 CN 105420212 A 2 1/10 页 3 一种新型的结核分枝杆菌胞外核酸酶及其用途 技术领域 0001 本发明涉及一种胞外核酸酶及其用途， 特别涉及一种新型的结核分枝杆菌胞外核 酸酶及其用途， 本发明属于生物技术领域。 背景技术 0002 许多种细菌能产生胞外核酸酶， 胞外核酸酶对于细菌的毒力、 生物被膜的形成、 利 用胞外 DNA 获取营养和降解胞外诱捕网 (NETs) 中的 DNA 中起着重要作用。比如希瓦氏 菌、 沙雷氏菌、 金黄色葡萄球菌的胞外核酸酶能够降解胞外的 DNA 以获取其基本的营养成 分-磷源， 碳源和氮源。 Sep。
6、er的最近研究表明野生型的霍乱弧菌能通过其本身的两种胞外 核酸酶(Dns和Xds)降解NETs中的DNA成分。 金黄色葡萄球菌的胞外核酸酶也能降解NETs， 进而引发半胱天冬酶 -3 介导的免疫细胞死亡。然而无乳链球菌的胞外核酸酶 (Gbs0661) 能够攻击 NETs 并且是细菌毒力所必须的。(NETs- 中性粒细胞胞外诱捕网是宿主的防御反 应中一个重要组成部分， 能够固定微生物随后并清楚 )。在葡萄糖缺乏的培养基中， 枯草芽 孢杆菌168的孢子形成阶段释放的脱氧核糖核酸酶(Nuc B)能够降解生物被膜的重要核酸 为自身利用。 0003 结核分枝杆菌 (M.tuberculosis) 是革兰。
7、氏阳性细菌， 是引起结核病的病原菌。结 核病一直是世界上死亡率最高的疾病之一。2013 年， 大约有 900 万人感染结核病， 约有 150 万人死于这种疾病， 其中 36 万人是 HIV 阳性。结核分枝杆菌进入肺之后， 被巨噬细胞和树 突状细胞所吞噬， 然而结核分枝杆菌能够在这些免疫细胞中扩散， 甚至逃脱这些吞噬体迁 移到淋巴结而扩散感染。 0004 革兰氏阳性细菌的胞外核酸酶在细菌的毒力和降解胞外诱捕网 ( 中性粒细胞或 者巨噬细胞释放 ) 的 DNA 方面起着非常重要的作用。之前有关胞外核酸酶的研究主要集中 在无乳链球菌， 化脓性链球菌和金黄色葡萄球菌。虽然之前报道描述过结核分枝杆菌胞内。
8、 核酸酶， 但是至今没有数据显示结核分枝杆菌存在胞外核酸酶。 在次， 本发明首次发现并证 实 Rv0888 蛋白是结核分枝杆菌的胞外核酸酶。 发明内容 0005 本发明的目的之一在于提供一种新型的结核分枝杆菌胞外核酸酶及其用途。 0006 本发明的目的之二在于提供一种能够抑制所述结核分枝杆菌胞外核酸酶的抑制 剂。 0007 为了达到上述目的， 本发明采用了以下技术手段 ： 0008 在本发明中， 我们证实了 Rv0888 蛋白是第一个来自于结核分枝杆菌的胞外核酸 酶， 属于endonuclease/exonuclease/phosphatase家族(Pfam family PF03372)， 。
9、在结核分 枝杆菌的培养滤液中能检测到鞘磷脂酶的活性。进一步的， 本发明还证明了该胞外核酸酶 在降解不同类型的核酸(基因组DNA， 双链PCR产物， 质粒DNA和面包酵母RNA)方面具有高 度的活性， Rv0888 发挥其核酸酶活性需要二价离子的辅助 (Ca2+和 Mn 2+)。另外四种中药单 说 明 书 CN 105420212 A 3 2/10 页 4 体 (6- 姜酚， 类叶升麻苷， 橄榄苦苷， 补骨脂乙素 ) 能够抑制 Rv0888 的核酸酶活性。 0009 在此基础上， 本发明提出了一种新型的结核分枝杆菌胞外核酸酶， 命名为 Rv0888， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO.1、 S。
10、EQ ID NO.3 或 SEQ ID NO.5 所示。 0010 进一步的， 本发明还提出了编码所述的结核分枝杆菌胞外核酸酶的核苷酸序列。 优选的， 所述的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.4 或 SEQ ID NO.6 所示。 0011 含有所述的核苷酸序列的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞也自然落在 本发明的保护范围之内。 0012 再进一步的， 本发明还提出了所述的结核分枝杆菌胞外核酸酶在降解核酸中的用 途。 0013 其中， 优选的， 所述的核酸包括线性双链 DNA， 环状质粒 DNA， 染色体 DNA 或者 RNA。 0014 更进一步的， 本发明提出。
11、了橄榄苦苷， 6- 姜酚， 补骨脂乙素或类叶升麻苷在抑制所 述的结核分枝杆菌胞外核酸酶中的用途。 0015 Rv0888 核酸酶活性显示在 33 -51的温度范围内， 最佳的温度是 41。这个温 度与人和动物在感染结核分枝杆菌后体温升高是一致的， 表明 Rv0888 也许与结核分枝杆 菌的毒力有关。与其他的脱氧核糖酸酶 / 核酸酶相似， Rv0888 核酸酶发挥活性也需要二价 离子。最佳的二价离子是 Mn2+以及 Ca 2+， 其他的二价离子 (Mg2+,Ba2+,Ni2+) 也有不同程度的 促进作用 ( 表 1)。这些结果表明与之前报道的大肠杆菌核酸酶一样， Rv0888 的催化活性位 点与。
12、二价离子的直径没有关系， 而是这些离子结合在不同的氨基酸维持其活性。金属螯合 剂EDTA对Rv0888的活性起着很强的抑制效果， 表明金属离子对于核酸活性是必须的， 并且 在酶结构稳定性方面起着非常重要的作用。 0016 氨基酸置换研究表明 D438 位氨基酸在 Rv0888 核酸酶活性方面起着关键的作用， H353 和 D387 在 Rv0888 活性方面也起着比较积极的作用。与其他的含有保守基序的 DRGH 的肺炎链球菌胞外核酸酶 EndA22 和 DKGH 的无乳链球菌的胞外核酸酶 Gbs06616 相比， 这些 重要的氨基酸残基与他们是不同的。 Rv0888蛋白与其他已知的核酸酶没有任。
13、何同源性(图 9)， 因此我们的数据表明 Rv0888 是一个非特异性核酸酶家族成员之一。 0017 由于肺结核与 HIV 共感染和新出现的无法治疗的或者广泛耐药的结核分枝杆菌， 使得肺结核很难控制。迫切需要研发新的药物和更有效的疫苗。因此需要在遗传基础上理 解结核分枝杆菌的毒力和致病性。有趣的是四种中药单体 ( 橄榄苦苷， 类叶升麻苷， 6- 姜 酚， 补骨脂乙素 ) 能够抑制 Rv0888 活性。之前有关抑制剂的研究主要集中在小分子抑制 剂， 主要是蛋白和病原体生物合成相关的因子 ： 例如， 结构同源物 ML141 阻止金黄色葡萄球 菌进入内皮细胞 ； 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 K11777 。
14、阻塞冠状病毒和线状病毒进入宿主细胞 ； 在金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的 ItaS 表达过程中， 化合物 1771 能阻塞磷脂酰甘油 -LtaS 的结合和抑制 LTA 的合成 ； 使用 BAS00127538 抑制鲍曼不动杆菌 Lipid II( 一个细胞壁生 物合成的前体 ) 通过。随后的药物研究转移到细胞壁蛋白和蛋白酶上 ： 分选酶抑制剂能够 用于治疗医院内感染的金黄色葡萄球菌的感染而没有标准抗生素的副作用 ； 结核分枝杆菌 磷脂酶 / 硫酯酶 (Rv3802c) 抑制剂奥利司他 ； 通过有机催化获得的肺结核的一个毒力因子 mPTPB 的抑制剂 ； 六种小分子被证实能够抑制肺炎链球菌表面核酸酶。
15、 EndA31 ； 重要的是， 我 们首次报道了中药单体能有效的抑制细菌的核酸酶。现在对于广泛耐药的病原体， 新药研 究逐渐转向中药。因此验证新的毒力因子并且筛选中药抑制剂， 也许有利于我们发现新的 说 明 书 CN 105420212 A 4 3/10 页 5 治疗结核病的药物。 0018 体内感染试验表明重组耻垢分支杆菌Rv0888NS/MS和Rv0888S/MS在小鼠感染17d 时继续在肺中持留， 组织病理学分析显示感染 7d 时小鼠的肺有明显的病理变化， 这就意味 着 Rv0888 也许是结核分枝杆菌的一个毒力因子， 可能与结核分枝杆菌在宿主肺中的持留 有关。 之前研究已经报道了不同细。
16、菌核酸酶在细菌中定位 ： 化脓性链球菌分泌到培养上清， 肺炎链球菌的核酸酶定位在膜上和化脓性链球菌， 猪链球菌定位在肽聚糖上。结核分枝杆 菌Rv0888含有信号肽并且能分泌到培养液中。 这种分泌的形式比定位在膜上的核酸酶-像 肺炎链球菌 EndA- 对于结核分枝杆菌的致病性更有效， 因为它们更容易接近它们的底物。 在这项研究中 Rv0888 核酸酶的特性使我们更容易理解结核分枝杆菌的致病性并且也许对 于我们获得新的治疗结核病的药物具有帮助作用。 附图说明 0019 图 1 为重组 Rv0888 蛋白纯化和质谱验证 ； 0020 (A)Rv0888 蛋白亲和纯化的 SDS-PAGE 分析 20m。
17、M Tris-HCl-150mM NaCl-10 glycerol含有浓度梯度的咪唑洗脱Rv0888蛋白。 1:500mM咪唑 ； 2:200mM咪唑 ； 3:100mM咪 唑 ； 4:80mM 咪唑 ； 5:70mM 咪唑 ； 6:60mM 咪唑 ； 7:40mM 咪唑 ； 8:20mM 咪唑 ； M ： 蛋白分子质量 Marker。(B) 离子交换层析纯化 Rv0888 蛋白。(C) 凝胶过滤层析纯化 Rv0888 蛋白。(D) Rv0888 蛋白通过基质辅助的激光解析离子分行时间质谱肽质量指纹图谱。与 Rv0888 蛋白 匹配一致的序列框内显示。 0021 图 2 为纯化的 Rv0888。
18、 蛋白消化不同的核酸 ； 0022 反应条件为 ： 20mM Tris-HCl pH 7.5and 5mM MgCl237孵育 1 小时。(A) 纯化的 Rv0888蛋白消化不同DNA。 M:DL5000DNA Marker ； 1:染色体DNA与20mM Tris-HCl(pH 7.5) ； 2: 染色体 DNA 和纯化的 Rv0888 ； 3: 环状质粒 DNA 与 20mM Tris-HCl(pH 7.5) ； 4: 环状质粒 DNA 与纯化的 Rv0888 ； 5: 线性双链 DNA 与 20mM Tris-HCl(pH 7.5) ； 6: 线性双链 DNA 与纯 化的 Rv0888 。
19、； (B) 纯化的 Rv0888 蛋白消化 RNA。M:DL5000DNA Marker ； 1: 面包酵母 RNA 与 20mM Tris-HCl(pH 7.5) ； ； 2: 面包酵母 RNA 与纯化的 Rv0888 ； (C) 脱氧核糖核酸酶活性需 要阳离子。M:DL5000DNA Marker ； 1: 环状质粒 DNA 与 20mM Tris-HCl(pH 7.5) ； 2: 环状质 粒 DNA 与纯化的 Rv0888 含有 5mM CaCl2和 5mM MnCl2； 3: 环状质粒 DNA 与纯化的 Rv0888 含 有 5mM CaCl2， 5mM MnCl2和 20mM EDT。
20、A。 0023 图 3 为 pH 或温度对 Rv0888 酶活性的影响 ； 0024 (A) 通过琼脂糖凝胶电泳分析温度对 Rv0888 酶活性影响。反应条件为 ： 20mM Tris-HCl pH 6.5,5mM CaCl2and 5mM MnCl2孵育 1h。M:DL5000DNA Marker ； 1: 环状质粒 DNA ； 2-11:环状质粒DNA和Rv0888蛋白， 温度范围33-51， 间隔2。 (B)分光光度法定 量脱氧核糖核酸酶活性， 误差线代表标准差。 (C)通过琼脂糖凝胶电泳分析pH对Rv0888酶 活性影响。 反应条件为 ： 20mM Tris-HCl,5mM CaCl2。
21、and 5mM MnCl237孵育1h。 M:DL5000DNA Marker ； 1,3,5,7,9: 环状质粒 DNApH 6.0-pH 8.0, 间隔 0.5 ； 2,4,6,8,10: 环状质粒 DNA 与 Rv0888 蛋白 pH 6.0-pH8.0, 间隔 0.5。(D) 分光光度法定量脱氧核糖核酸酶活性， 误 差线代表标准差。 0025 图 4 为 Rv0888 的脱氧核糖核酸酶 (A) 和核糖核酸酶 (B) 活性的米氏动力学试验 ； 说 明 书 CN 105420212 A 5 4/10 页 6 0026 反应条件为 ： 20mM Tris-HCl pH 6.5,5mM CaC。
22、l2and 5mM MnCl241孵育 1h。对 DNA 和 RNA 的 Km值分别为 ： 0.3060.04mg/mL 和 0.0120.01mg/mL ； 脱氧核糖核酸酶和核 糖核酸酶的 Vmax值分别为 ： 600.56U/mg/min and 241.11U/mg/min。 0027 图 5 为橄榄苦苷， 6- 姜酚， 类叶升麻苷， 补骨脂乙素抑制 Rv0888 降解环状质粒 DNA ； 0028 反应条件为 ： 20mM Tris-HCl pH 6.5,5mM CaCl2and 5mM MnCl241孵育 1h。(A) M:DL5000DNA Marker ； 1: 环状质粒 DNA。
23、 ； 2: 环状质粒 DNA 与 Rv0888 ； 3: 环状质粒 DNA 与 Rv0888 含有 50乙醇 ； 4: 环状质粒 DNA 与 Rv0888 含有 50 DMSO ； 5-7: 环状质粒 DNA， Rv0888与橄榄苦苷(分别为0.5mM,1mM,2mM) ； 8-10:环状质粒DNA， Rv0888与6-姜酚(分别 为0.5mM,1mM,2mM) ； 11-13:环状质粒DNA， Rv0888与补骨脂乙素(分别为0.5mM,1mM,2mM) ； 14-16: 环状质粒 DNA， Rv0888 与类叶升麻苷 ( 分别为 0.5mM,1mM,2mM)(B) 分光光度法定量 脱氧核糖。
24、核酸酶活性， 误差线代表标准差。 0029 图 6 为 Rv0888 定点突变 ； 0030 通过对基因的定点突变 10 个氨基酸残基被替代 ： N131A,E267A,G303A,H353 A,D387A,N389A,D438A,D472A,H473A,D472A-H473A。(A)Rv0888 蛋 白 与 endonuclease/ exonuclease/phosphatase 家族的其他成员的多序列比对。Query:Rv0888 ； #: 保守残基。 (B)10 个蛋白突变体与 Rv0888 蛋白的相对活性。试验反应条件为 ： 20mM Tris-HCl pH 6.5,5mM CaCl。
25、2and 5mM MnCl241孵育 1h。误差线代表标准差。 0031 图 7 为重组耻垢分枝杆菌在小鼠肺脏的持留 ； 0032 重组耻垢分支杆菌 pMV262/MS,Rv0888NS/MS 和 Rv0888S/MS 滴鼻感染 BALB/c 小 鼠， 在感染 4h,24h,4d,7d, 和 17d 时肺中细菌的载量。 0033 图 8 为小鼠肺脏的组织病理学分析 ； 0034 重组耻垢分支杆菌 pMV262/MS,Rv0888NS/MS 和 Rv0888S/MS 滴鼻感染 BALB/c 小鼠 7d， PBS 作为阴性对照。(A)PBS 对照 ； 无任何病理变化。(B)Pmv262/MS ； 。
26、无病理变化。(C) Rv0888NS/MS ； 轻度的肺泡上皮细胞增生。(D)Rv0888S/MS ； 轻度出血和肺泡上皮细胞增生。 0035 图 9 为 Rv0888 与其他细菌胞外核酸酶的多序列比对。 0036 Rv0888,S.pyogenes Sda 1(AAS09918),L.lactis YbfB(YP_001031529),S. pneumoniae EndA(CAA38134),S.agalactiae NucA(NP_735111) 的序列通过 MultAlin 软件 比对分析。 具体实施方式 0037 下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着。
27、 描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换， 但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 0038 实施例 1 结核分枝杆菌胞外核酸酶 Rv0888 的克隆及效果验证 0039 一、 材料与方法 0040 1.1 动物， 菌株和生长条件 0041 小鼠购自北京维通利华， 试验用的所有动物都遵循中华人民共和国黑龙江省科技 说 明 书 CN 105420212 A 6 5/10 页 7 厅黑龙江省动物伦理委员会的动物福利和伦理， 并且受哈尔滨兽医研究所动物。
28、福利委员会 的认可和监督。所有的试验尽可能的使用最少数量的小鼠， 并且尽最大可能的减少动物的 痛苦。 0042 耻 垢 分 支 杆 菌 (M.smegmatis) 在 含 有 10 OADC(oleic acid/albumin/ catalase enrichment， BD Biosciences)， 0.05 Tween-80(Amresco), 以及 0.2甘油 (Sigma-Aldrich) 的 Middlebrook 7H9(BD Biosciences) 培养中培养。E.coli DH5 菌株 用于质粒的准备， E.coli Rosetta 2 菌株用于蛋白的表达。所有的大肠杆菌。
29、 (E.coli) 都 在 LB 培养中培养。 0043 1.2 克隆与表达 0044 Rv0888 的 氨 基 酸 序 列 (SEQ ID NO.1 所 示 ) 用 在 线 服 务 SignalP 4.0server(http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 预 测 其 信 号 肽 序 列，以 结 核分枝杆菌 H37Rv 基因组为模板， 使用表 1 中的引物扩增 rv0888(SEQ ID NO.6 所 示 ),rv0888NS( 不含有信号肽， SEQ ID NO.4 所示 ) 以及 rv0888S 基因 ( 含有信号肽， SEQ ID NO.2 所示。
30、 )。PrimeSTAR Max DNA(TaKaRa Bio) 聚合酶用于 PCR 扩增。 0045 表 1 结核分枝杆菌 Rv0888 基因使用的引物 0046 0047 rv0888 扩增子连接 pET-22b 载体 (Novagen)， 在 C 端含有 6 个组氨酸标签， 随后重 组质粒 pET-22b-Rv0888 转化 Rosetta 2(DE3)E.coli。Rv0888 蛋白以包涵体的形式表达。 重组的 Rosetta 2(DE3)E.coli 在 LB 培养基 ( 含有 200g/mL 的氨苄和 34g/mL 的氯霉 素 ) 中 37培养 OD600 至 0.6-1.0， 然。
31、后加入 1mM 的 IPTG 在 37条件下诱导 4h。rv0888NS 和rv0888S扩增子连接pMV262载体， 重组质粒pMV262-Rv0888NS和pMV262-Rv0888S电转入 耻垢分支杆菌 (M.smegmatis mc2155)。重组耻垢分枝菌 (rMS) 在 37、 7H9 培养基 ( 含有 0.05Tween-80,0.2甘油,10OADC,50g/mL卡那霉素)中培养至OD600至0.8-1.0。 蛋白的表达情况通过 SDS-PAGE 进行分析。 0048 1.3 定点突变 0049 以互补突变的引物(表2)， 重组质粒pET-22b-Rv0888为模板， 使用Pr。
32、imeSTAR Max DNA 聚合酶 (TaKaRa Bio) 进行 PCR 扩增， 产生 10 个突变体 (N131A,E267A,G303A,H353A ,D387A,N389A,D438A,D472A,H473A,D472A-H473A)。PCR 产物用 Dpn 酶切， 破坏甲基化的 说 明 书 CN 105420212 A 7 6/10 页 8 DNA。突变的质粒转化 DH5 感受态细胞。所有的突变体通过测序验证其正确性。 0050 表 2 本文中使用的互补突变核苷酸 0051 0052 0053 1.4Rv0888 蛋白纯化 0054 收集 4L 含有 pET-22b-Rv0888。
33、 的 Rosetta 2(DE3)E.coli 细菌培养物， 菌体沉淀用 200mL buffer A(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,10glycerol,pH 8.0)重悬， 用高压破碎机 (Constant system USA,30kpsi) 在 4条件进行压力破碎， 4 1500rpm 离心 30min 收集沉 淀。沉淀用 buffer A 重悬超声 (350W,3s/3s,4 )10min， 4 1500rpm 离心 30min 收集沉 淀。沉淀再用 80mL 2M 尿素重悬， 于 4搅拌 4h， 4 1500rpm 离心 30min 在收集沉淀。沉 淀用 80m。
34、L buffer B(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,6M urea,20 glycerol,pH 8.0) 重悬， 说 明 书 CN 105420212 A 8 7/10 页 9 于 4条件下溶解过夜， 4 1500rpm 离心 30min， 弃沉淀留上清。 0055 上清用2L buffer C(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,5M urea,20glycerol,pH8.0) 透析， 每隔 12h 换一次透析液， 尿素下降 1M， 其他成分不变， 直到无尿素。透析后的蛋 白于 4条件下 15000rpm 离心 30min。上清过 Ni Sepharos。
35、e 6Fast Flow resin(GE Healthcare) 纯化柱， 用 60mL buffer E(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,10 glycerol,20mM imidazole,pH 8.0),60mL buffer F(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,10 glycerol,40mM imidazole,pH 8.0) 和 100mL buffer G(20mM Tris-HCl,1M NaCl,pH 8.0) 洗去未结合的 蛋白。用 5mL buffer H(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,10 glycerol 30。
36、0mM imidazole,pH 8.0) 和 5mL buffer I(20mM Tris-HCl,150mM NaCl,10 glycerol,500mM imidazole,pH 8.0) 洗脱目的蛋白。收集的蛋白用 SDS-PAGE 验证纯化效果。 0056 亲和层析纯化的蛋白的用30kDa的超滤管(Millipore)浓缩至2mL， 浓缩的蛋白过 预先用 buffer J(20mM Tris-HCl,pH 8.0) 平衡的 HiLoad 16/600Superdex 200pg 柱 (GE Healthcare)， 收集所有峰下的蛋白， 用 SDS-PAGE 进行分析验证。验证的蛋白。
37、在浓缩至 2mL 过预先用 buffer J 平衡的 Resource S 5mL 柱 (GE Healthcare)。目标蛋白用 0M-2M 的 NaCl 线性洗脱。收集的蛋白用 SDS-PAGE 进行分析验证。 0057 1.5Rv0888 蛋白的质谱分析 0058 纯化的蛋白跑 SDS-PAGE， 将含有目的蛋白的胶块切下， 切成 1mm3左右的小块， 装 入离心管中， 水洗一次 ； 然后用 50 (v/v)ACN/25mM 碳酸氢铵 (100L， pH 8.0) 脱色 15 分 钟。反复 3 次， 直至将颜色脱尽 ； 在用蒸馏水洗涤 1 次 ； 将胶块浸入 30L 100 ACN 中 。
38、5 分钟， 脱水， 胶块变白， 然后室温抽干 ； 加 8L Trypsin 酶液 (0.1mg/ml)， 37过夜 16h 左 右 ； 将 0.3uL 已酶解的样品加 0.3uL 的基质 (5mg/mL-cyano-4-hydroxycinnamic-acid(F luka)in 50(v/v)acetonitrile(Fisher)and0.1(w/v)trifluoroacetic acid(DIMA) 点到样品板上， 室温晾干， 用基质辅助的激光解析离子飞行时间质谱分析。 选用正离子反射 模式进行质谱分析， 结果用 4000Series 软件分析。利用以下参数 ： 肽片段分子质量容许误 。
39、差 (Precursor tol.) ： 0.2Da ； 二级片段容许误差 (MS/MS tol) ： 0.8Da ； 酶解片段不完 全 (missed cleavages) ： 1， 搜索 SwissProt 同源数据库验证目的蛋白。 0059 1.6Rv0888 核酸酶底物 0060 为了检测重组核酸酶 Rv0888 对底物的特异性。10L 的反应体系， 反应 buffer 为 ： 20mM Tris-HCl,5mM MgCl2,pH 7.5， 分别加入 0.2g 的线性 dsDNA(PCR 产物 )， 环状质 粒 DNA(pGEX-6p-1 质粒 )， 染色体 DNA( 大肠杆菌 DNA。
40、) 或者面包酵母 RNA(Sigma-Aldrich) 与 3g 纯化的 Rv0888 蛋白于 37水浴锅中反应。Buffer(20mM Tris-HCl pH 7.5) 代替 Rv0888蛋白作为阴性对照。 60min之后， 10L的反应溶液加入1L的10 x loading buffer 跑 1的核酸胶电泳进行分析。所有的试验重复三次。 0061 1.7 二价离子和金属螯合剂对 Rv0888 活性的影响 0062 二 价 离 子 通 常 是 脱 氧 核 糖 核 酸 酶 或 者 是 核 酸 酶 所 必 须 的。 二 价 离 子 对 核 酸 酶 活 性 的 影 响 测 定 方 法 如 下 ： 。
41、Rv0888 蛋 白 与 5mM 的 不 同 二 价 离 子 盐 (CaCl2,MgCl2,MnCl2,BaCl2,NiCl2) 和不同的二价离子盐组合 (CaCl2+MgCl2,CaCl2+MnCl2,Mg Cl2+MnCl2) 在 37条件下反应 1h。结果通过 1的核酸凝胶电泳进行分析。所有试验重复 三次。 说 明 书 CN 105420212 A 9 8/10 页 10 0063 1.8 温度和 pH 对 Rv0888 活性的影响 0064 使用最佳的二价离子和 20mM Tris-HCl 缓冲液 (pH 6.0-pH 8.0， 间隔 0.5)， 37 条件下反应 1h 检测不同 pH。
42、 对 Rv0888 活性的影响。使用最佳的二价离子和最佳的 pH 在 33 -51 ( 间隔 2 ) 的温度范围内检测不同温度对 Rv0888 活性的影响。所有的结果都 通过 1核酸凝胶电泳分析验证。Rv0888 的活性用之前报道的分光光度的方法进行定量。 200L 的反应体系 ： 20L10 x 反应 buffer(100mM Tris-HCl,50mM CaCl2,50mM MnCl2,pH 7.5) ； 20L 环状质粒 DNA(100ng/L pGEX-6p-1) ； 10L Rv0888 蛋白 (1mg/mL) ； 150L 灭菌水。于 37反应 1h， 加入 8L 0.5M EDT。
43、A 以终止反应。反应混合物用灭菌水稀释至 2mL， 用 NanophotometerTM Peal Ultramicro UV-Vis spectrophotometer 测定 260nm。在 41条件下， 每分钟降解底物的产物使 260nm 处吸光值增加 0.001 所需要的酶量定义为一 个酶活力单位 (U)。 0065 1.9Rv0888 核酸酶活性的动力学研究 0066 以小牛胸腺 DNA 和面包酵母 RNA 为底物， 使用分光光度法测定 Rv0888 核酸酶米氏 动力学的参数。在 41和 pH 6.5 条件下， 10g 纯化的 Rv0888 蛋白与不同浓度的小牛胸 腺 DNA(0.00。
44、625mg/mL,0.0125mg/mL,0.025mg/mL,0.05mg/mL,0.1mg/mL,0.2mg/mL,0.4mg/ mL,0.6mg/mL,0.8mg/mL ； RNA:0.00625mg/mL,0.0125mg/mL,0.025mg/mL,0.05mg/mL,0.1mg/ mL) 共同孵育。20mM Tris-HCl(pH 6.5) 代替 Rv0888 蛋白作为阴性对照。反应 1h 后， 加 入终浓度 5冰的高氯乙酸， 然后用灭菌水稀释至 2mL。稀释后的溶液用 NanophotometerTM Peal Ultramicro UV-Vis spectrophotomete。
45、r 测定 260nm。所有试验重复三次。 0067 1.10Rv0888 抑制剂筛选 0068 使用以下中药单体筛选 Rv0888 的抑制剂 ： 丹参素钠， 天麻素， 盐酸益母草碱， 红景 天苷溶于水 ； 橄榄苦苷， 绿原酸， 刺五加苷， 6- 姜酚， 西红花苷， 姜黄素， 白藜芦醇， 类叶升麻 苷， 虎杖苷， 松果菊苷， 香叶木素， 芦丁， 根皮苷， 黄芩苷， 柚皮苷， 杨梅素， 水飞蓟素， 蛇床子 素， 藤黄素， 新藤黄酸， 大黄酸， 葛根素溶于 50乙醇 ； 野漆树苷， 补骨脂乙素， 剑叶龙血素 C， 甲氧醉椒素， 格列喹酮， 紫檀芪， 姜黄醇， 菊苣酸， 龙血素 B， 盐酸罗格列酮， 。
46、左旋紫草溶于 50 DMSO ； - 倒捻子素， 哈巴俄苷， 阿魏酸松柏酯溶于 50甲醇。3g 纯化 Rv0888 蛋白 预先 37条件下与 0.3mM 不同中药单体孵育。对照用灭菌水， 50 DMSO， 50甲醇， 或者 50乙醇。活性参照以上所使用的测定方法。 0069 1.11 肺部感染 0070 肺部感染试验使用 5-6 周龄 SPF 雌性 BALB/c 小鼠 ( 北京维通利华 )。7H9 培养基 培养分别含有 pMV262、 无信号肽 Rv0888NS-pMV262 或有信号肽 Rv0888S-pMV262 的重组耻 垢分支杆菌， 收集对数生长期的菌体， 用 2mL PBS 洗两次备。
47、用。小鼠随机分成 4 组， 每组 15 只， 在感染之前用乙醚麻醉小鼠。50L PBS 重悬 2107cfu 重组耻垢分支杆菌滴鼻感染小 鼠， PBS 作为阴性对照。在感染 4h， 24h,4d,7d, 和 17d 之后， 每组处死 3 只小鼠。在无菌条 件下取出肺脏， 左肺研磨后涂于含有 50g/mL 的卡那霉素 LB 固体平板上， 37培养 3-4 天 用于菌落计数。大约右肺的 1/3 固定于 10福尔马林中用于组织病理学分析。 0071 每 个 实 验 都 重 复 三 次。 利 用 Prism 软 件 (version 5.0 ； GraphPad,San Diego,CA,USA) 分。
48、析数据， A 双侧检验用于统计数据的显著性。A P0.05 认为是显著的 (*P0.001)。 说 明 书 CN 105420212 A 10 9/10 页 11 0072 二结果 0073 2.1Rv0888 表达与纯化 0074 SignalP 服务预测结果显示 Rv0888 的 1-31 位氨基酸为其信号肽序列， 利用 H37Rv 基因组为模板克隆不带信号肽序列的 rv0888 基因片段。为了便于纯化在大肠杆菌中表达 了带有 6x His-tagged 的重组蛋白， 首先通过亲和层析纯化 ( 图 1A)。洗脱的 Rv0888 蛋白 过离子交换柱 ( 图 1B)， 最后过凝胶过滤层析柱， 。
49、获得超过 98纯度的蛋白 ( 图 1C)。 0075 2.2Rv0888 蛋白质谱验证 0076 纯化的 Rv0888 蛋白通过质谱分析并且肽质量指纹图谱结果提交 Mascot， 搜索 SwissProt 数据库。返回 10 个结果， 其中得分 78 的是来自于结核分枝杆菌 Rv0888 蛋白 (GeneBank Accession No.NP_215403.1)( 见图 1D)。 0077 2.3Rv0888 核酸酶活性的特异性 0078 为了证实Rv0888的核酸酶的活性， 纯化的蛋白与不同的核酸共同孵育(线性双链 DNA(PCR产物)， 环状质粒DNA(pGEX-6p-1载体)， 染色体DNA(大肠杆菌DNA)或者面包酵母 RNA)。结果显示 Rv0888 蛋白能降解所有的核酸底物 ( 图 2A 和 2B)。这些结果显示 Rv0888 是一个非特异性的核酸酶。 0079 2.4 二价离子和金属离子螯合剂对 Rv0888 活性的影响 0080 不同二价离子对 Rv0888 核酸酶活性影响试验结果表明， 无二价离子存在的情况 下， 检测不到 Rv0888 的核酸酶活性。酶活性在含有 5mM CaCl2和 5mM Mn。