一种-醇溶蛋白基因的核酸序列及其用途.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102618555 A (43)申请公布日 2012.08.01 CN 102618555 A *CN102618555A* (21)申请号 201210090872.2 (22)申请日 2012.03.30 C12N 15/29(2006.01) C07K 14/415(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 中国科学院成都生物研究所 地址 610041 四川省成都市武侯区人民南路 四段九号 (72)发明人 吴瑜 张静 李莉蓉 李竹林 鲁璐 李韵芳 林旭群 (74)专利代理机构 成都赛恩斯知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 512。

2、12 代理人 张帆 肖国华 (54) 发明名称 一种 - 醇溶蛋白基因的核酸序列及其用途 (57) 摘要 本发明公开了一种 - 醇溶蛋白基因的核酸 序列， 其基因序列为序列表中SEQ ID No.1所示的 核酸序列， 该醇溶蛋白缺失大片段的谷氨酰胺富 集区。本发明还公开了扩增 - 醇溶蛋白谷氨酰 胺富集区在内的编码框内引物标记小麦 SDS- 沉 降值水平的方法， 包括基因组 DNA 提取、 引物设 计、 基因扩增、 特异片段的验证。该方法中设计了 特征引物 P1， P2， 此特征引物可作为供试材料 SDS 沉降值水平高低的标记， 便于优质种植资源的筛 选， 加快品质育种的进程， 提高育种效率。。

3、 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种 - 醇溶蛋白基因的核酸序列， 其特征在于所述基因序列为序列表中 SEQ ID No.1 所示的核酸序列。 2. 根据权利要求 1 所述的 - 醇溶蛋白基因的核酸序列， 其特征在于该基因编码产物 缺失大片段的谷氨酰胺富集区。 3.一种-醇溶蛋白基因的氨基酸序列， 其特征在于所述基因序列为序列表中SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列。 4. 一种扩增 - 醇溶蛋白谷氨酰胺富集区在内的。

4、编码框内引物标记小麦 SDS- 沉降值 水平的方法， 包括基因组 DNA 提取、 引物设计、 基因扩增、 特异片段的验证， 其特征在于 ： 以 权利要求 1 所述的 - 醇溶蛋白基因的核酸序列进行引物设计， 开发特异分子标记。 5. 根据权利要求 4 所述的方法， 其特征在于所述的引物为 ： P1 ： 5 TCGTTGGTGTCATCCCTT3 ， P2 ： 5 GATGGTGGAGCAGTCAGG3 。 6. 根据权利要求 5 的方法， 其特征在于所述引物是根据权利要求 1 所述的 - 醇溶蛋 白基因的核酸序列为模板， 扩增的目标片段为 261bp。 7. 根据权利要求 4-6 任一项所述的。

5、方法， 其特征在于 ： 以引物 P1， P2 扩增 SDS 沉降值 水平不同的小麦基因组 DNA， 通过目标带型分析判断小麦粉 SDS 沉降值高低水平。 权 利 要 求 书 CN 102618555 A 2 1/6 页 3 一种 - 醇溶蛋白基因的核酸序列及其用途 技术领域 0001 本发明涉及一种 - 醇溶蛋白基因的核酸序列及其用途， 提供了分析不同 SDS 沉 降值水平的分子标记方法， 属于分子遗传育种领域， 专用于小麦优质专用品种的选育和种 植资源的评价利用。 背景技术 0002 小麦成熟籽粒蛋白质主要由醇溶蛋白和麦谷蛋白组成， 两者能形成一种具有弹性 和韧性的复合物， 称作面筋。麦谷蛋。

6、白主要决定面筋的弹性， 醇溶蛋白则赋予面筋延展性。 醇溶蛋白在酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (A-PAGE) 中分为 ( 最快 )、 、 、 ( 最慢 )4 个 区。大多数 - 醇溶蛋白和 - 醇溶蛋白分别由 1 号染色体短臂上的 Gli-1 和 Gli-3 位点 编码， 与 LMW-GS 编码位点 Glu-3 紧密连锁 ； - 醇溶蛋白一般由 6 号染色体短臂上的 Gli-2 位点编码。一般认为 3 个贮藏蛋白位点与小麦加工品质关系重要性依次为 ： Glu-1 Gli-1 Gli-2。目前已鉴定出一些与小麦品质相关的醇溶蛋白带或等位基因。 0003 多肽一级结构决定蛋白质的性质。- 醇溶蛋白的一级。

7、结构重复区中高密度的谷 氨酰胺区意味着有两两可形成氢键的 -OH， 很大程度上决定蛋白质的弹性。但醇溶蛋白组 分复杂不易纯化， 不同类型的醇溶蛋白具体影响面粉品质哪些方面还存在争议， 对其一级 结构功能区的研究还不够透彻。 因此很有必要在分子水平上进一步研究醇溶蛋白的分子机 理。 0004 SDS 沉降值与面筋质量密切相关。是衡量小麦面筋数量和质量以及面团流变学特 性的综合间接指标， 同时 SDS 沉降值基因型间遗传差异显著， 具有较高遗传力， 国内外许多 育种者倾向于利用 SDS 沉降值作为小麦加工品质的综合评价指标。采用 SDS 沉降值评价小 麦加工品质的局限是必须等到种子收获后才能进行选。

8、择和筛选， 在育种过程中易造成资源 的浪费。因此在小麦育种过程开发针对 SDS 沉降值水平的分子标记有非常重要的应用价 值。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种可以鉴定普通小麦 SDS- 沉降值水平高低的分子标记。 通过对目标带型的分析， 发现-醇溶蛋白谷氨酰胺富集区对小麦SDS-沉降值水平有正向 作用， 可用于评价和利用种植资源， 加快品质育种的进度。 0006 为达到本发明的目的， 本发明采用的技术方案如下 ： 0007 本发明以普通低面筋小麦总 DNA 为模板， 根据文献报道的 - 醇溶蛋白基因引物 (P3 ： 5 TATTAGTTAACGCAAATCCACTATG3 ， P4 。

9、： 5 GATGAATCAGCTAAGCAACGATG3 )， 利用 PCR 和 分子克隆技术分离 - 醇溶蛋白基因， 将获得的基因序列与 NCBI 数据库中的 - 醇溶蛋 白基因序列进行多重比对并分析其在一级结构上的异同， 结果表明我们克隆得到一个新型 -醇溶蛋白基因， 其编码的-醇溶蛋白缺失了大片段的IV谷氨酰胺富集区， 其核酸序列 如下 ： 说 明 书 CN 102618555 A 3 2/6 页 4 0008 1 TATTAGTTAA CGCAAATCCA CTATGAAGAC CTTCCTCATC 0009 41 CTAACGATCC TTGCGATGGC AACTACCATC GC。

10、CACCGCCA 0010 81 ATATGCAGGT CGGCTCCAGC GGCCAAGTAC AATGGCCACA 0011 121 ACATCAACAG CTCCCCCAGC CCCAACAACC ACTCTACCAT 0012 161 CAACCACAAC AAATATTTCC CCAACCCCGA CAAACATTCC 0013 201 CCCATCTACC ACAACAAACA TTTCCCCAAC CCCAACAAAC 0014 241 AATCCCCCAT CAACCACAAC AACAATTTCC CCAGACCCAA 0015 281 CAACCACTAC AACCATT。

11、TCC TCAGCCCCAA CAAACATTCC 0016 321 CCCAACAACC ACAACAACCA TTACCCCAAC CTCAACAACC 0017 361 CCAACAACCA TTTCCCCAGT CACAACAACC ACAACAACCA 0018 401 CAACAACCAT TTCCTCAGCC CCAACAACAA TTCCCGCAGC 0019 441 CCCAACAACC CCAACAATCA ATCCCCCAGC AACAACAACC 0020 481 ATTGATTCGG TCATCTCTAC AACAACAGAT GAACCCATGC 0021 521 。

12、AAGAATTTTC TCTTGCAGCA ATGCAACCCT GTGTCGTTGG 0022 561 TGTCATCCCT TGTGTCATTG ATCTTTCCTC GAAGTGATTG 0023 601 CCAGGTGATG CAGCTACAAT GTTGCCAACA ACTAGCACAG 0024 641 ATTCCACAGC AGCTGCAGTG TGCAGCCATC CATAGCGTCG 0025 681 TGCATTCCAT CATGATGCAG CAAGAACAAC AACAACCTCA 0026 721 ACAACTAGCT CACTTAGAGG TGATTAGGTC AT。

13、TGGTGTTG 0027 761 AAAACTCTTC AAACCATGTG CAATGTGTAT GTTCGACCTG 0028 801 ACTGCTCCAA CATCAGGACA CCATTTGCCA GCACAGTCGC 0029 841 CGGCATTGGC GGCCAATGAA AAAAGTTGGT GTTATGCTAA 0030 881 TAGGTAGATG GATCA 0031 以上序列为本发明人克隆得到的新型 - 醇溶蛋白的编码基因， 根据通用密码子 信息， 得到其推导的氨基酸序列如下 ： 0032 1 MKTFLILTIL AMATTIATAN MQVGSSGQVQ WPQ。

14、HQQLPQP 0033 41 QQPLYHQPQQ IFPQPRQTFP HLPQQTFPQP QQTIPHQPQQ 0034 81 QFPQTQQPLQ PFPQPQQTFP QQPQQPLPQP QQPQQPFPQS 0035 121 QQPQQPQQPF PQPQQQFPQP QQPQQSIPQQ QQPLIRSSLQ 0036 161 QQMNPCKNFL LQQCNPVSLV SSLVSLIFPR SDCQVMQLQC 0037 201 CQQLAQIPQQ LQCAAIHSVV HSIMMQQEQQ QPQQLAHLEV 0038 241 IRSLVLKTLQ TMCNVYVRP。

15、D CSNIRTPFAS TVAGIGGQ 0039 该蛋白序列与已公布的具有潜在功能的 - 醇溶蛋白序列多从比对发现， 缺失大 片段的谷氨酰胺富集区(图1)。 本发明的特异引物正是依据缺失区域前后保守序列设计的 编码框内引物 P1、 P2， 目的是通过扩增片段的大小， 判断小麦籽粒中 - 醇溶蛋白是否缺失 谷氨酰胺富集区。 0040 本发明还提供一种扩增 - 醇溶蛋白谷氨酰胺富集区在内的编码框内引物 标记小麦 SDS- 沉降值水平的方法， 包括基因组 DNA 提取、 引物设计 ( 该引物为 P1 ： 5 TCGTTGGTGTCATCCCTT3 ， P2 ： 5 GATGGTGGAGCAGTC。

16、AGG3 )、 基因扩增、 特异片段的验证， 其 说 明 书 CN 102618555 A 4 3/6 页 5 特征在于， 以上述新型 - 醇溶蛋白基因的核酸序列进行引物设计， 开发特异分子标记。 0041 所述引物是上述 - 醇溶蛋白基因的核酸序列为模板， 扩增的目标片段为 261bp， 而且以该引物 P1， P2 扩增 SDS 沉降值水平不同的小麦基因组 DNA， 通过目标带型分析判断 小麦粉 SDS 沉降值高低水平。 0042 在以低筋小麦材料 ( 川麦 32)DNA 为模板的扩增条件下， 引物 P1、 P2 能扩增出不同 长度的片段 ( 图 2)， 且以 260bp 为主要带型。 00。

17、43 PCR 反应组成 ： 0044 0045 PCR 反应程序 ： 0046 PCR 扩增产物在 2.0琼脂糖凝胶上分离， 100V 恒压电泳 60 分钟。 0047 由于经典的 - 醇溶蛋白含有谷氨酰胺富集区， 而本发明从普通小麦中克隆的新 型 - 醇溶蛋白编码序列缺失该区域。根据此特征， 设计特异性引物， 扩增 SDS 沉降值水平 差异较大的材料， 其扩增带型存在明显差异(图3)。 在高沉降值材料中， 以约400bp的带型 为主 ( 图 4) ； 而在低沉降值的材料中， 目标条带 ( 约 260bp) 清晰 ( 图 5)。从而根据带型特 征， 能很好地判断供试材料 SDS 沉降值的水平。。

18、推断此类 - 醇溶蛋白在普通小麦中存在 的规律， 说明 - 醇溶蛋白谷氨酰胺富集区对小麦品质有重要影响。 0048 本发明的有益效果 ： 0049 本发明是首次从分子水平检测小麦籽粒 SDS 沉降值高低水平， 种子用量少， 并且 有利于在育种中快速有目的地选择优质专用种植资源， 缩短育种年限。 效果快捷明显， 有良 好的应用前景。 说 明 书 CN 102618555 A 5 4/6 页 6 附图说明 0050 图 1 是本发明 - 醇溶蛋白序列与已知 - 醇溶蛋白序列多重比较结果， 缺失大 片段的 IV 谷氨酰胺富集区富集区 ； 0051 图 2 是引物对 P1、 P2 在低筋小麦川麦 32。

19、 中的扩增片段， 其中 M 为 Marker DM500 ； 0052 图 3 是引物对 P1、 P2 在不同 SDS 沉降值水平不同的两个材料中扩增结果。其中 1、 2 为低沉降值小麦， 3、 4 为高沉降值小麦， 其中 M 为 Marker DM500 ； 0053 图 4 是引物对 P1、 P2 在高 SDS 沉降值小麦材料中的扩增结果。约 400bp 的扩增带 为亮带， 其中 M 为 Marker DM500 ； 0054 图 5 是引物对 P1、 P2 在低 SDS 沉降值小麦材料中的扩增结果。260bp 条带为亮带， 其中 M 为 Marker DM500。 具体实施方式 0055。

20、 以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明， 但并非 对本发明的限制。 0056 实施例 1 ： 0057 1、 基因组 DNA 的提取 0058 采取 CTAB 法提取低筋小麦川麦 32 的基因组 DNA， 提取步骤如下 ： 0059 (1) 取 1 克新鲜又嫩叶片， 液氮研磨成粉后加 2*CTAB 提取液 1ml 混匀 ； 0060 (2)65水浴 30-60 分钟， 期间轻摇混匀。室温加入等体积的氯仿异戊醇 (24 1)， 轻摇混匀 10 分钟， 10000rpm 离心 10 分钟 ； 0061 (3) 取上清液， 加入等体积的异丙醇， 冰浴 30 分钟， 沉淀 D。

21、NA ； 0062 (4)10000rpm 离心 10 分钟， 弃上清， 70乙醇离心洗涤沉淀 2 次， 室温风干 DNA 沉 淀， 溶于适量灭菌蒸馏水中 ； 0063 (5)120V 恒压， 1琼脂糖凝胶电泳 20 分钟， 检测 DNA 浓度及质量。 0064 2、根 据 已 报 道 的 引 物 序 列 (P3 ： TATTAGTTAACGCAAATCCACTATG， P4 ： GATGAATCAGCTAAGCAACGATG) 进行 PCR 扩增， 扩增体系如下 ： 说 明 书 CN 102618555 A 6 5/6 页 7 0065 PCR 反应组成 ： 0066 PCR 反应程序 ： 。

22、0067 0068 3、 PCR 产物回收和纯化 0069 使用 Biomiga 的胶回收试剂盒， 操作均按照说明书进行。 0070 4、 连接和转化 0071 使用 Takara 的连接试剂盒将回收产物连接到 PMD-19T 载体， 操作按说明书进行 ； 将连接产物加入200l感受态细胞DH5(购于天根生化科技有限公司)， 充分混匀置于冰 上 30 分钟， 42热击 90 秒， 37振荡 (200rpm) 培养 45 分钟， 10000rpm 离心 3 分钟收集菌 体， 均匀涂于含氨苄青霉素 (100g/ml) 的 LB 固体培养基平板上， 37静止培养 16 小时 ； 0072 5、 阳性。

23、克隆的筛选 0073 (1) 挑取培养板上生长良好的白色单菌落， 在含氨苄青霉素 (100g/ml) 的 LB 固 体培养基平板上划线， 扩大培养 (37培养 12 小时 ) ； 0074 (2)挑取扩大培养后的菌进行PCR扩增， 同步将扩大培养后的菌接种于1ml含氨苄 青霉素 (100g/ml) 的 LB 液体培养基中， 37培养 6 小时 ； 0075 (3) 扩增产物在 1琼脂糖凝胶上分离， 100V 恒压 30 分钟， 检测有无目的片段。 0076 6、 序列测定与比对分析 0077 随机选取阳性克隆进行测序， 序列测定由华大基因完成。测序结果在 NCBI 数据库 中进行比对， 采用 。

24、DNAMAN 和 MEGA 软件进行序列分析。 0078 7、 根据 - 醇溶蛋白谷氨酰胺富集区编码序列前后保守区域， 使用 primer 说 明 书 CN 102618555 A 7 6/6 页 8 premier5软件设计特异引物对P1、 P2， 以新克隆的-醇溶蛋白基因为模板， 其目标片段为 260bp 左右。 0079 8、 材料选择及 DNA 的提取 0080 选择本实验室保存的材料100份， 三年内测定的微量SDS沉降值数据稳定 ； 材料包 含不同 SDS 沉降值水平。采用 CTAB 提取所选材料的 DNA。 0081 9、 以引物对 P1， P2 扩增所选材料 100 份， 扩增带型与材料的 SDS 沉降值水平完全 相符 ( 图 4、 图 5)。因此推断低沉降值小麦中 - 醇溶蛋白谷氨酰胺富集区缺失的类型较 多， 而高沉降值小麦中 - 醇溶蛋白的类型很少或几乎不存在谷氨酰胺富集区的缺失。该 分子标记能有效用于小麦材料 SDS 沉降值水平的筛选。 说 明 书 CN 102618555 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102618555 A 9 2/2 页 10 图 5 说 明 书 附 图 CN 102618555 A 10 。