说明书取代的苯氧基吡啶
技术领域
本发明涉及如本文所描述和定义的取代的苯氧基吡啶（下文称作“通式(I)的化合物”）、制备所述化合物的方法、用于制备所述化合物的中间体、包含所述化合物的药物组合物和组合、以及所述化合物作为单一药剂或与其他活性成分组合用于制备治疗或预防疾病、特别是过度增殖性和/或血管发生病症的药物组合物的用途。
发明背景
癌症是由组织异常生长导致的疾病。某些癌症具有侵袭进入局部组织的潜力，也能转移至远端器官。该疾病可以在很多种不同的器官、组织和细胞类型中形成。因此，术语“癌症”指超过一千种不同疾病的集合。
2002年，全世界有超过四百四十万人被诊断患有乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌或前列腺癌，并且超过两百五十万人死于这些破坏性疾病(Globocan2002Report)。仅在美国，预计2005年有超过一百二十五万新病例和超过500000死于癌症。预计这些新病例中的大多数为结肠癌(～100000)、肺癌(～170000)、乳腺癌(～210000)和前列腺癌(～230000)。预计在接下来的10年中，癌症的发病率和患病率都会增加约15%，反映出1.4%的平均增长[1]。
越来越多的证据表明，癌症可以看作“信号转导疾病”，其中，影响癌基因和肿瘤抑制基因的表达和/或功能的细胞基因组的改变会最终影响正常调节细胞生长、分化和程序性细胞死亡（凋亡）的信号的传导。阐明人类癌症中失调的信号转导途径已经形成了越来越多的基于机制的治疗剂的设计[2]。近来，作为人类恶性肿瘤的治疗策略的信号转导抑制得到显著的成功，例如用于治疗慢性髓性白血病(CML)和胃肠间质瘤的Gleevec的开发，预示了“分子靶向”治疗的新纪元[3‑5]。
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)模块是信号转导级联的关键整合点，其将各种细胞外刺激与增殖、分化和存活联系起来。过去二十年的科学研究 已形成了该途径的非常详细的分子解剖，该途径现已发展到包括五个具有不同分子特征和功能特征的不同MAPK亚家族[细胞外信号调节激酶ERK‑1/2、c‑Jun‑N‑端激酶(JNK)、p38激酶、ERK‑3/4和ERK‑5][6‑8]。虽然诸如p38家族的某些亚家族正变为炎性疾病和退行性疾病的治疗靶点，但是由Ras向ERK‑1/2进行的MAPK级联（由肽类生长因子启动的主要的丝裂原途径）开始显现为不同类型人类癌症的分子治疗的主要靶点[9‑11]。在许多人类肿瘤中，由于基因变化及后生变化，MAPK途径被异常激活，导致增殖增加和对凋亡刺激的抗性。具体而言，在50%的结肠癌和>90%的胰腺癌中发现了Ras的突变的癌基因形式。最近，在>60%的恶性黑素瘤中发现了BRAF突变[13]。这些突变导致组成性激活的MAPK途径。此外，某些受体酪氨酸激酶的过度表达或突变激活也可导致Raf‑MEK‑ERK途径激活增加。
在由MEK调节的交叉点处，Raf/MEK/ERK级联的模块性质变为较低的多效性[14]。尚未鉴定出除ERK‑1/2之外的MEK底物。磷酸化的ERK是MEK活性的产物，因此，其在癌细胞和肿瘤组织中的检测提供了MEK抑制的直接测量。MEK对ERK1/2的选择性（与对于双重磷酸化的和激活形式的ERK具有特异性的抗体的有效性（availability）相关）使MEK成为抗癌药物开发感兴趣的靶点。另外，最近表明，MEK激活调节基质矿化作用(Blood2007,40,68)，MEK活性的调节由此也可以适用于由组织矿化作用失调导致或伴有组织矿化作用失调的疾病的治疗，更特别地适用于由骨矿化作用失调导致或伴有骨矿化作用失调的疾病的治疗。
第一代MEK抑制剂PD98059[15]和U0126[16]未表现出与ATP竞争，并因此可能具有不同的MEK结合位点；这些化合物已广泛地用于体外和体内模型系统，将生物活性归因于ERK1/2。第二代MEK1/2抑制剂PD184352(现称作CI‑1040)的IC50在纳摩尔的低范围内，具有提高的生物利用度，而且还似乎通过变构的非ATP竞争机制起作用[17]。已表明，用CI‑1040口服治疗抑制在小鼠模型中的体内结肠癌生长[18]，而且已在I/II期临床试验中评价了该化合物，其在所述临床试验中由于效力不足而最终失败[19]。近来，其他变构的MEK抑制剂进入临床，但是发现具有例如暴露谱（exposure profile）差、效力有限和/或组织毒性的局限。小分子MEK抑制剂已有公开，包括在美国专利申请公开2003/0232869、 2004/0116710、2003/0216420中以及在美国专利申请10/654580和10/929295中，它们各自通过援引加入本文。在过去几年中出现了许多其他的专利申请，包括美国专利55256625；WO98/43960；WO99/01421；WO99/01426；WO00/41505；WO00/41994；WO00/42002；WO00/42003；WO00/42022；WO00/42029；WO00/68201；WO01/68619；WO02/06213；WO03/077914；WO03/077855；WO04/083167；WO05/0281126；WO05/051301；WO05/121142；WO06/114466；WO98/37881；WO00/35435；WO00/35436；WO00/40235；WO00/40237；WO01/05390；WO01/05391；WO01/05392；WO01/05393；WO03/062189；WO03/062191；WO04/056789；WO05/000818；WO05/007616；WO05/009975；WO05/051300；WO05/051302；WO05/028426；WO06/056427；WO03/035626；和WO06/029862。
尽管本领域有所进展，但是仍然需要癌症治疗和抗癌化合物。更具体地，仍然需要结构新颖的、具有平衡的效力‑性质谱的MEK抑制剂。特别希望鉴别包含以前尚未被证明与有效的MEK抑制相容的结构模体的新MEK抑制剂。如果这些结构模体还允许提高MEK效力和/或调节化合物性质（包括理化性质、药效学性质和药代动力学性质），那么会是特别有利的。
WO2006/045514A1(Applied Research Systems ARS Holding N.V.)涉及3‑芳基氨基吡啶衍生物。此类化合物是MEK抑制剂并可用于治疗过度增殖性疾病，例如癌症、再狭窄和炎症。
WO2008/138639(Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft)涉及取代的苯并氨基苯化合物、包含此类化合物的药物组合物以及此类化合物或组合物用于治疗过度增殖性病症和/或血管生成病症的用途。发现所述化合物是有效的选择性MEK抑制剂。所述化合物衍生自1‑取代的‑2‑苯基氨基苯基骨架，所述苯基骨架的6‑位具有进一步特定取代的侧链。该发现是令人惊讶的，因为已公布的苯基骨架衍生的MEK抑制剂的调查和以前的结构‑活性关系分析(参见例如Haile Tecle/Pfizer Global Research:“MEK inhibitors”,2006年6月15日发表于Drew University)表明，在基于苯基骨架的MEK抑制剂中，较大的6‑取代基对于获得高MEK抑制效力而言是有害的。所述化合物是有效的MEK抑制剂，并且抑制MEK‑ERK途径的激活。
但是，上述背景技术没有具体记载如本文描述和定义的并在下文中称作“本发明化合物”的本发明通式(I)的化合物、其立体异构体、互变异构体、N‑氧化物、水合物、溶剂合物或盐、或者它们的混合物、或它们的药理活性，所述化合物携带在所示吡啶环的4‑位的特定–C(=O)NHR3取代基和在所示吡啶环的3(5)‑位的特定取代的氧原子。
现已发现所述本发明的化合物具有令人惊讶的有利性质，这构成了本发明的基础。
具体而言，已表明，所述本发明的化合物在A375增殖测定中具有极高活性，这由本说明书末尾表格提供的生物学结果表明。对于药物化学领域的技术人员而言，本发明的化合物会具有这样水平的活性是非显而易见的：所述本发明的化合物的确有效地强力抑制癌细胞增殖。
而且，所述化合物可具有显著降低的对人类碳酸酐酶的亲和性。本领域技术人员已知，对人类碳酸酐酶的亲和性导致相应化合物在人类红细胞中的不希望的蓄积。
另外，所述化合物可具有显著改善的CYP抑制谱，改善到CYP不可被检测到的程度。
鉴于此，所述本发明的通式(I)的化合物因此可用于治疗或预防由不受控制的细胞生长、增殖和/或存活、不适当的细胞免疫应答或不适当的细胞炎症应答引起的疾病、或者伴有不受控制的细胞生长、增殖和/或存活、不适当的细胞免疫应答或不适当的细胞炎症应答的疾病，特别地，其中所述不受控制的细胞生长、增殖和/或存活、不适当的细胞免疫应答或不适当的细胞炎症应答是由丝裂原活化蛋白激酶(MEK‑ERK)途径介导的，例如血液肿瘤、实体瘤和/或它们的转移，例如白血病和骨髓增生异常综合征、恶性淋巴瘤、包括脑瘤和脑转移在内的头颈部肿瘤、包括非小细胞肺肿瘤和小细胞肺肿瘤在内的胸部肿瘤、胃肠道肿瘤、内分泌肿瘤、乳腺肿瘤和其他妇科肿瘤、包括肾肿瘤、膀胱瘤和前列腺瘤在内的泌尿系统肿瘤、皮肤肿瘤和肉瘤、和/或它们的转移。
发明内容
根据第一个方面，本发明包括通式(I)的化合物、或者其互变异构体、立体异构体、N‑氧化物、盐、水合物或溶剂合物：
其中：
R1是芳基、杂芳基、C1‑C6‑烷基、C2‑C6‑烯基、C3‑C6‑环烷基或3‑至7‑元杂环烷基基团，
所述基团被一个或多个选自以下的取代基取代：
‑卤原子，或‑CN，C1‑C6‑烷基‑，卤代‑C1‑C6‑烷基‑，H2N‑C1‑C6‑烷基‑，R(R’)N‑C1‑C6‑烷基‑，HO‑C1‑C6‑烷基，被两个OH取代的C1‑C6‑烷基，C1‑C6‑烷氧基‑C1‑C6‑烷基‑，卤代‑C1‑C6‑烷氧基‑C1‑C6‑烷基‑，C3‑C6‑环烷基‑C1‑C6‑烷基‑，3‑至7‑元杂环烷基‑C1‑C6‑烷基‑，芳基‑C1‑C6‑烷基‑，杂芳基‑C1‑C6‑烷基‑，‑C(=O)R，‑C(=O)NH2，‑C(=O)N(H)R,‑C(=O)N(R)R’，‑C(=O)OH，‑C(=O)OR，‑NH2，‑N(H)R，‑N(R)R’，‑N(H)C(=O)H，‑N(H)C(=O)R，‑N(R)C(=O)R’，‑N(H)C(=O)NH2，‑N(H)C(=O)N(H)R，‑N(H)C(=O)N(R)R’，‑N(R)C(=O)NH2，‑N(R)C(=O)N(H)R’，‑N(R)C(=O)N(R’)R’’，‑N(H)C(=O)OR，‑N(R)C(=O)OR’，‑NO2，‑N(H)S(=O)R，‑N(R)S(=O)R’，‑N(H)S(=O)NH2，‑N(H)S(=O)N(H)R，‑N(H)S(=O)N(R)R’，‑N(R)S(=O)NH2，‑N(R)S(=O)N(H)R’，‑N(R)S(=O)N(R’)R’’，‑N(H)S(=O)2R，‑N(H)S(=O)2‑C3‑C6‑环烷基，‑N(R)S(=O)2R’，‑N(H)S(=O)2NH2，‑N(H)S(=O)2N(H)R，‑N(H)S(=O)2N(R)R’，‑N(R)S(=O)2NH2，‑N(R)S(=O)2N(H)R’，‑N(R)S(=O)2N(R’)R’’，‑N=S(=O)(R)R’，‑OH，C1‑C6‑烷氧基‑，‑OC(=O)H，‑OC(=O)R，‑OC(=O)NH2，‑OC(=O)N(H)R，‑OC(=O)N(R)R’，‑OC(=O)OR，‑SH，C1‑C6‑烷基‑S‑，‑SC(=O)NH2，‑SC(=O)N(H)R，‑SC(=O)N(R)R’，‑S(=O)2R，‑S(=O)2NH2，‑S(=O)2N(H)R，‑S(=O)2N(R)R’或‑S(=O)(=NR)R’基团；
R2是卤原子、C2‑C6‑炔基或‑S‑C1‑C6‑烷基基团；
R3选自氢原子、C1‑C6烷基、C3‑C6‑环烷基、3‑至7‑元杂环烷基、芳基或杂芳基基团，所述C1‑C6烷基、C3‑C6‑环烷基、芳基或杂芳基任选地被‑OH、‑NH2、‑N(H)R、‑N(R)R’、卤原子、氰基或C1‑C6‑烷氧基以相同或不同方式取代一次或多次；
R、R’和R’’相互独立地是C1‑C6‑烷基基团。
定义
本文中提及的术语优选具有如下含义：
术语“卤原子”或“卤素/卤代”应理解为氟、氯、溴或碘原子。
术语“C1‑C6‑烷基”应理解为优选表示具有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链或支链的饱和一价烃基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2‑甲基丁基、1‑甲基丁基、1‑乙基丙基、1,2‑二甲基丙基、新戊基、1,1‑二甲基丙基、4‑甲基戊基、3‑甲基戊基、2‑甲基戊基、1‑甲基戊基、2‑乙基丁基、1‑乙基丁基、3,3‑二甲基丁基、2,2‑二甲基丁基、1,1‑二甲基丁基、2,3‑二甲基丁基、1,3‑二甲基丁基或1,2‑二甲基丁基或它们的异构体。特别地，所述基团具有1、2或3个碳原子（“C1‑C3‑烷基”），甲基、乙基、正丙基或异丙基。
术语“卤代‑C1‑C6‑烷基”应理解为优选表示直链或支链的饱和一价烃基，其中术语“C1‑C6‑烷基”如上所定义，并且其中一个或多个氢原子以相同或不同的方式被卤素原子代替，即卤素原子之间相互独立。特别地，所述卤素原子为F。所述卤代‑C1‑C6‑烷基是例如‑CF3、‑CHF2、‑CH2F、‑CF2CF3或‑CH2CF3。
术语“C1‑C6‑烷氧基”应理解为优选表示式‑O‑烷基的直链或支链的饱和一价烃基，其中术语“烷基”如上所定义，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、戊氧基、异戊氧基或正己氧基、或它们的异构体。
术语“卤代‑C1‑C6‑烷氧基”应理解为优选表示其中一个或多个氢原子以相同或不同的方式被卤素原子代替的如上所定义的直链或支链的饱和一价C1‑C6‑烷氧基。特别地，所述卤素原子是F。所述卤代‑C1‑C6‑烷氧基是例如‑OCF3、‑OCHF2、‑OCH2F、‑OCF2CF3或‑OCH2CF3。
术语“C1‑C6‑烷氧基‑C1‑C6‑烷基”应理解为优选表示其中一个或多个氢 原子以相同或不同的方式被如上所定义的‑C1‑C6‑烷氧基代替的如上所定义的直链或支链的饱和一价烷基或它们的异构体，例如甲氧基烷基、乙氧基烷基、丙氧基烷基、异丙氧基烷基、丁氧基烷基、异丁氧基烷基、叔丁氧基烷基、仲丁氧基烷基、戊氧基烷基、异戊氧基烷基、己氧基烷基，其中术语“C1‑C6‑烷基”如上所定义。
术语“卤代‑C1‑C6‑烷氧基‑C1‑C6‑烷基”应理解为优选表示其中一个或多个氢原子以相同或不同的方式被卤素原子代替的如上所定义的直链或支链的饱和一价‑C1‑C6‑烷氧基‑C1‑C6‑烷基。特别地，所述卤素原子是F。所述卤代‑C1‑C6‑烷氧基‑C1‑C6‑烷基是例如‑CH2CH2OCF3、‑CH2CH2OCHF2、‑CH2CH2OCH2F、‑CH2CH2OCF2CF3或‑CH2CH2OCH2CF3。
术语“C2‑C6‑烯基”应理解为优选表示直链或支链的一价烃基，其包含一个或多个双键并且具有2、3、4、5或6个碳原子，特别是2或3个碳原子(“C2‑C3‑烯基”)，应理解，在所述烯基包含多于一个双键的情况下，所述双键可相互分离或者共轭。所述烯基是例如乙烯基、烯丙基、(E)‑2‑甲基乙烯基、(Z)‑2‑甲基乙烯基、高烯丙基、(E)‑丁‑2‑烯基、(Z)‑丁‑2‑烯基、(E)‑丁‑1‑烯基、(Z)‑丁‑1‑烯基、戊‑4‑烯基、(E)‑戊‑3‑烯基、(Z)‑戊‑3‑烯基、(E)‑戊‑2‑烯基、(Z)‑戊‑2‑烯基、(E)‑戊‑1‑烯基、(Z)‑戊‑1‑烯基、己‑5‑烯基、(E)‑己‑4‑烯基、(Z)‑己‑4‑烯基、(E)‑己‑3‑烯基、(Z)‑己‑3‑烯基、(E)‑己‑2‑烯基、(Z)‑己‑2‑烯基、(E)‑己‑1‑烯基、(Z)‑己‑1‑烯基、异丙烯基、2‑甲基丙‑2‑烯基、1‑甲基丙‑2‑烯基、2‑甲基丙‑1‑烯基、(E)‑1‑甲基丙‑1‑烯基、(Z)‑1‑甲基丙‑1‑烯基、3‑甲基丁‑3‑烯基、2‑甲基丁‑3‑烯基、1‑甲基丁‑3‑烯基、3‑甲基丁‑2‑烯基、(E)‑2‑甲基丁‑2‑烯基、(Z)‑2‑甲基丁‑2‑烯基、(E)‑1‑甲基丁‑2‑烯基、(Z)‑1‑甲基丁‑2‑烯基、(E)‑3‑甲基丁‑1‑烯基、(Z)‑3‑甲基丁‑1‑烯基、(E)‑2‑甲基丁‑1‑烯基、(Z)‑2‑甲基丁‑1‑烯基、(E)‑1‑甲基丁‑1‑烯基、(Z)‑1‑甲基丁‑1‑烯基、1,1‑二甲基丙‑2‑烯基、1‑乙基丙‑1‑烯基、1‑丙基乙烯基、1‑异丙基乙烯基、4‑甲基戊‑4‑烯基、3‑甲基戊‑4‑烯基、2‑甲基戊‑4‑烯基、1‑甲基戊‑4‑烯基、4‑甲基戊‑3‑烯基、(E)‑3‑甲基戊‑3‑烯基、(Z)‑3‑甲基戊‑3‑烯基、(E)‑2‑甲基戊‑3‑烯基、(Z)‑2‑甲基戊‑3‑烯基、(E)‑1‑甲基戊‑3‑烯基、(Z)‑1‑甲基戊‑3‑烯基、(E)‑4‑甲基戊‑2‑烯基、(Z)‑4‑甲基戊‑2‑烯基、(E)‑3‑甲基戊‑2‑烯基、(Z)‑3‑甲基戊‑2‑烯基、(E)‑2‑甲基戊‑2‑烯基、(Z)‑2‑甲基戊‑2‑ 烯基、(E)‑1‑甲基戊‑2‑烯基、(Z)‑1‑甲基戊‑2‑烯基、(E)‑4‑甲基戊‑1‑烯基、(Z)‑4‑甲基戊‑1‑烯基、(E)‑3‑甲基戊‑1‑烯基、(Z)‑3‑甲基戊‑1‑烯基、(E)‑2‑甲基戊‑1‑烯基、(Z)‑2‑甲基戊‑1‑烯基、(E)‑1‑甲基戊‑1‑烯基、(Z)‑1‑甲基戊‑1‑烯基、3‑乙基丁‑3‑烯基、2‑乙基丁‑3‑烯基、1‑乙基丁‑3‑烯基、(E)‑3‑乙基丁‑2‑烯基、(Z)‑3‑乙基丁‑2‑烯基、(E)‑2‑乙基丁‑2‑烯基、(Z)‑2‑乙基丁‑2‑烯基、(E)‑1‑乙基丁‑2‑烯基、(Z)‑1‑乙基丁‑2‑烯基、(E)‑3‑乙基丁‑1‑烯基、(Z)‑3‑乙基丁‑1‑烯基、2‑乙基丁‑1‑烯基、(E)‑1‑乙基丁‑1‑烯基、(Z)‑1‑乙基丁‑1‑烯基、2‑丙基丙‑2‑烯基、1‑丙基丙‑2‑烯基、2‑异丙基丙‑2‑烯基、1‑异丙基丙‑2‑烯基、(E)‑2‑丙基丙‑1‑烯基、(Z)‑2‑丙基丙‑1‑烯基、(E)‑1‑丙基丙‑1‑烯基、(Z)‑1‑丙基丙‑1‑烯基、(E)‑2‑异丙基丙‑1‑烯基、(Z)‑2‑异丙基丙‑1‑烯基、(E)‑1‑异丙基丙‑1‑烯基、(Z)‑1‑异丙基丙‑1‑烯基、(E)‑3,3‑二甲基丙‑1‑烯基、(Z)‑3,3‑二甲基丙‑1‑烯基、1‑(1,1‑二甲基乙基)乙烯基、丁‑1,3‑二烯基、戊‑1,4‑二烯基、己‑1,5‑二烯基或甲基己二烯基。特别地，所述基团是乙烯基或烯丙基。
术语“C2‑C6‑炔基”应理解为优选表示直链或支链的一价烃基，其包含一个或多个叁键并且包含2、3、4、5或6个碳原子，特别是2或3个碳原子(“C2‑C3‑炔基”)。所述C2‑C6‑炔基是例如乙炔基、丙‑1‑炔基、丙‑2‑炔基、丁‑1‑炔基、丁‑2‑炔基、丁‑3‑炔基、戊‑1‑炔基、戊‑2‑炔基、戊‑3‑炔基、戊‑4‑炔基、己‑1‑炔基、己‑2‑炔基、己‑3‑炔基、己‑4‑炔基、己‑5‑炔基、1‑甲基丙‑2‑炔基、2‑甲基丁‑3‑炔基、1‑甲基丁‑3‑炔基、1‑甲基丁‑2‑炔基、3‑甲基丁‑1‑炔基、1‑乙基丙‑2‑炔基、3‑甲基戊‑4‑炔基、2‑甲基戊‑4‑炔基、1‑甲基戊‑4‑炔基、2‑甲基戊‑3‑炔基、1‑甲基戊‑3‑炔基、4‑甲基戊‑2‑炔基、1‑甲基戊‑2‑炔基、4‑甲基戊‑1‑炔基、3‑甲基戊‑1‑炔基、2‑乙基丁‑3‑炔基、1‑乙基丁‑3‑炔基、1‑乙基丁‑2‑炔基、1‑丙基丙‑2‑炔基、1‑异丙基丙‑2‑炔基、2,2‑二甲基丁‑3‑炔基、1,1‑二甲基丁‑3‑炔基、1,1‑二甲基丁‑2‑炔基或3,3‑二甲基丁‑1‑炔基。特别地，所述炔基是乙炔基、丙‑1‑炔基或丙‑2‑炔基。
术语“C3‑C6‑环烷基”应理解为优选表示饱和的一价单环或双环烃环，其包含3、4、5或6个碳原子。所述C3‑C6‑环烷基是例如单环烃环如环丙基、环丁基、环戊基或环己基基团，或者是双环烃环如全氢并环戊二烯(perhydropentalenylene)或十氢化萘环。所述环烷基环可任选包含一个或多 个双键，例如环烯基如环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基或环己烯基，其中所述环与分子其他部分之间的键(无论是饱和或是不饱和)可在所述环的任意碳原子上。
术语“亚烷基”应理解为优选表示具有1、2、3、4、5或6个碳原子的被任选取代的烃链（或“链”），即任选取代的‑CH2‑（“亚甲基”或“一元链”或例如‑C(Me)2‑）、‑CH2‑CH2‑（“亚乙基”、“二亚甲基”或“二元链”）、‑CH2‑CH2‑CH2‑（“亚丙基”、“三亚甲基”或“三元链”）、‑CH2‑CH2‑CH2‑CH2‑（“亚丁基”、“四亚甲基”或“四元链”）、‑CH2‑CH2‑CH2‑CH2‑CH2‑（“亚戊基”、“五亚甲基”或“五元链”）或‑CH2‑CH2‑CH2‑CH2‑CH2‑CH2‑（“亚己基”、“六亚甲基”或“六元链”）。特别地，所述亚烷基链具有1、2、3、4或5个碳原子，更特别地，具有1或2个碳原子。
术语“3‑至7‑元杂环烷基”应理解为表示饱和的一价单环或双环烃环，其包含2、3、4、5或6个碳原子和一个或多个选自以下的含杂原子的基团：C(=O)、O、S、S(=O)、S(=O)2、NRa，其中Ra表示氢原子、C1‑C6‑烷基‑、或卤代C1‑C6‑烷基‑；应理解，所述杂环烷基可以通过所述碳原子中的任何一个或者任选存在的氮原子与分子的其余部分连接。
特别地，所述3‑至7‑元杂环烷基可包含2、3、4或5个碳原子和一个或多个上文提及的含杂原子的基团（“3‑至7‑元杂环烷基”），更特别地，所述杂环烷基可包含4或5个碳原子和一个或多个上文提及的含杂原子的基团（“5‑至7‑元杂环烷基”）。
特别地，所述杂环烷基可以是例如但不限于4‑元环，例如氮杂环丁烷基、环氧丙烷基(oxetanyl)，或5‑元环，例如四氢呋喃基、间二氧杂环戊烷基(dioxolinyl)、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、吡咯啉基，或6‑元环，例如四氢吡喃基、哌啶基、吗啉基、二噻烷基、硫代吗啉基、哌嗪基、或三噻烷基，或7‑元环，例如二氮杂环庚烷基(diazepanyl)环。任选地，所述杂环烷基环可以是苯并稠合的。
所述杂环基可以是双环的，例如但不限于5,5‑元环例如六氢环戊二烯并[c]吡咯‑2(1H)‑基)环、或5,6‑元双环例如六氢吡咯并[1,2‑a]吡嗪‑2(1H)‑基环或例如。
如上所述，所述含氮原子的环可以是部分不饱和的，即，它可以包含一个或多个双键，例如但不限于2,5‑二氢‑1H‑吡咯基、4H‑[1,3,4]噻二嗪 基、4,5‑二氢噁唑基或4H‑[1,4]噻嗪基环，或者，它可以是苯并稠和的，例如但不限于二氢异喹啉基环。
术语“芳基”应理解为优选表示具有6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳原子的一价、芳香性或部分芳香性的、单环、双环或三环烃环（“C6‑C14‑芳基”），特别是具有6个碳原子的环（“C6‑芳基”），例如苯基；或联苯基，或者是具有9个碳原子的环（“C9‑芳基”），例如茚满基或茚基，或者是具有10个碳原子的环（“C10‑芳基”），例如四氢化萘基、二氢萘基或萘基，或者是具有13个碳原子的环（“C13‑芳基”），例如芴基，或者是具有14个碳原子的环（“C14‑芳基”），例如蒽基。芳基的具体实例是以下可能的结构之一：
其中z表示O、S、NH或N(C1‑C6‑烷基)，并且*指示所述芳基与分子的其余部分的连接点。
术语“杂芳基”应理解为优选表示这样的一价单环、双环或三环的芳香性环系统，其具有5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个环原子（“5‑至14‑元杂芳基”），特别是5或6或9或10个碳原子，且其包含至少一个可以相同或不同的杂原子（所述杂原子是诸如氧、氮或硫），另外，其在每一种情况下可为苯并稠合的。特别地，杂芳基选自噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、噻‑4H‑吡唑基等以及它们的苯并衍生物，例如苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并咪唑基、苯并三唑基、吲唑基、吲哚基、异吲哚基等；或吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基等，以及它们的苯并衍生物，例如喹啉基、喹唑啉基、异喹啉基等；或吖辛因基(azocinyl)、吲嗪基、嘌呤基等以及它们的苯并衍生物；或噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基(naphthpyridinyl)、蝶啶基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、呫吨基或氮杂 基等。
一般而言并且除非另有说明，所述杂芳基或亚杂芳基包括其所有可能的异构形式，例如其位置异构体。因此，对于一些说明性的非限制性实例，术语吡啶基或亚吡啶基包括吡啶‑2‑基、亚吡啶‑2‑基、吡啶‑3‑基、亚 吡啶‑3‑基、吡啶‑4‑基和亚吡啶‑4‑基；或者，术语噻吩基或亚噻吩基包括噻吩‑2‑基、亚噻吩‑2‑基、噻吩‑3‑基和亚噻吩‑3‑基。
如本文通篇使用，术语“C1‑C6”在“C1‑C6‑烷基”、“C1‑C6‑卤代烷基”、“C1‑C6‑烷氧基”或“C1‑C6‑卤代烷氧基”的定义的语境中应理解为表示具有1‑6个有限数量的碳原子，即1、2、3、4、5或6个碳原子的烷基。还应理解，所述术语“C1‑C6”应理解为包含于其中的任意亚范围，例如C1‑C6、C2‑C5、C3‑C4、C1‑C2、C1‑C3、C1‑C4、C1‑C5、C1‑C6；特别是C1‑C2、C1‑C3、C1‑C4、C1‑C5、C1‑C6；更特别地是C1‑C4；在“C1‑C6‑卤代烷基”或“C1‑C6‑卤代烷氧基”的情况中，更特别地是C1‑C2。
相似地，本文使用的术语“C2‑C6”，如在本文中通篇使用，例如在“C2‑C6‑烯基”和“C2‑C6‑炔基”的定义的语境中应理解为表示具有2‑6个有限数量的碳原子，即2、3、4、5或6个碳原子的烯基或炔基。还应理解，所述术语“C2‑C6”应理解为包含于其中的任意亚范围，例如C2‑C6、C3‑C5、C3‑C4、C2‑C3、C2‑C4、C2‑C5；特别是C2‑C3。
另外，本文使用的术语“C3‑C6”，如在本文中通篇使用，例如在“C3‑C6‑环烷基”的定义的语境中应理解为表示具有3‑6个有限数量的碳原子，即3、4、5或6个碳原子的环烷基。还应理解，所述术语“C3‑C6”应理解为包含于其中的任意亚范围，例如C3‑C6、C4‑C5、C3‑C5、C3‑C4、C4‑C6、C5‑C6；特别是C3‑C6。
术语“取代的”指所指定的原子的一个或多个氢被从所指出的基团的选择代替，条件是未超过所指定的原子在当前情况下的正常原子价并且所述取代形成稳定的化合物。取代基和/或变量的组合仅仅当这种组合形成稳定的化合物时才是允许的。
术语“任选取代的”指任选地被特定的基团、原子团或部分取代。
环系统的取代基指与芳香性或非芳香性环系统连接的取代基，例如所述取代基代替所述环系统上可用的氢。
本文使用的术语“一次或多次”，例如在本发明通式化合物的取代基的定义中应理解为表示“一次、两次、三次、四次或五次，特别是一次、两次、三次或四次，更特别地是一次、两次或三次，甚至更特别地是一次或两次”。
当本文中使用化合物、盐、多晶型物、水合物、溶剂合物等词的复数 形式时，应理解为还表示单数的化合物、盐、多晶型物、异构体、水合物、溶剂合物等。
“稳定的化合物”或“稳定的结构”指足够强大，能够经受从反应混合物中分离到有用的纯度并配制成有效的治疗剂的化合物。
本发明的化合物可包含一个或多个不对称中心，视期望的各种取代基的位置和性质而定。不对称碳原子可以(R)或(S)构型存在，在具有一个不对称中心的情况下得到外消旋混合物，并且在具有多个不对称中心的情况下得到非对映异构体混合物。在某些情况下，由于围绕特定键的旋转受阻还可能存在不对称性，例如该中心键连接特定化合物的两个被取代的芳环。
环上的取代基还可以顺式或反式形式存在。意图所有的此类构型(包括对映异构体和非对映异构体)均包括于本发明的范围内。
优选的化合物是产生更期望的生物活性的那些化合物。本发明化合物的分离的、纯净的或部分纯化的异构体和立体异构体、或者外消旋混合物或非对映异构体混合物均包括于本发明范围内。此类物质的纯化和分离可通过本领域已知的标准技术实现。
根据常规方法通过拆分外消旋混合物可获得旋光异构体，例如通过使用旋光酸或碱形成非对映异构体盐，或者通过形成共价非对映异构体。适当的酸的实例为酒石酸、二乙酰基酒石酸、二甲苯酰基酒石酸和樟脑磺酸。非对映异构体的混合物可基于它们的物理和/或化学差异，通过本领域已知的方法例如通过色谱法或分级结晶而分离成它们的单一的非对映异构体。然后，从分离的非对映异构体盐中释放旋光碱或酸。另一种不同的分离旋光异构体的方法涉及在进行或不进行常规衍生化的条件下使用手性色谱法(例如手性HPLC柱)，其可经过最佳选择以将对映异构体的分离最大化。适合的手性HPLC柱是由Diacel生产，例如Chiracel OD和Chiracel OJ等，所有的均可常规性选用。还可在进行或不进行衍生化的条件下使用酶法分离。同样地，可通过使用旋光原料的手性合成来获得本发明的旋光化合物。
为了将不同类型的异构体相互之间区分开来，参考了IUPAC Rules Section E(Pure Appl Chem45,11‑30,1976)。
本发明包括本发明化合物的所有可能的立体异构体，其是单一立体异 构体或所述异构体的任意比例的任意混合物的形式。可通过任意适合的现有技术方法例如色谱法特别是例如手性色谱法实现本发明化合物的单一立体异构体例如单一对映异构体或单一非对映异构体的分离。
另外，本发明化合物可以互变异构体的形式存在。例如，包含作为杂芳基的吡唑部分的任何本发明化合物例如可以1H互变异构体或2H互变异构体的形式存在或甚至以任意量的所述两种互变异构体的混合物的形式存在，或者包含作为杂芳基的三唑部分的任何本发明化合物例如可以1H互变异构体、2H互变异构体或4H互变异构体的形式存在或甚至以任意量的所述1H、2H和4H互变异构体的混合物的形式存在：
本发明包括本发明化合物的所有可能的互变异构体，其是单一互变异构体或所述互变异构体的任意比例的任意混合物的形式。
另外，本发明的化合物可以N‑氧化物的形式存在，其定义为本发明化合物中的至少一个氮被氧化。本发明包括所有此类可能的N‑氧化物。
本发明还涉及如本文公开的化合物的有用形式，例如代谢物、水合物、溶剂合物、前药、盐特别是药学可接受的盐、以及共沉淀物。
本发明的化合物可以水合物或溶剂合物的形式存在，其中本发明的化合物包含作为所述化合物晶格的结构要素的极性溶剂，特别是例如水、甲醇或乙醇。极性溶剂特别是水的量可以化学计量比或非化学计量比存在。在化学计量溶剂合物例如水合物的情况下，可能分别是半(hemi‑)溶剂合物或水合物、(半(semi‑))溶剂合物或水合物、一溶剂合物或水合物、倍半溶剂合物或水合物、二溶剂合物或水合物、三溶剂合物或水合物、四溶剂合物或水合物、五溶剂合物或水合物等。本发明包括所有此类水合物或溶剂合物。
另外，本发明的化合物可以游离形式存在，例如以游离碱、游离酸或两性离子的形式，或者以盐的形式存在。所述盐可为任意盐，其可为有机或无机加成盐，特别是药学中常用的任意药学可接受的有机或无机加成盐。
术语“药学可接受的盐”指本发明化合物的相对无毒的、无机酸或有机酸加成盐。例如，参见S.M.Berge等人，“Pharmaceutical Salts,”J.Pharm.Sci.1977,66,1‑19。
本发明化合物的适合的药学可接受的盐可以是例如在链或环中携带氮原子的具有足够碱性的本发明化合物的酸加成盐，例如与如下无机酸形成的酸加成盐：例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、焦硫酸(bisulfuric acid)、磷酸或硝酸，或者与如下有机酸形成的酸加成盐：例如甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一烷酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2‑(4‑羟基苯甲酰基)苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡糖酸(digluconic acid)、3‑羟基‑2‑萘甲酸、烟酸、扑酸、果胶酯酸、过硫酸、3‑苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2‑羟基乙磺酸、衣康酸、氨基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、2‑萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、肥酸、藻酸、马来酸、富马酸、D‑葡糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚酸、甘油磷酸、天冬氨酸、磺基水杨酸、半硫酸(hemisulfuric acid)或硫氰酸。
另外，具有足够酸性的本发明化合物的另一种适合的药学可接受的盐是碱金属盐例如钠盐或钾盐，碱土金属盐例如钙盐或镁盐，铵盐，或与提供生理学可接受的阳离子的有机碱形成的盐，例如与如下物质形成的盐：N‑甲基葡糖胺、二甲基葡糖胺、乙基葡糖胺、赖氨酸、二环己基胺、1,6‑己二胺、乙醇胺、葡糖胺、肌氨酸、丝氨醇、三羟基甲基氨基甲烷、氨基丙二醇、sovak碱、1‑氨基‑2,3,4‑丁三醇。另外，碱性含氮基团可用如下试剂季铵化：低级烷基卤，例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基酯，例如硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯和硫酸二戊酯；长链卤化物例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物如苄基和苯乙基溴化物等。
本领域技术人员还会认识到，所要求保护的化合物的酸加成盐可通过多种已知方法中的任意一种使所述化合物与适当的无机酸或有机酸反应来制备。或者，本发明的酸性化合物的碱金属盐和碱土金属盐通过各种已知的方法使本发明的化合物与适当的碱反应来制备。
本发明包括本发明化合物的所有可能的盐，其可为单一盐或所述盐的 任意比例的任意混合物。
本文使用的术语“体内可水解的酯”应理解为表示包含羧基或羟基的本发明化合物的体内可水解的酯，例如可在人体或动物体内被水解从而产生母体酸或醇的药学可接受的酯。对于羧基适合的药学可接受的酯包括例如烷基酯、环烷基酯和被任选取代的苯基烷基酯特别是苄基酯、C1‑C6烷氧基甲基酯例如甲氧基甲基酯、C1‑C6烷酰氧基甲基酯例如特戊酰氧基甲基酯、酞基酯、C3‑C8环烷氧基羰氧基‑C1‑C6烷基酯例如1‑环己基羰氧基乙基酯；1,3‑二氧杂环戊烯‑2‑羰基甲基(1,3‑dioxolen‑2‑onylmethyl ester)，例如5‑甲基‑1,3‑二氧杂环戊烯‑2‑羰基甲基酯；以及C1‑C6‑烷氧基羰氧基乙基酯，例如1‑甲氧基羰氧基乙基酯，并且所述酯可在本发明化合物的任意羧基上形成。
包含羟基的本发明化合物的体内可水解的酯包括无机酸酯(例如磷酸酯)、[α]酰氧基烷基醚和相关化合物，所述相关化合物由于所述酯的体内水解而断裂形成母体羟基。[α]酰氧基烷基醚的实例包括乙酰氧基甲基醚(acetoxymethoxy)和2,2‑二甲基丙酰氧基甲基醚(2,2‑dimethylpropionyloxymethoxy)。与羟基形成体内可水解的酯的基团的选择包括烷酰基、苯甲酰基、苯基乙酰基和取代的苯甲酰基和苯基乙酰基、烷氧羰基(以形成碳酸烷基酯)、二烷基氨基甲酰基和N‑(二烷基氨基乙基)‑N‑烷基氨基甲酰基(以形成氨基甲酸酯)、二烷基氨基乙酰基和羧基乙酰基。本发明包括所有此类酯。
另外，本发明包括本发明化合物的所有可能的结晶形式或多晶型物，其可为单一多晶型物或多于一种多晶型物的任意比例的混合物。
根据第二个方面，本发明包括上述通式(I)的化合物、或者其互变异构体、立体异构体、N‑氧化物、盐、水合物或溶剂合物，其中：
R1是芳基、杂芳基、C1‑C6‑烷基、C2‑C6‑烯基、C3‑C6‑环烷基或3‑至7‑元杂环烷基基团，
所述基团被一个或多个选自以下的取代基取代：
‑卤原子，或‑CN，C1‑C6‑烷基‑，卤代‑C1‑C6‑烷基‑，H2N‑C1‑C6‑烷基‑，R(R’)N‑C1‑C6‑烷基‑，HO‑C1‑C6‑烷基，被两个OH取代的C1‑C6‑烷基，C1‑C6‑烷氧基‑C1‑C6‑烷基‑，卤代‑C1‑C6‑烷氧基‑C1‑C6‑烷基‑，C3‑C10‑环烷 基‑C1‑C6‑烷基‑，3‑至7‑元杂环烷基‑C1‑C6‑烷基‑，芳基‑C1‑C6‑烷基‑，杂芳基‑C1‑C6‑烷基‑，‑C(=O)R，‑C(=O)NH2，‑C(=O)N(H)R,‑C(=O)N(R)R’，‑C(=O)OH，‑C(=O)OR，‑NH2，‑N(H)R，‑N(R)R’，‑N(H)C(=O)H，‑N(H)C(=O)R，‑N(R)C(=O)R’，‑N(H)C(=O)NH2，‑N(H)C(=O)N(H)R，‑N(H)C(=O)N(R)R’，‑N(R)C(=O)NH2，‑N(R)C(=O)N(H)R，‑N(R)C(=O)N(R)R’，‑N(H)C(=O)OR，‑N(R)C(=O)OR’，‑NO2，‑N(H)S(=O)R，‑N(R)S(=O)R’，‑N(H)S(=O)NH2，‑N(H)S(=O)N(H)R，‑N(H)S(=O)N(R)R’，‑N(R)S(=O)NH2，‑N(R)S(=O)N(H)R’，‑N(R)S(=O)N(R’)R’’，‑N(H)S(=O)2R，‑N(H)S(=O)2‑C3‑C6‑环烷基，‑N(R)S(=O)2R’，‑N(H)S(=O)2NH2，‑N(H)S(=O)2N(H)R，‑N(H)S(=O)2N(R)R’，‑N(R)S(=O)2NH2，‑N(R)S(=O)2N(H)R，‑N(R)S(=O)2N(R’)R’’，‑N=S(=O)(R)R’，‑OH，C1‑C6‑烷氧基‑，‑OC(=O)H，‑OC(=O)R，‑OC(=O)NH2，‑OC(=O)N(H)R，‑OC(=O)N(R)R’，‑OC(=O)OR，‑SH，C1‑C6‑烷基‑S‑，‑SC(=O)NH2，‑SC(=O)N(H)R，‑SC(=O)N(R)R’，‑S(=O)2R，‑S(=O)2NH2，‑S(=O)2N(H)R，‑S(=O)2N(R)R’或‑S(=O)(=NR)R’基团；
R2是卤原子、C2‑C6‑炔基或‑S‑C1‑C6‑烷基基团；
R3是氢原子、C1‑C6‑烷基或C3‑C6‑环烷基基团；
R、R’和R’’相互独立地是C1‑C6‑烷基基团。
根据第三个方面，本发明包括上述通式(I)的化合物、或者其互变异构体、立体异构体、N‑氧化物、盐、水合物或溶剂合物，其中：
R1是芳基、杂芳基、C1‑C6‑烷基、C2‑C6‑烯基、C3‑C6‑环烷基或3‑至7‑元杂环烷基基团，
所述基团被一个或多个选自以下的取代基取代：
‑卤原子，或‑CN，C1‑C6‑烷基‑，卤代‑C1‑C6‑烷基‑，H2N‑C1‑C6‑烷基‑，R(R’)N‑C1‑C6‑烷基‑，HO‑C1‑C6‑烷基，被两个OH取代的C1‑C6‑烷基，C1‑C6‑烷氧基‑C1‑C6‑烷基‑，卤代‑C1‑C6‑烷氧基‑C1‑C6‑烷基‑，C3‑C10‑环烷基‑C1‑C6‑烷基‑，3‑至7‑元杂环烷基‑C1‑C6‑烷基‑，芳基‑C1‑C6‑烷基‑，杂芳基‑C1‑C6‑烷基‑，‑C(=O)R，‑C(=O)NH2，‑C(=O)N(H)R,‑C(=O)N(R)R’，‑C(=O)OH，‑C(=O)OR，‑NH2，‑N(H)R，‑N(R)R’，‑N(H)C(=O)H， ‑N(H)C(=O)R，‑N(R)C(=O)R’，‑N(H)C(=O)NH2，‑N(H)C(=O)N(H)R，‑N(H)C(=O)N(R)R’，‑N(R)C(=O)NH2，‑N(R)C(=O)N(H)R，‑N(R)C(=O)N(R’)R’’，‑N(H)C(=O)OR，‑N(R)C(=O)OR’，‑NO2，‑N(H)S(=O)R，‑N(R)S(=O)R’，‑N(H)S(=O)NH2，‑N(H)S(=O)N(H)R，‑N(H)S(=O)N(R)R’，‑N(R)S(=O)NH2，‑N(R)S(=O)N(H)R’，‑N(R)S(=O)N(R’)R’’，‑N(H)S(=O)2R，‑N(H)S(=O)2‑C3‑C6‑环烷基，‑N(R)S(=O)2R’，‑N(H)S(=O)2NH2，‑N(H)S(=O)2N(H)R，‑N(H)S(=O)2N(R)R’，‑N(R)S(=O)2NH2，‑N(R)S(=O)2N(H)R’，‑N(R)S(=O)2N(R’)R’’，‑N=S(=O)(R)R’，‑OH，C1‑C6‑烷氧基‑，‑OC(=O)H，‑OC(=O)R，‑OC(=O)NH2，‑OC(=O)N(H)R，‑OC(=O)N(R)R’，‑OC(=O)OR，‑SH，C1‑C6‑烷基‑S‑，‑SC(=O)NH2，‑SC(=O)N(H)R，‑SC(=O)N(R)R’，‑S(=O)2R，‑S(=O)2NH2，‑S(=O)2N(H)R，‑S(=O)2N(R)R’或‑S(=O)(=NR)R’基团；
R2是溴原子、碘原子或C2‑炔基基团；
R3是氢原子、C1‑C6‑烷基或C3‑C6‑环烷基基团；
R、R’和R’’相互独立地是C1‑C6‑烷基基团。
根据第四个方面，本发明包括上述通式(I)的化合物、或者其互变异构体、立体异构体、N‑氧化物、盐、水合物、溶剂合物，其中：
R1是芳基、C1‑C6‑烷基或C2‑C6‑烯基基团，
所述基团被一个或多个选自以下的取代基取代：
C1‑C6‑烷基‑，HO‑C1‑C6‑烷基，被两个OH取代的C1‑C6‑烷基，‑C(=O)NH2，‑C(=O)N(H)R,‑C(=O)N(R)R’，‑NH2，‑N(H)R，‑N(R)R’，‑N(H)C(=O)H，‑N(H)C(=O)R，‑N(R)C(=O)R’，‑N(H)S(=O)2R，‑N(H)S(=O)2‑C3‑C6‑环烷基，‑OH，C1‑C6‑烷氧基‑，‑S(=O)2NH2，‑S(=O)2N(H)R或‑S(=O)2N(R)R’基团；
R2是溴原子、碘原子或C2‑炔基基团；
R3是氢原子、C1‑C6‑烷基或C3‑C6‑环烷基基团；
R和R’相互独立地是C1‑C6‑烷基基团。
根据第五个方面，本发明包括上述式(I)的化合物、或者其互变异构体、立体异构体、N‑氧化物、盐、水合物或溶剂合物，其中：
R1是芳基、C1‑C6‑烷基、C2‑C6‑烯基基团，
所述基团被一个或多个选自以下的取代基取代：
C1‑C6‑烷基‑，被两个OH取代的C1‑C6‑烷基，‑NH2，‑N(H)C(=O)R，‑N(H)S(=O)2R，‑N(H)S(=O)2‑C3‑C6‑环烷基或‑OH基团；
R2是碘原子或C2‑炔基基团；
R3是氢原子；
R是C1‑C6‑烷基基团。
在上述方面的又一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中
R1是芳基、杂芳基、C1‑C6‑烷基、C2‑C6‑烯基、C3‑C6‑环烷基或3‑至7‑元杂环烷基基团，
所述基团被一个或多个选自以下的取代基取代：
‑卤原子，或‑CN，C1‑C6‑烷基‑，卤代‑C1‑C6‑烷基‑，H2N‑C1‑C6‑烷基‑，R(R’)N‑C1‑C6‑烷基‑，HO‑C1‑C6‑烷基，被两个OH取代的C1‑C6‑烷基，C1‑C6‑烷氧基‑C1‑C6‑烷基‑，卤代‑C1‑C6‑烷氧基‑C1‑C6‑烷基‑，C3‑C6‑环烷基‑C1‑C6‑烷基‑，3‑至7‑元杂环烷基‑C1‑C6‑烷基‑，芳基‑C1‑C6‑烷基‑，杂芳基‑C1‑C6‑烷基‑，‑C(=O)R，‑C(=O)NH2，‑C(=O)N(H)R,‑C(=O)N(R)R’，‑C(=O)OH，‑C(=O)OR，‑NH2，‑N(H)R，‑N(R)R’，‑N(H)C(=O)H，‑N(H)C(=O)R，‑N(R)C(=O)R’，‑N(H)C(=O)NH2，‑N(H)C(=O)N(H)R，‑N(H)C(=O)N(R)R’，‑N(R)C(=O)NH2，‑N(R)C(=O)N(H)R’，‑N(R)C(=O)N(R’)R’’，‑N(H)C(=O)OR，‑N(R)C(=O)OR’，‑NO2，‑N(H)S(=O)R，‑N(R)S(=O)R’，‑N(H)S(=O)NH2，‑N(H)S(=O)N(H)R，‑N(H)S(=O)N(R)R’，‑N(R)S(=O)NH2，‑N(R)S(=O)N(H)R’，‑N(R)S(=O)N(R’)R’’，‑N(H)S(=O)2R，‑N(H)S(=O)2‑C3‑C6‑环烷基，‑N(R)S(=O)2R’，‑N(H)S(=O)2NH2，‑N(H)S(=O)2N(H)R，‑N(H)S(=O)2N(R)R’，‑N(R)S(=O)2NH2，‑N(R)S(=O)2N(H)R’，‑N(R)S(=O)2N(R’)R’’，‑N=S(=O)(R)R’，‑OH，C1‑C6‑烷氧基‑，‑OC(=O)H，‑OC(=O)R，‑OC(=O)NH2，‑OC(=O)N(H)R，‑OC(=O)N(R)R’，‑OC(=O)OR，‑SH，C1‑C6‑烷基‑S‑，‑SC(=O)NH2， ‑SC(=O)N(H)R，‑SC(=O)N(R)R’，‑S(=O)2R，‑S(=O)2NH2，‑S(=O)2N(H)R，‑S(=O)2N(R)R’或‑S(=O)(=NR)R’基团；
在上述方面的又一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中
R1是芳基、C1‑C6‑烷基或C2‑C6‑烯基基团，
所述基团被一个或多个选自以下的取代基取代：
C1‑C6‑烷基‑，HO‑C1‑C6‑烷基，被两个OH取代的C1‑C6‑烷基，‑C(=O)NH2，‑C(=O)N(H)R，‑C(=O)N(R)R’，‑NH2，‑N(H)R，‑N(R)R’，‑N(H)C(=O)H，‑N(H)C(=O)R，‑N(R)C(=O)R’，‑N(H)S(=O)2R，‑N(H)S(=O)2‑C3‑C6‑环烷基，‑OH，C1‑C6‑烷氧基‑，‑S(=O)2NH2，‑S(=O)2N(H)R或‑S(=O)2N(R)R’基团；
在上述方面的又一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中
R1是芳基、C1‑C6‑烷基、C2‑C6‑烯基基团，
所述基团被一个或多个选自以下的取代基取代：
C1‑C6‑烷基‑，被两个OH取代的C1‑C6‑烷基，‑NH2，‑N(H)C(=O)R，‑N(H)S(=O)2R，‑N(H)S(=O)2‑C3‑C6‑环烷基或‑OH基团；
在上述方面的又一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中
R1是C1‑C6‑烷基基团，其被一个或多个选自以下的取代基取代：
C1‑C6‑烷基‑，被两个OH取代的C1‑C6‑烷基，‑NH2，‑N(H)C(=O)R，‑N(H)S(=O)2R，‑N(H)S(=O)2‑C3‑C6‑环烷基或‑OH基团；
在上述方面的又一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中
R1是芳基，其被一个或多个选自以下的取代基取代：
卤原子，C1‑C6‑烷基‑，‑NH2，‑N(H)C(=O)R，‑N(H)S(=O)2R，‑N(H)S(=O)2‑C3‑C6‑环烷基或‑OH基团；
在上述方面的又一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中R2是卤原子、C2‑C6‑炔基或‑S‑C1‑C6‑烷基基团；
在上述方面的又一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中R2是溴原子、碘原子或C2‑炔基基团；
在上述方面的又一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中
在上述方面的又一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中R2是碘原子或C2‑炔基基团；
在上述方面的又一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中R2是碘原子；
在上述方面的又一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中R2是C2‑炔基基团；
在上述方面的又一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中
R3选自氢原子、C1‑C6烷基、C3‑C6‑环烷基、3‑至7‑元杂环烷基、芳基或杂芳基基团，所述C1‑C6烷基、C3‑C6‑环烷基、芳基或杂芳基任选地被‑OH、‑NH2、‑N(H)R、‑N(R)R’、卤原子、氰基或C1‑C6‑烷氧基以相同或不同方式取代一次或多次；
在上述方面的又一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中R3是氢原子、C1‑C6‑烷基或C3‑C6‑环烷基基团；
在上述方面的又一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中R3是氢原子；
在上述方面的又一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中R、R’和R’’相互独立地是C1‑C6‑烷基基团；
在上述方面的又一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中R是C1‑C6‑烷基基团；
在上述方面的又一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中R’是C1‑C6‑烷基基团；
在上述方面的又一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中R’’是C1‑C6‑烷基基团；
在上述方面的又一实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物，其中R是C1‑C6‑烷基基团；
应理解本发明涉及在上文所述本发明的通式(I)的化合物的任何实施方案的范围内的任意亚组合。
在进一步的方面，本发明包括下文中的实施例部分公开的通式(I)的化合物。
根据另一方面，本发明涉及制备本发明化合物的方法，所述方法包括本文所述的步骤。
根据另一方面，本发明涉及可用于本发明的通式(I)的化合物的制备，特别是用于本文所述方法的中间体化合物。具体而言，本发明包括通式(2)的化合物：
其中R2和R3如以上关于通式(I)所定义的。
根据又一方面，本发明涉及上述通式(2)的中间体化合物用于制备上述通式(I)的本发明的化合物的用途。
实验详述及一般方法
下表列出了这一节和实施例部分中使用的缩写。
一般方法
在以下段落中描述了用于合成关键中间体和本发明的化合物的一般方法。
下文描述的路线和方法举例说明了本发明的通式(I)的化合物的通用合成路线并且不具有限制性。本领域技术人员显而易见能够以各种方式改变所述路线中举例说明的转化的顺序。因此，所述路线中举例说明的转化的顺序不具有限制性。另外，可在举例说明的转化之前和/或之后实现取代基R1、R2或R3中任一个的互变。这些修饰可为例如引入保护基、脱除保护基、还原或氧化官能团、卤化、金属化、取代或本领域技术人员已知的其他反应。这些转化包括引入使取代基进一步互变的官能度的那些转化。适当的保护基以及它们的引入和脱除为本领域技术人员公知(参见，例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts in Protective Groups in Organic Synthesis,第3版,Wiley1999)。后续段落中描述了具体的实例。
路线1中描述了用于制备通式(I)的化合物的一般路线。
路线1
路线1.用于制备通式(I)的化合物的一般路线，其中R1、R2和R3具有以上关于通式(I)所述的含义，并且X表示卤原子。本领域技术人员可以理解，化合物A、B、C和D可商购或可按照可获自公共领域的方法制备。
使式(A)的3,5‑二卤代异烟酸与适当取代的式(B)的2‑氟苯胺在诸如THF的适合的溶剂系统中，在诸如六甲基二硅氮烷锂的适合的碱的存在下，在‑78°C至室温的温度、优选室温下反应，以提供通式(1)的3‑卤代‑5‑[(2‑氟‑4‑R2)氨基]异烟酸中间体。
然后，通过在诸如N,N‑二甲基甲酰胺的适合的溶剂系统中，在诸如N,N‑羰基二咪唑的适合的活化剂的存在下，在室温至相应溶剂的沸点的温度、优选室温下，与通式(C)的适合的胺反应，将通式(1)的中间体转化为通式(2)的中间体。
使通式(2)的中间体与通式(D)的适合的醇（诸如5‑羟基‑1,3‑苯并噁唑‑2(3H)‑酮）在诸如碳酸铯的适合的碱的存在下，在诸如N,N‑二甲基甲酰胺的适合的溶剂中，在室温至相应溶剂的沸点的温度下反应，以提供通式(I)的化合物。
通式(Ia)的化合物可以根据路线2描述的方法合成。通式E的化合物是可商购的。
路线2
路线2.用于制备通式(Ia)的化合物的其他一般路线，其中R2和R3具有以上关于通式(I)所述的含义。PG表示“适合的保护基”，例如叔丁氧羰基(Boc)。Y表示碳原子或S=O基团。R表示C1‑C6‑烷基基团。
通过在诸如N,N‑二甲基甲酰胺的适合的溶剂系统中，在诸如碳酸铯的适合的碱的存在下，在室温至相应溶剂的沸点的温度下，与通式(E)的适当保护的取代酚（诸如(3‑羟基苯基)氨基甲酸叔丁酯）反应，将通式(2)的中间体转化为通式(3)的中间体。
通过在诸如TFA的适合的酸的存在下，在诸如DCM的适合的溶剂中，在室温至所述溶剂的沸点的温度下，通过本领域技术人员已知的方法脱除所述保护基，例如脱除叔丁氧羰基(Boc)，将通式(3)的中间体转化为通式(4)的中间体。
然后，使通式(4)的中间体与通式(F)的适合的磺酰氯或碳酰氯（例如异丙基磺酰氯）在诸如吡啶的适合的碱的存在下，在诸如吡啶的适合的溶剂中，在0°C至室温的温度下反应，以提供通式(Ia)的化合物。
通式(Ib)的化合物可以根据路线3描述的方法合成。通式G的化合物是可商购的。
路线3
路线3.通过通式(5)的中间体的二羟基化制备通式(Ib)的化合物的更特别的方法，其中R2和R3具有以上关于通式(I)所述的含义。Q、Q’和Q’’相互独立地表示氢原子、甲基、或形成环的1‑2个烯基基团（应将此理解为Q’和Q’’一起可以形成环烯基环）。
将通式(5)的合成中间体（可以通过路线1和2描述的方法以及与详细描述（见后）类似地得到）二羟基化得到通式(Ib)的实例化合物。烯烃二羟基化的条件是本领域公知的，包括使用化学计量的四氧化锇或碱性高锰酸钾。或者，可以将催化量的四氧化锇与化学计量的氧化剂组合使用，所述氧化剂例如为过氧化氢、叔丁基过氧化氢、N‑甲基吗啉‑N‑氧化物或铁氰化钾K3Fe(CN)6。任选地，诸如DMAP的促进剂(promotor)可以促进在诸如丙酮的适合的溶剂中进行的该转化。鉴于所述条件提供外消旋形式的相应二醇，在本领域广泛知晓的条件下使用Sharpless不对称二羟基化反应(SAD)反应(参见：Chem.Rev.1994,94,2483)，可以实现烯烃的立体选择性二羟基化。
根据路线4描述的方法可以将通式(I)的化合物转化为通式(Ic)的化合物。
路线4
路线4.将通式(I)的化合物转化为通式(Ic)的化合物的一般方法，其中R1、R2和R3具有以上关于通式(I)所述的含义，并且R*表示C2‑C6‑烯基基团或氢原子。
通过本领域技术人员已知的偶联反应，优选通过与乙炔或乙炔同等物(equivalent)的Sonogashira偶联反应或Sonogashira型偶联反应（见后），将通式(I)的化合物转化为通式(Ic)的化合物。
可以使例如通式(I)的含碘或溴的中间体与乙炔在催化量的Pd催化剂（诸如二(三苯基膦)氯化钯(II)、催化量的碘化亚铜的存在下，在诸如DMF的溶剂的存在下，并任选地在诸如三烷基胺的碱的存在下反应，以形成相应的炔衍生物(Ib)。或者，可以将单三烷基甲硅烷基保护的乙炔（诸如三甲基甲硅烷基(TMS)乙炔）用于在上述条件下的此类Sonogashira型偶联反应，然后通过用例如在甲醇中的四丁基氟化铵或碳酸钾处理，脱除所述三烷基甲硅烷基基团。或者，通过将四丁基氟化铵作为碱用于所述Sonogashira型偶联，可以一锅法转化实现TMS乙炔的偶联和所述TMS基团的脱除。过渡金属催化的(杂)芳基卤与炔和三烷基甲硅烷基炔的偶联是本领域技术人员公知的(参见例如(a)Chinchilla,R.;Najera,C.Chem.Rev.2007,107,874;(b)Negishi,E.‑i.,Anastasia,L.Chem.Rev.2003,103,1979;还参见: (c)Eur.J.Org.Chem.2005,20,4256;(d)J.Org.Chem.2006,71,2535及其中的文献;(e)Chem.Commun.2004,17,1934)。各种钯催化剂/助催化剂/配体/碱/溶剂组合公开于科技文献中，所述组合允许所需反应条件的精调，以在偶联配对二者上提供众多其他官能团（参见上述综述中的文献）。此外，最近开发的使用例如乙炔化锌、炔基镁盐或炔基三氟硼酸盐的方法拓宽了该方法的范围。
详细的实验描述
以下详细实验描述中的NMR峰形式按照它们在谱图中的表现描述，未考虑可能的更高级的效应。使用ACD/Name Batch第12.01版生成化合物的名称。在一些情况下，使用可商购试剂的普遍接受的名称。可以用任选地装配有机器人单元的Biotage微波炉进行使用微波照射的反应。所报道的使用微波加热的反应时间应理解为达到所指出的温度之后的确定的反应时间。按照本发明的方法制备的化合物和中间体可能需要纯化。有机化合物的纯化为本领域技术人员熟知，并且相同的化合物可能存在几种纯化方法。在一些情况中，可不必纯化。在一些情况中，所述化合物可通过结晶纯化。在一些情况中，可使用适合的溶剂将杂质搅拌析出。在一些情况下，所述化合物可以通过色谱法，特别是快速柱色谱法进行纯化：使用例如预装填的硅胶柱，例如来自Separtis的，如快速硅胶或快速NH2硅胶，与Isolera自动纯化仪(Biotage)组合，以及洗脱剂，例如己烷/乙酸乙酯或DCM/甲醇梯度。在一些情况下，所述化合物可以通过制备型HPLC纯化：使用例如装配有二极管阵列检测器Waters自动纯化仪和/或与适合的预装填反相柱组合的在线电喷射离子化质谱仪，以及洗脱剂，例如水和乙腈的梯度（可以包含添加剂，例如三氟乙酸、甲酸或氨水）。在一些情况中，上述纯化方法可以盐的形式提供本发明的那些具有足够的碱性或酸性官能团的化合物，例如，在本发明的足够碱性的化合物的情况中，例如以三氟乙酸盐或甲酸盐形式提供，或者，在本发明的足够酸性的化合物的情况中，例如以铵盐形式提供。此类盐可通过本领域技术人员已知的各种方法分别被转化成其游离碱或游离酸形式，或者可以盐的形式用于后续生物学测定。应理解，如本文所述分离而得的本发明化 合物的特定形式(例如盐、游离碱等)不一定是所述化合物可应用于生物学测定中以定量特定的生物学活性的唯一形式。
以下实施例报道的百分比收率基于以最小摩尔量使用的起始组分。以注射器或移液管转移空气和水分敏感性液体和溶液，并通过橡胶隔片引入到反应容器中。商品级试剂和溶剂不经进一步纯化加以使用。术语“真空浓缩”指在约15mm Hg的最低压力下使用Buchi旋转蒸发器。报道的所有温度均是未校正的，以摄氏度(°C)计。
为了可以更好地理解本发明，描述以下实施例。这些实施例只是为了例示，并且不应解释为以任何方式限制本发明的范围。本文提及的任何出版物以其整体通过援引加入本文。
分析型LC‑MS条件：
以下详细实验描述提供的LC‑MS数据指（除非另有说明）以下条件：
制备型HPLC条件：
下文详细实验描述中的“通过制备型HPLC纯化”指（除非另有说明）以下条件：
分析：
制备：
手性HPLC条件：
下文详细实验描述提供的手性HPLC数据指以下条件：
分析：
系统： Dionex:Pump680,ASI100,Waters:UV‑Detektor2487
柱： Chiralpak IC5μm150x4.6mm
溶剂： 己烷/乙醇80:20+0.1%二乙胺
流速： 1.0mL/min
温度： 25℃
溶液： 1.0mg/mL EtOH/MeOH1:1
进样： 5.0μl
检测： UV280nm
制备：
快速柱色谱条件：
下文详细实验描述所述的“通过（快速）柱色谱纯化”指使用Biotage Flashmaster II或Isolera(SP4)纯化系统。关于技术规格，参见www.biotage.com的“Biotage product catalogue”。
旋光度测定条件：
在DMSO中，以589nm波长、20°C、浓度1.0000g/100mL、积分时间10s、膜厚度100.00mm测定旋光度。
合成中间体
中间体1.A
制备3‑氟‑5‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]异烟酸
将25g3,5‑二氟异烟酸(157.141mmol,1eq.)和37,245g2‑氟‑4‑碘苯胺(157.141mmol.1eq.)溶于1275,5mL无水THF中并置于氮气氛下。用冰浴冷却混合物至+3°C，之后缓慢加入471.422mL六甲基二硅基氨基锂(LiHMDS)溶液(1M，在THF中;471.422mmol,3.eq.)。加入碱完毕后，使反应混合物温热至rt并继续搅拌18h。真空浓缩反应混合物，然后在氢氧化钠水溶液(2N,800ml)和二氯甲烷之间分配。分离的有机相用氢氧化钠溶液(2N,每次300ml)洗涤两次。将合并的水层冷却至0°C并用HCl(浓盐酸，222ml)处理，直至达到ph=2。在室温下搅拌所得黄色悬浮液18h，然后滤出沉淀，得到5.15g(13.01mmol,8%)分析纯的目标化合物，为褐色固体。有机滤液也形成悬浮液。也滤出该沉淀并用二氯甲烷清洗两次。将沉淀悬浮于水(400ml)中，冷却至0°C并用HCl(浓盐酸,20ml)处理，直至 达到ph=1。在室温下搅拌所得黄色悬浮液18h，然后滤出沉淀，得到28.27g(71.41mmol,45%)分析纯的目标化合物，为黄色固体。
1H‑NMR(300MHz,DMSO‑d6):δ[ppm]=7.15(t,1H),7.47(dbr,1H),7.66(dd,1H),8.04‑8.17(m,2H),8.68(sbr,1H)。
LC‑MS:保留时间：1.11min
MS ES+:376.9[M+H]+
中间体2.A
制备3‑氟‑5‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]异烟酰胺
将5.000g3‑氟‑5‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]异烟酸(13.294mmol,1.eq.)和4.980g1,1′‑羰基二咪唑(30.710mmol.2.31eq)称入圆底烧瓶中。在氮气氛下加入650mL无水DMF，并将所得混合物在60°C下搅拌1.5小时。在冰浴中将混合物冷却至3°C，然后滴加氨(25重量%，在水中)，并将混合物在室温下搅拌18小时。滤出所得浆状物，用水清洗沉淀，然后真空干燥，得到2.54g(6.36mmol,48%)分析纯的目标化合物。
1H‑NMR(300MHz,DMSO‑d6):δ[ppm]=7.13(dt,1H),7.44(dbr,1H),7.63(dd,1H),8.05‑8.18(m,3H),8.34(sbr,1H)。
LC‑MS:保留时间:1.13min
MS ES+:375.9[M+H]+
实施例化合物
实施例1
制备3‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]‑5‑[(2‑氧代‑2,3‑二氢‑1,3‑苯并噁唑‑5‑基)氧基]异烟酰胺。
在氮气氛下将100mg3‑氟‑5‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]异烟酰胺(0.251mmol,1.eq.)溶于DMF，然后加入245mg碳酸铯(0.752mmol,3eq.)和45mg5‑羟基‑1,3‑苯并噁唑‑2(3H)‑酮(0.301mmol,1.2eq.)。将所得混合物在50°C浴温下搅拌3天。然后，将混合物在NH4Cl水溶液(30ml)和二氯甲烷(30ml)之间分配。分离各相，并用二氯甲烷/异丙醇(4:1,每次30ml)再萃取水层两次。用盐水(30ml)洗涤合并的有机层，在硅酮滤器上干燥并真空浓缩。通过快速色谱法纯化残余物，得到43mg(0.08mmol,33%)分析纯的目标化合物。
1H‑NMR(300MHz,DMSO‑d6):δ[ppm]=6.81(dd,1H),6.87(d,1H),7.11(br.dd,1H),7.28(d,1H),7.43(br.d,1H),7.62(dd,1H),7.66(s,1H),7.95(br.s,1H),8.05(br.s,1H),8.06–8.15(m,2H),11.71(br.s,1H)。
LC‑MS:保留时间:1.16min
MS ES+:506.9[M+H]+
实施例2
制备[3‑({4‑氨基甲酰基‑5‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]吡啶‑3‑基}氧基)苯基]氨基甲酸叔丁酯。
将31mg3‑氟‑5‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]异烟酰胺(0.083mmol,1.eq.)和17mg(3‑羟基苯基)氨基甲酸叔丁酯(0.083mmol,1eq.)溶于1ml DMF中，然后加入81mg碳酸铯(0.248mmol,3eq.)。将所得混合物在室温下搅拌18小时。由于反应不完全，将混合物在50°C浴温下再搅拌3天。然后，将混合物在NH4Cl水溶液(10ml)和二氯甲烷(10ml)之间分配。分离各相，并用二氯甲烷(每次10ml)再萃取水层两次。用盐水(20ml)洗涤合并的有机层，在硅酮滤器上干燥并真空浓缩。通过快速色谱法纯化残余物，得到17mg(0.03mmol,30%)分析纯的目标化合物。
LC‑MS:保留时间:1.39min
MS ES+:565.43[M+H]+
实施例3
制备3‑(3‑氨基苯氧基)‑5‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]异烟酰胺。
在氮气氛下，将840mg[3‑({4‑氨基甲酰基‑5‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]吡啶‑3‑基}氧基)苯基]氨基甲酸叔丁酯(1,488mmol,1eq.)溶于8mL二氯甲烷中。然后加入1.6ml TFA，并在室温下将褐色溶液搅拌18小时。然后加入4ml饱和NaHCO3水溶液，将混合物搅拌4小时，同时形成悬浮液，将其过滤。真空干燥沉淀，得到615mg分析纯的目标化合物(1.488mmol,收率87%)，为黄色固体。
1H‑NMR(400MHz,DMSO‑d6):δ[ppm]=5.24(m,2H),6.15(m,1H),6.19(m,1H),6.31(m,1H),6.97(t,1H),7.12(m,1H),7.43(br.d,1H),7.62(dd,1H),7.72(m,1H),7.94(br.s,2H),8.08–8.12(m,1H),8.24(br.s,1H)。
LC‑MS:保留时间:1.17min
MS ES+:464.7[M+H]+
实施例4
制备3‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]‑5‑{3‑[(异丙基磺酰基)氨基]苯氧基}异烟酰胺。
在氮气氛下将150mg3‑(3‑氨基苯氧基)‑5‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]异烟酰胺(0.323mmol,1eq.)溶于2mL吡啶中，然后加入69mg异丙基磺酰氯(0.485mmol,1.5eq.)，并将混合物在室温下搅拌18小时。将反应剩余物在二氯甲烷(20ml)和水(10ml)之间分配。分离各相，并用二氯甲烷(每次20ml)再萃取水相两次。用盐水(20ml)洗涤合并的有机层，在硅酮滤器上干燥 并真空浓缩。将液态残余物溶于4ml甲苯中并再次真空浓缩。制备型HPLC纯化得到45mg分析纯目标化合物(0.07mmol,收率21%)。
1H‑NMR(300MHz,DMSO‑d6):δ[ppm]=1.20(d,6H),2.38–2.56(m,1H),6.67(dd,1H),6.91‑7.00(m,2H),7.12(dt,1H),7.27(t,1H),7.42(br.d,1H),7.62(dd,1H),7.76(d,1H),7.92(br.s,1H),8.03(br.s,1H),8.12‑8.16(m,2H),9.88(br.s,1H)。
LC‑MS:保留时间:1.23min
MS ES+:571.1[M+H]+
类似于一般方法1，在吡啶的存在下，通过用相应的可商购磺酰氯和碳酰氯处理3‑(3‑氨基苯氧基)‑5‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]异烟酰胺，制备以下实施例化合物5‑10。
实施例11
制备3‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]‑5‑[(4‑甲基戊‑3‑烯‑1‑基)氧基]异烟酰胺。
将500mg3‑氟‑5‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]异烟酰胺(0.253mmol,1.eq.)溶于5ml DMF中，然后加入1225mg碳酸铯(3.759mmol,3eq.)和125mg4‑甲基‑3‑戊烯‑1‑醇(0.253mmol,1eq.)。将所得混合物在70°C浴温下搅拌24小时。由于反应不完全，将混合物在70°C浴温下再搅拌2天。由于反应不完全，加入额外的125mg4‑甲基‑3‑戊烯‑1‑醇(0.253mmol,1eq.)和408mg碳酸铯(0.253mmol,1eq.)，并将混合物在70°C浴温下再搅拌2天。将所得混合物在NH4Cl水溶液(50ml)和二氯甲烷(50ml)之间分配。分离各相，并用二氯甲烷(每次50ml)再萃取水层两次。用盐水(50ml)洗涤合并的有机层，在硅酮滤器上干燥并真空浓缩。将残余物悬浮于乙酸乙酯中并搅拌1h，之后滤出沉淀并真空干燥，得到252mg(0.52mmol,42%)分析纯的目标化合物。
LC‑MS:保留时间:1.42min
MS ES+:456.0[M+H]+
实施例12
制备3‑[(3,4‑二羟基‑4‑甲基戊基)氧基]‑5‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]异烟酰胺。
将252mg3‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]‑5‑[(4‑甲基戊‑3‑烯‑1‑基)氧基]异烟酰胺(0.554mmol,1eq.)溶于36ml丙酮中，并加入6ml水以形成悬浮液。然后，加入454mgN‑甲基吗啉代‑N‑氧化物(3.875,7eq.)和555μl四氧化锇溶液(2.5重量%，在叔丁醇中,0.044mmol,0.08eq.)，并将所形成的悬浮液在 室温下搅拌18小时。真空浓缩反应混合物，并将残余物在各50ml的水和二氯甲烷/异丙醇(4:1)之间分配。分离水层并用二氯甲烷/异丙醇(4:1)再萃取两次。用盐水洗涤合并的有机层，在硅胶滤器上干燥并浓缩，得到272mg(0.55mmol,100%)分析纯的目标化合物，其不需要进一步纯化。
1H‑NMR(300MHz,DMSO‑d6):δ[ppm]=1.00(s,3H),1.05(s,3H),1.58(m,1H),2.04(m,1H),3.25‑3.36(m,1H),4.17(s,1H),4.23(m,2H),4.62(d,1H),7.12(t,1H),7.41(br.d,1H),7.61(dd,1H),7.87(br.s,1H),7.95(br.s,1H),7.99‑8.06(m,2H),8.78(s,1H)。
LC‑MS:保留时间:1.05min
MS ES+:490.0[M+H]+
实施例13
制备3‑{3‑[(乙基磺酰基)氨基]苯氧基}‑5‑({2‑氟‑4‑[(三甲基甲硅烷基)乙炔基]苯基}氨基)异烟酰胺。
在氮气氛下，将745mg3‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]‑5‑[3‑(丙酰基氨基)苯氧基]异烟酰胺(1.339mmol;1eq.)悬浮于13.5ml三乙胺中。然后相继加入70mg三苯基膦(0.268mmol,0.2eq.)、31mg二(二亚苄基丙酮)钯(0)(0.054mmol,0.04eq.)和10mg碘化亚铜(0.054mmol,0.04eq.)。搅拌5min，然后加入1.1ml三甲基甲硅烷基乙炔(8.034mmol,6eq.)，并将所得混合物在60°C浴温下搅拌18小时。过滤悬浮液并真空浓缩残余物。通过快速色谱法纯化残余物，得到262mg(0.47mmol,35%)分析纯的目标化合物。
LC‑MS:保留时间:1.46min
MS ES+:527.1[M+H]+
实施例14
制备3‑{3‑[(乙基磺酰基)氨基]苯氧基}‑5‑[(4‑乙炔基‑2‑氟苯基)氨基]异烟酰胺。
在氮气氛下，将258mg3‑{3‑[(乙基磺酰基)氨基]苯氧基}‑5‑({2‑氟‑4‑[(三氟甲基甲硅烷基)乙炔基]苯基}氨基)异烟酰胺(0.490mmol,1eq.)溶于4mL四氢呋喃中。然后加入0.5ml四正丁基氟化铵(0.490mmol,1eq.)，将混合物在室温下搅拌18小时。将反应混合物在乙酸乙酯和半饱和（half concentrated）碳酸氢钠水溶液之间分配。分离有机层并用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过快速色谱法纯化残余物，得到101mg(0.22mmol,45%)分析纯的目标化合物。
1H‑NMR(300MHz,DMSO‑d6):δ[ppm]=1.15(t,3H),3.09(q,2H),4.14(s,1H),6.70(dd,1H),6.90–6.98(m,2H),7.16–7.39(m,4H),7.83(s,1H),7.93(br.s,1H),8.04(br.s,1H),8.22‑8.28(m,2H),9.92(s,1H)。
LC‑MS:保留时间:1.13min
MS ES+:455.0[M+H]+
实施例15
制备3‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]‑5‑甲氧基异烟酰胺。
将140mg3‑氟‑5‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]异烟酰胺(0.340mmol,1eq.)溶于3mL四氢呋喃并冷却至‑75°C的浴温，之后加入18mg甲醇钠(0.340mmol,1eq.)，并使混合物达到室温。然后将所得混合物在80°C浴温下搅 拌3天。由于反应不完全，加入额外的18mg甲醇钠(0.340mmol,1eq.)，并将混合物在80°C浴温下再搅拌1天。真空浓缩反应混合物，并将残余物在各20ml的水和二氯甲烷之间分配。分离水层并用二氯甲烷(每次20ml)再萃取两次。用盐水(30ml)洗涤合并的有机层，在硅酮滤器上干燥并浓缩。通过快速色谱法纯化残余物，得到67mg(0.17mmol,51%)分析纯的目标化合物。
1H‑NMR(300MHz,DMSO‑d6):δ[ppm]=3.89(s,3H),7.09(t,1H),7.40(br.d,1H),7.60(dd,1H),7.87(br.s,1H),7.89(br.s,1H),8.00‑8.05(m,2H),8.59(s,1H)。
LC‑MS:保留时间:1.09min
MS ES+:387.9[M+H]+
实施例16
制备N‑(2‑氨基苯基)‑3‑氟‑5‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]异烟酰胺。
将100mg3‑氟‑5‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]异烟酸(0,266mmol,1eq.;中间体1A)悬浮于2mL DMF中，然后加入28,754mg1,2‑二氨基苯(0,266mmol,1eq.)、215,339mg HATU(0,566mmol,2.13eq.)和73,196mgN,N‑二异丙基乙胺(0,566mmol,2.13eq.)，并在50°C的温度下继续搅拌18h。将反应混合物在20ml乙酸乙酯和20ml盐水之间分配。用每次20ml乙酸乙酯再萃取水层两次。在硅酮滤器上干燥合并的有机层，并真空浓缩。通过快速色谱法纯化残余物，得到69mg目标化合物，UV纯度72%。此物质未经进一步纯化用于下一步骤。
LC‑MS:保留时间:1.29min
MS ES+:466.9[M+H]+
实施例17
制备N‑(2‑乙酰氨基苯基)‑3‑氟‑5‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]异烟酰胺。
在氮气氛下将69mg N‑(2‑氨基苯基)‑3‑氟‑5‑[(2‑氟‑4‑碘苯基)氨基]异烟酰胺(0,148mmol,1eq.)溶于1mL四氢呋喃，然后加入0.592ml六甲基二硅氮烷溶液(1M在THF中,4eq.)并在室温下继续搅拌18h。将反应混合物在20ml乙酸乙酯和15ml HCL水溶液(1M)之间分配。用每次20ml乙酸乙酯再萃取水层两次。用20ml盐水洗涤合并的有机层，在硅酮滤器上干燥并真空浓缩。通过快速色谱法纯化残余物，得到14mg(0.03mmol,19%)分析纯的目标化合物。
1H‑NMR(400MHz,DMSO‑d6):δ[ppm]=1.97(s,3H),7.10(td,1H),7.13–7.21(m,2H),7.39–7.49(m,3H),7.63(dd,1H),8.14(br.s,1H),8.20(s,1H),8.33(br.s,1H),9.48(s,1H),10.00(s,1H)。
LC‑MS:保留时间:1.21min
MS ES+:509.17[M+H]+
另外，可通过本领域技术人员已知的任意方法将本发明的式(I)化合物转化成如本文所述的任意盐。类似地，可通过本领域技术人员已知的任意方法将本发明的式(I)化合物的任意盐转化游离化合物。
本发明化合物的药物组合物
本发明还涉及包含一种或多种本发明的化合物的药物组合物。可利用这些组合物通过向有此需要的患者给药来实现期望的药理学作用。就本发明而言，患者是需要治疗具体病症或疾病的包括人在内的哺乳动物。因此，本发明包括这样的药物组合物，其包含药学可接受的载体和药学有效量的本发明的化合物或其盐。药学可接受的载体优选是这样的载体，其在 与活性成分的有效活性一致的浓度下对患者相对无毒且无害，以致于由所述载体引起的任何副作用不会破坏所述活性成分的有益作用。化合物的药学有效量优选是对正在治疗的具体病症产生结果或者产生影响的量。可使用包括速释、缓释和定时释放制剂在内的任何有效的常规剂量单位形式，将本发明化合物与药学可接受的载体一起以如下方式给药：口服、肠胃外、局部、鼻腔、眼部(ophthalmically)、眼部(optically)、舌下、直肠、阴道给药等。
对于口服给药，可将所述化合物配制成固体或液体制剂，例如胶囊剂、丸剂、片剂、含锭剂(troche)、锭剂(lozenge)、熔胶剂(melt)、散剂、溶液剂、混悬剂或乳剂，并且可根据本领域已知的用于制备药物组合物的方法来制备。固体单位剂型可为胶囊剂，其可为普通的硬胶囊或软胶囊型，包含例如表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂例如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉。
在另一实施方案中，可将本发明化合物和常规片剂基质(例如乳糖、蔗糖和玉米淀粉)一起并与如下物质组合压制成片剂：粘合剂例如阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶，用于辅助给药后片剂的分解和溶出的崩解剂例如土豆淀粉、藻酸、玉米淀粉和瓜尔胶、西黄蓍胶、阿拉伯胶，用于提高片剂制粒的流动性并且防止片剂材料与片剂模具和冲头的表面粘附的润滑剂例如滑石、硬脂酸或硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌，染料，着色剂，以及用于改善片剂的感官性质并使它们更容易被患者接受的调味剂例如薄荷油、冬青油或樱桃香精。用于口服液体剂型的适合的赋形剂包括磷酸二钙和稀释剂例如水和醇(例如乙醇、苯甲醇和聚乙烯醇)，添加或不添加药学可接受的表面活性剂、助悬剂或乳化剂。可以存在各种其它物质作为包衣或者用于改变剂量单位的物理形式。例如可用虫胶、糖或二者将片剂、丸剂或胶囊剂包衣。
可分散的散剂和颗粒剂适合用于制备水性混悬剂。它们提供与分散剂或润湿剂、助悬剂以及一种或多种防腐剂混合的活性成分。适合的分散剂或润湿剂和助悬剂的实例为上文提及的那些。还可存在另外的赋形剂例如上文所述的那些甜味剂、调味剂和着色剂。
本发明的药物组合物还可为水包油乳剂的形式。油相可为植物油例如液体石蜡、或植物油的混合物。适合的乳化剂可为(1)天然树胶，例如阿 拉伯树胶和西黄蓍胶，(2)天然磷脂，例如大豆磷脂和卵磷脂，(3)衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如脱水山梨糖醇单油酸酯，(4)所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。所述乳剂还可包含甜味剂和调味剂。
可通过将所述活性成分悬浮在植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中或者悬浮在矿物油例如液体石蜡中来配制油性混悬剂。所述油性混悬剂可包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。所述混悬剂还可包含一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯；一种或多种着色剂；一种或多种调味剂；以及一种或多种甜味剂，例如蔗糖或糖精。
可用甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖来配制糖浆剂和酏剂。此类制剂还可包含缓和剂和防腐剂例如尼泊金甲酯和尼泊金丙酯以及调味剂和着色剂。
还可将本发明的化合物以所述化合物的注射剂量进行肠胃外给药，即皮下、静脉内、眼内、滑膜内、肌内或腹膜内给药，所述注射剂量优选在含有药物载体的生理学可接受的稀释剂中，所述药物载体可为无菌液体或液体的混合物，所述液体例如水，盐水，葡萄糖水溶液和相关的糖溶液，醇例如乙醇、异丙醇或十六醇，二醇例如丙二醇或聚乙二醇，甘油缩酮例如2,2‑二甲基‑1,1‑二氧戊环‑4‑甲醇，醚例如聚(乙二醇)400，油，脂肪酸，脂肪酸酯或脂肪酸甘油酯或乙酰化脂肪酸甘油酯，所述稀释剂添加或不添加有药学可接受的表面活性剂例如肥皂或去污剂，助悬剂例如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙甲纤维素或羧甲基纤维素，或乳化剂和其他药学辅剂。
可用于本发明的肠胃外制剂中的示例性的油是那些源于石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、凡士林油和矿物油。适合的脂肪酸包括油酸、硬脂酸、异硬脂酸和肉豆蔻酸。适合的脂肪酸酯是例如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。适合的肥皂包括脂肪酸碱金属盐、铵盐和三乙醇胺盐，且适合的去污剂包括阳离子去污剂例如二甲基二烷基卤化铵、烷基卤化吡啶鎓和烷基胺乙酸盐；阴离子去污剂例如烷基磺酸盐、芳基磺酸盐和烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐和烷基磺基琥珀酸盐、烯烃硫酸盐和烯烃磺基琥珀酸盐、醚硫酸盐和醚磺基琥 珀酸盐以及单酸甘油酯硫酸盐和单酸甘油酯磺基琥珀酸盐；非离子型去污剂例如脂肪胺氧化物、脂肪酸烷醇酰胺以及聚(氧乙烯‑氧丙烯)、环氧乙烷共聚物或环氧丙烷共聚物；以及两性去污剂例如烷基‑β‑氨基丙酸盐和2‑烷基咪唑啉季铵盐，以及其混合物。
本发明的肠胃外组合物通常会在溶液中包含约0.5重量%‑约25重量%的所述活性成分。还可有利地使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除对注射部位的刺激，此类组合物可包含亲水‑亲脂平衡(HLB)优选为约12‑约17的非离子表面活性剂。此类制剂中表面活性剂的量优选为约5重量%‑约15重量%。所述表面活性剂可为具有以上HLB的单一成分，或者为两种或多种具有期望的HLB的成分的混合物。
用于肠胃外制剂的示例性表面活性剂是聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯类例如脱水山糖梨醇单油酸酯，以及环氧乙烷与疏水性基质的高分子量加合物，所述疏水性基质由环氧丙烷和丙二醇缩合形成。
所述药物组合物可为注射用无菌水性混悬剂的形式。可根据已知的方法使用如下物质配制此类混悬剂：适合的分散剂或润湿剂和助悬剂例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙甲纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，其可为天然磷脂例如卵磷脂、氧化烯与脂肪酸的缩合产物例如聚氧乙烯硬脂酸酯、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物例如十七乙烯氧基鲸蜡醇、环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物例如聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。
无菌注射制剂还可为在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的注射用无菌溶液剂或混悬剂。可使用的稀释剂和溶剂为例如水、林格溶液、等渗氯化钠溶液和等渗葡萄糖溶液。另外，将无菌不挥发油常规性用作溶剂或悬浮介质。就此而言，可使用任何刺激性小的不挥发油，包括合成的单酸甘油酯或甘油二酯。另外，可将脂肪酸例如油酸用于注射剂的制备中。
还可将本发明的组合物以用于药物的直肠给药的栓剂的形式给药。可通过将药物与在常温下为固体但是在直肠温度下为液体并且因此可在直肠中熔化而释放所述药物的适合的无刺激性的赋形剂混合来制备这些组合物。此类物质是例如可可脂和聚乙二醇。
本发明的方法中使用的另一种制剂利用透皮递送装置(“贴剂”)。此类透皮贴剂可用于提供可控量的本发明化合物的连续或非连续输入。用于递送药剂的透皮贴剂的构造和使用是本领域公知的(参见例如1991年6月11日公告的第5,023,252号美国专利，其援引加入本文)。可将此类贴剂构造成用于连续地、脉冲式或按需递送药剂。
用于肠胃外给药的控释制剂包括本领域已知的脂质体微球、聚合物微球和聚合物凝胶制剂。
可能需要或必须通过机械递送装置将所述药物组合物递送至患者。用于递送药剂的机械递送装置的构造和使用是本领域公知的。例如将药物直接给药至脑的直接技术通常涉及将药物递送导管置入患者的脑室系统以绕过血脑屏障。用于将药剂运输至身体的特定解剖学位置的一种此类植入式递送系统记载于1991年4月30日公告的第5011472号美国专利。
本发明的组合物必须或视需要还可包含通常被称作载体或稀释剂的其他常规的药学可接受的制剂成分。可使用将此类组合物制备成适合的剂型的常规操作。此类成分和操作包括记载于如下参考文献中的那些，所述参考文献均援引加入本文：Powell,M.F.等人，"Compendium of Excipients for Parenteral Formulations"PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology1998,52(5),238‑311;Strickley,R.G"Parenteral Formulations of Small Molecule Therapeutics Marketed in the United States(1999)‑Part‑1"PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology1999,53(6),324‑349;以及Nema,S.等人，"Excipients and Their Use in Injectable Products"PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology1997,51(4),166‑171。
适当时可用于将所述组合物配制成用于预期的给药途径的常用药物成分包括：
酸化剂(实例包括但不限于乙酸、柠檬酸、富马酸、盐酸、硝酸)；
碱化剂(实例包括但不限于氨水、碳酸铵、二乙醇胺、单乙醇胺、氢氧化钾、硼酸钠、碳酸钠、氢氧化钠、三乙醇胺(triethanolamine)、三乙醇胺(trolamine));
吸附剂(实例包括但不限于粉状纤维素和活性炭)；
气雾剂抛射剂(实例包括但不限于二氧化碳、CCl2F2、F2ClC‑CClF2和CClF3)；
驱空气剂(air displacement agent)(实例包括但不限于氮气和氩气)；
抗真菌防腐剂(实例包括但不限于苯甲酸、尼泊金丁酯、尼泊金乙酯、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、苯甲酸钠)；
抗菌防腐剂(实例包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、西吡氯铵、三氯叔丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞和硫柳汞)；
抗氧化剂(实例包括但不限于抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚、丁羟甲苯、次磷酸、硫代甘油、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠)；
粘合物质(实例包括但不限于嵌段聚合物、天然和合成橡胶、聚丙烯酸酯、聚氨酯、硅酮、聚硅氧烷以及苯乙烯‑丁二烯共聚物)；
缓冲剂(实例包括但不限于偏磷酸钾、磷酸氢二钾、乙酸钠、无水柠檬酸钠以及柠檬酸钠二水合物)；
载体(实例包括但不限于阿拉伯胶糖浆、芳香剂糖浆、芳香剂酏剂、樱桃糖浆、可可糖浆、橙皮糖浆、糖浆、玉米油、矿物油、花生油、芝麻油、抑菌的氯化钠注射液和抑菌的注射用水)；
螯合剂(实例包括但不限于依地酸钠和依地酸)；
着色剂(实例包括但不限于FD&C Red No.3、FD&C Red No.20、FD&C Yellow No.6、FD&C Blue No.2、D&C Green No.5、D&C Orange No.5、D&C Red No.8、焦糖以及氧化铁红)；
澄清剂(实例包括但不限于膨润土)；
乳化剂(实例包括但不限于阿拉伯胶、聚西托醇、鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯50单硬脂酸酯)；
成胶囊剂(实例包括但不限于明胶和邻苯二甲酸醋酸纤维素)；
香料(实例包括但不限于茴香油、肉桂油、可可、薄荷醇、橙油、薄荷油和香草醛)；
湿润剂(实例包括但不限于甘油、丙二醇和山梨糖醇)；
研磨剂(实例包括但不限于矿物油和甘油)；
油(实例包括但不限于花生油(arachis oil)、矿物油、橄榄油、花生油(peanut oil)、芝麻油和植物油)；
软膏基质(实例包括但不限于羊毛脂、亲水软膏、聚乙二醇软膏、凡士林油、亲水凡士林油、白色软膏、黄色软膏以及玫瑰水软膏)；
渗透增强剂(透皮递送)(实例包括但不限于一元或多元醇类、一价或多价醇类、饱和或不饱和脂肪醇类、饱和或不饱和脂肪酯类、饱和或不饱和二羧酸类、精油类、磷脂酰衍生物、脑磷脂、萜类、酰胺类、醚类、酮类和脲类)；
增塑剂(实例包括但不限于邻苯二甲酸二乙酯和甘油)；
溶剂(实例包括但不限于乙醇、玉米油、棉籽油、甘油、异丙醇、矿物油、油酸、花生油、纯化水、注射用水、无菌注射用水和无菌冲洗用水)；
硬化剂(实例包括但不限于鲸蜡醇、十六烷基酯蜡、微晶蜡、石蜡、硬脂醇、白蜡和黄蜡)；
栓剂基质(实例包括但不限于可可脂和聚乙二醇(混合物))；
表面活性剂(实例包括但不限于苯扎氯铵、壬苯醇醚10、辛苯昔醇9、聚山梨酯80、十二烷基硫酸钠和脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)；
助悬剂(实例包括但不限于琼脂、膨润土、卡波姆、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、高岭土、甲基纤维素、黄蓍胶和硅酸镁铝)；
甜味剂(实例包括但不限于阿司帕坦、葡萄糖、甘油、甘露醇、丙二醇、糖精钠、山梨糖醇和蔗糖)；
片剂抗粘附剂(实例包括但不限于硬脂酸镁和滑石)；
片剂粘合剂(实例包括但不限于阿拉伯胶、藻酸、羧甲基纤维素钠、可压缩糖、乙基纤维素、明胶、液体葡萄糖、甲基纤维素、非交联聚乙烯吡咯烷酮和预胶化淀粉)；
片剂和胶囊剂稀释剂(实例包括但不限于磷酸氢钙、高岭土、乳糖、甘露醇、微晶纤维素、粉状纤维素、沉淀碳酸钙、碳酸钠、磷酸钠、山梨糖醇和淀粉)；
片剂包衣剂(实例包括但不限于液体葡萄糖、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素和虫胶)；
片剂直接压制赋形剂(实例包括但不限于磷酸氢钙)；
片剂崩解剂(实例包括但不限于藻酸、羧甲基纤维素钙、微晶纤维素、泼拉克林钾(polacrillin potassium)、交联聚乙烯吡咯烷酮、藻酸钠、淀粉羟乙酸钠和淀粉)；
片剂助流剂(实例包括但不限于胶体二氧化硅、玉米淀粉和滑石)；
片剂润滑剂(实例包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、硬脂酸和硬脂酸锌)；
片剂/胶囊剂遮光剂(实例包括但不限于二氧化钛)；
片剂抛光剂(实例包括但不限于巴西棕榈蜡和白蜡)；
增稠剂(实例包括但不限于蜂蜡、鲸蜡醇和石蜡)；
张度剂(实例包括但不限于葡萄糖和氯化钠)；
增粘剂(实例包括但不限于藻酸、膨润土、卡波姆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸钠和黄蓍胶)；以及
润湿剂(实例包括但不限于十七乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethylene oxycetanol)、卵磷脂、山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯和聚氧乙烯硬脂酸酯)。
本发明的药物组合物可举例如下：
无菌静脉内溶液剂：可使用无菌注射用水制备本发明的期望化合物的5mg/mL溶液，可视需要调节pH。用无菌5%葡萄糖将所述溶液稀释至1‑2mg/mL用于给药，并且在约60min内以静脉内输注给药。
用于静脉内给药的冻干粉：可用(i)100‑1000mg的冻干粉形式的本发明的期望化合物，(ii)32‑327mg/mL柠檬酸钠，和(iii)300‑3000mg葡聚糖40制备无菌制剂。用无菌注射用盐水或5%葡萄糖将该制剂复溶至10‑20mg/mL的浓度，然后用盐水或5%葡萄糖进一步稀释至0.2‑0.4mg/mL，并且静脉内推注或在15‑60分钟内静脉内输注给药。
肌内注射混悬剂：可制备以下溶液剂或混悬剂用于肌内注射：
50mg/mL期望的水不溶性的本发明化合物
5mg/mL羧甲基纤维素钠
4mg/mL TWEEN80
9mg/mL氯化钠
9mg/mL苯甲醇
硬胶囊剂：通过各自用100mg粉状活性成分、150mg乳糖、50mg纤维素和6mg硬脂酸镁填充标准的两片式硬胶囊来制备大量的单位胶囊剂。
软胶囊剂：制备活性成分在可消化的油例如大豆油、棉籽油或橄榄油 中的混合物并且通过容积式泵注入熔化的明胶中以形成包含100mg所述活性成分的软胶囊。将胶囊洗涤并干燥。可将所述活性成分溶解于聚乙二醇、甘油和山梨糖醇的混合物中以制备水混溶性药物混合物。
片剂：通过常规操作制备大量片剂，使得剂量单位包含100mg活性成分、0.2mg胶体二氧化硅、5mg硬脂酸镁、275mg微晶纤维素、11mg淀粉和98.8mg乳糖。可采用适当的水性和非水性包衣以增加适口性、改善外观和稳定性或延迟吸收。
速释片剂/胶囊剂：这些是通过常规方法和新方法制备的固体口服剂型。不需用水而将这些单位口服，用于药物的即刻溶出和递送。将所述活性成分混合在包含诸如糖、明胶、果胶和甜味剂的成分的液体中。通过冷冻干燥和固态萃取技术使这些液体固化成固体片剂或囊片。可将药物化合物与粘弹性和热弹性的糖和聚合物或泡腾组分一起压片以制备在不需要水的条件下速释的多孔基质。
组合治疗
可将本发明的化合物作为唯一药剂给药或者与一种或多种其他药剂组合给药，其中所述组合不会引起不可接受的不良作用。本发明还涉及此类组合。例如，可将本发明的化合物与已知的抗过度增殖性疾病或其他适应症的药剂等以及与它们的混合物和组合进行组合。其他适应症药剂包括但不限于抗血管生成剂、有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢剂、DNA‑嵌入抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、生物应答调节剂或抗激素。
另外的药剂可为阿地白介素、阿仑膦酸、α‑干扰素(alfaferone)、阿利维A酸、别嘌呤醇、注射用别嘌呤醇钠(aloprim)、盐酸帕洛诺司琼注射剂(aloxi)、六甲蜜胺、氨鲁米特、氨磷汀、氨柔比星、安吖啶、阿那曲唑、多拉司琼片(anzmet)、阿法达贝泊汀注射剂(aranesp)、arglabin、三氧化二砷、依西美坦片、5‑氮杂胞苷、硫唑嘌呤、BAY80‑6946、BCG或tice BCG、抑氨肽酶(bestatin)、醋酸倍他米松、倍他米松磷酸酯钠、贝沙罗汀、硫酸博来霉素、溴尿苷、硼替佐米、白消安、降钙素、阿仑单抗(campath)、卡培他滨、卡铂、比卡鲁胺、cefesone、西莫白介素、柔红霉素、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、克拉屈滨、氯膦酸、环磷酰胺、阿糖 胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、枸橼酸柔红霉素脂质体(DaunoXome)、地塞米松、地塞米松磷酸钠、戊酸雌二醇、地尼白介素2(denileukin diftitox)、甲基氢化泼尼松、地洛瑞林、右雷佐生、己烯雌酚、氟康唑、多西他赛、去氧氟尿苷、多柔比星、屈大麻酚、DW‑166HC、醋酸亮丙瑞林(eligard)、拉布立酶注射剂(elitek)、盐酸表柔比星注射剂(ellence)、阿瑞吡坦胶囊(emend)、表柔比星、阿法依伯汀(epoetin alfa)、阿法依伯汀(epogen)、依他铂、左旋咪唑、雌二醇(estrace)、雌二醇、雌莫司汀磷酸钠、炔雌醇、氨磷汀、依替膦酸、依托泊苷注射剂、依托泊苷、法倔唑、farston、非格司亭、非那雄胺、非格司亭、氟尿苷、氟康唑、氟达拉滨、单磷酸5‑氟脱氧尿苷、5‑氟尿嘧啶(5‑FU)、氟甲睾酮、氟他胺、福美坦、fosteabine、福莫司汀、氟维司群、γ‑球蛋白(gammagard)、吉西他滨、吉姆单抗、甲磺酸伊马替尼(gleevec)、卡氮芥糯米纸胶囊剂(gliadel)、戈舍瑞林、盐酸格拉司琼、组氨瑞林、托泊替康(hycamtin)、氢化可的松、红羟基壬基腺嘌呤(eyrthro‑hydroxynonyladenine)、羟基脲、替伊莫单抗、伊达比星、异环磷酰胺、α干扰素、α2干扰素、α‑2A干扰素、α‑2B干扰素、α‑n1干扰素、α‑n3干扰素、β干扰素、γ‑1a干扰素、白介素‑2、干扰素α(intron A)、吉非替尼片(iressa)、伊立替康、格拉司琼、硫酸香菇多糖、来曲唑、甲酰四氢叶酸、亮丙瑞林、醋酸亮丙瑞林、左旋咪唑、左亚叶酸钙盐(levofolinic acid calcium salt)、左甲状腺素钠(levothroid)、左甲状腺素钠(levoxyl)、洛莫司汀、氯尼达明、屈大麻酚、氮芥、甲钴胺、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、酯化雌激素片(menest)、6‑巯基嘌呤、美司钠、甲氨喋呤、美特维克、米替福新、米诺环素、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、曲洛司坦(Modrenal)、Myocet、奈达铂、非格司亭(neulasta)、重组人白介素11(neumega)、非格司亭(neupogen)、尼鲁米特、他莫昔芬、NSC‑631570、OCT‑43、奥曲肽、盐酸昂丹司琼、头孢沙定(orapred)、奥沙利铂、紫杉醇、泼尼松磷酸钠(pediapred)、培门冬酶、派罗欣、喷司他丁、溶链菌(picibanil)、盐酸毛果芸香碱、吡柔比星、普卡霉素、卟吩姆钠、泼尼莫司汀、泼尼松龙、泼尼松、马雌激素、丙卡巴肼、重组人类红细胞生成素α、雷替曲塞、RDEA119、重组人干扰素β1a注射液(rebif)、铼‑186羟乙膦酸盐、利妥昔单抗、罗扰素(roferon‑A)、罗莫肽、盐酸毛果芸香碱(salagen)、奥曲肽、沙格司亭、司莫司汀、西佐喃、索布佐生、泼尼松 龙、磷乙天冬氨酸、干细胞疗法、链佐星、氯化锶89、左甲状腺素钠、他莫昔芬、坦洛新、他索纳明、睾内酯、多西他赛注射液(taxotere)、替西白介素、替莫唑胺、替尼泊苷、丙酸睾酮、甲睾酮、硫鸟嘌呤、塞替派、促甲状腺素、替鲁膦酸、托泊替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、曲奥舒凡、维甲酸、甲氨蝶呤(trexall)、三甲基三聚氰胺、三甲曲沙、醋酸曲普瑞林、扑酸曲普瑞林、UFT、尿苷、戊柔比星、维司力农、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、维鲁利秦、右雷佐生、净司他丁斯酯(zinostatin stimalamer)、昂丹司琼、ABI‑007、acolbifene、干扰素γ‑1b(actimmune)、affinitak、氨基蝶呤、阿佐昔芬、asoprisnil、阿他美坦、阿曲生坦、索拉非尼(sorafenib)、Avastin、CCI‑779、CDC‑501、塞来昔布、西妥昔单抗、克立那托、醋酸环丙孕酮、地西他滨、DN‑101、多柔比星‑MTC、dSLIM、度他雄胺、edotecarin、依氟鸟氨酸、依沙替康、芬维A胺、二盐酸组胺、组氨瑞林水凝胶植入剂、钬‑166DOTMP、伊班膦酸、γ干扰素、PEG化干扰素α‑2b(intron‑PEG)、伊沙匹隆(ixabepilone)、匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、L‑651582、兰瑞肽、拉索昔芬、libra、法尼醇蛋白转移酶抑制剂(lonafarnib)、米泼昔芬、米诺膦酸(minodronate)、MS‑209、MTP‑PE脂质体、MX‑6、那法瑞林、奈莫柔比星、新伐司他、诺拉曲赛、oblimersen、onco‑TCS、osidem、聚谷氨酸紫杉醇、帕米膦酸二钠、PN‑401、QS‑21、夸西泮、R‑1549、雷洛昔芬、豹蛙酶、13‑顺式‑视黄酸、沙铂、西奥骨化醇、T‑138067、盐酸厄洛替尼片(tarceva)、taxoprexin、α‑1胸腺素、噻唑呋林、替吡法尼(tipifarnib)、替拉扎明、TLK‑286、托瑞米芬、TransMID‑107R、伐司朴达、伐普肽、瓦他拉尼(vatalanib)、维替泊芬、长春氟宁、Z‑100、唑来膦酸或它们的组合。
可加入所述组合物中的任选的抗过度增殖药剂包括但不限于第11版默克索引(1996)(援引加入本文)中的癌症化疗药物方案中所列的化合物，例如门冬酰胺酶、博来霉素、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、门冬酰胺酶、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、依托泊苷、5‑氟尿嘧啶、六甲蜜胺、羟基脲、异环磷酰胺、伊立替康、甲酰四氢叶酸、洛莫司汀、氮芥、6‑巯基嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素C、米托蒽醌、泼尼松龙、泼尼松、丙卡巴肼、雷洛昔芬、链佐星、他莫西芬、硫鸟嘌呤、托泊替康、长春碱、长春 新碱以及长春地辛。
适合与本发明的组合物一起使用的其他抗过度增殖药剂包括但不限于Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics(第9版),Molinoff等人编辑，McGraw‑Hill出版，第1225‑1287页(1996)(援引加入本文)中公认用于肿瘤疾病治疗的那些化合物，例如氨鲁米特、L‑门冬酰胺酶、硫唑嘌呤、5‑氮杂胞苷、克拉屈滨、白消安、己烯雌酚、2′,2′‑二氟脱氧胞苷、多西他赛、红羟基壬基腺嘌呤、炔雌醇、5‑氟脱氧尿苷、单磷酸5‑氟脱氧尿苷、磷酸氟达拉滨、氟甲睾酮、氟他胺、己酸羟孕酮、伊达比星、干扰素、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、米托坦、紫杉醇、喷司他丁、N‑膦酰基乙酰基‑L‑天冬氨酸盐(PALA)、普卡霉素、司莫司汀、替尼泊苷、丙酸睾酮、噻替派、三甲基三聚氰胺、尿苷以及长春瑞滨。
适合与本发明的组合物一起使用的其他抗过度增殖药剂包括但不限于其他抗癌药剂例如埃博霉素及其衍生物、伊立替康、雷洛昔芬和托泊替康。
还可将本发明的化合物与蛋白质治疗剂组合给药。适用于治疗癌症或其他血管生成病症并且适于和本发明的组合物一起使用的此类蛋白质治疗剂包括但不限于干扰素(例如α、β或γ干扰素)、超激动性单克隆抗体、Tuebingen、TRP‑1蛋白质疫苗、Colostrinin、抗‑FAP抗体、YH‑16、吉姆单抗、英夫利昔单抗、西妥昔单抗、曲妥珠单抗、地尼白介素2、利妥昔单抗、α1胸腺素、贝伐珠单抗、美卡舍明、美卡舍明林菲培(mecasermin rinfabate)、奥普瑞白介素、那他珠单抗、rhMBL、MFE‑CP1+ZD‑2767‑P、ABT‑828、ErbB2‑特异免疫毒素、SGN‑35、MT‑103、林菲培(rinfabate)、AS‑1402、B43‑染料木黄酮、L‑19系放射免疫治疗剂、AC‑9301、NY‑ESO‑1疫苗、IMC‑1C11、CT‑322、rhCC10、r(m)CRP、MORAb‑009、阿维库明(aviscumine)、MDX‑1307、Her‑2疫苗、APC‑8024、NGR‑hTNF、rhH1.3、IGN‑311、内皮抑素、伏洛昔单抗(volociximab)、PRO‑1762、来沙木单抗(lexatumumab)、SGN‑40、帕妥珠单抗(pertuzumab)、EMD‑273063、L19‑IL‑2融合蛋白、PRX‑321、CNTO‑328、MDX‑214、替加泊肽(tigapotide)、CAT‑3888、拉贝珠单抗(labetuzumab)、发射a粒子的放射性同位素交联的林妥珠单抗、EM‑ 1421、HyperAcute疫苗、西莫白介素单抗(tucotuzumab celmoleukin)、加利昔单抗(galiximab)、HPV‑16‑E7、Javelin‑前列腺癌、Javelin‑黑素瘤、NY‑ESO‑1疫苗、EGF疫苗、CYT‑004‑MelQbG10、WT1肽、奥戈伏单抗(oregovomab)、ofatumumab、扎鲁木单抗(zalutumumab)、贝辛白介素(cintredekin besudotox)、WX‑G250、Albuferon、aflibercept、地诺单抗(denosumab)、疫苗、CTP‑37、依芬古单抗(efungumab)或131I‑chTNT‑1/B。用作蛋白质治疗剂的单克隆抗体包括但不限于莫罗单抗‑CD3、阿昔单抗、依决洛单抗、达珠单抗、吉妥单抗(gentuzumab)、阿仑珠单抗、替伊莫单抗(ibritumomab)、西妥昔单抗、贝伐珠单抗、依法珠单抗(efalizumab)、阿达木单抗(adalimumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、莫罗单抗‑CD3、利妥昔单抗、达珠单抗、曲妥珠单抗、帕利珠单抗、巴利昔单抗以及英夫利昔单抗。
一般而言，将细胞毒性剂和/或细胞抑制剂与本发明的化合物或组合物组合使用会起到以下作用：
(1)与单独给药任一种药剂相比在减少肿瘤生长或者甚至消除肿瘤方面产生更好的功效，
(2)允许给药更少量的所给药的化疗药剂，
(3)提供化疗剂治疗，其被患者良好地耐受并且具有的有害药理学并发症比在单一药剂化疗和某些其他组合疗法中所观察到的少，
(4)允许治疗范围更广的哺乳动物特别是人的不同癌症类型，
(5)提供受治疗患者中更高的应答率，
(6)与标准的化疗治疗相比提供受治疗患者中更长的存活时间，
(7)提供更长的肿瘤进展时间，和/或
(8)与其他癌症药剂组合产生拮抗效应的已知情况相比，得到至少与单独使用的药剂一样好的功效和耐受性。
使细胞对放射敏感的方法
在本发明的一个不同的实施方案中，本发明的化合物可用于使细胞对放射敏感。即，在细胞的放射治疗之前用本发明的化合物治疗细胞使得所述细胞与未用本发明的化合物进行任何治疗时所述细胞的情况相比更容易发生DNA损伤和细胞死亡。在一个方面中，用至少一种本发明的化合物 治疗细胞。
因此，本发明还提供杀灭细胞的方法，其中将一种或多种本发明的化合物与常规放射疗法一起施用于细胞。
本发明还提供使细胞更容易发生细胞死亡的方法，其中在治疗所述细胞前用一种或多种本发明的化合物治疗所述细胞以引起或诱导细胞死亡。在一个方面中，用一种或多种本发明的化合物治疗所述细胞后，用至少一种化合物、至少一种方法或它们的组合治疗所述细胞以引起DNA损伤从而用于抑制正常细胞的功能或杀灭所述细胞。
在一个实施方案中，通过用至少一种DNA损伤剂治疗细胞将所述细胞杀灭。即，用一种或多种本发明的化合物治疗细胞使所述细胞对细胞死亡敏感后，用至少一种DNA损伤剂治疗所述细胞以杀灭所述细胞。用于本发明中的DNA损伤剂包括但不限于化疗剂(例如顺铂)、电离辐射(X‑射线、紫外线辐射)、致癌剂和致突变剂。
在另一实施方案中，通过用至少一种方法治疗细胞以引起或诱导DNA损伤将所述细胞杀灭。此类方法包括但不限于：激活细胞信号转导途径(当所述途径被激活时引起DNA损伤)、抑制细胞信号转导途径(当所述途径被抑制时引起DNA损伤)以及诱导细胞中的生物化学变化(其中所述变化引起DNA损伤)。作为非限制性实例，可抑制细胞中的DNA修复途径，由此阻止DNA损伤的修复并且导致细胞中DNA损伤的异常积累。
在本发明的一个方面，在进行辐射或进行引起细胞中DNA损伤的其它诱导之前给药本发明的化合物。在本发明的另一方面，在进行辐射或进行引起细胞的DNA损伤的其它诱导的同时给药本发明的化合物。在本发明的又一方面，在进行辐射或进行引起细胞的DNA损伤的其它诱导开始之后立即给药本发明的化合物。
在另一方面，所述细胞在体外。在另一实施方案中，所述细胞在体内。
如上文所述，已令人惊讶地发现本发明的化合物有效地抑制allo‑MEK并且因此可用于治疗或预防不受控制的细胞生长、增殖和/或存活、不适当的细胞免疫应答或不适当的细胞炎症应答的疾病，或者伴有不受控制的细胞生长、增殖和/或存活、不适当的细胞免疫应答或不适当的细胞炎症应答的疾病，特别地，其中所述不受控制的细胞生长、增殖和/或存活、不适当 的细胞免疫应答或不适当的细胞炎症应答是由allo‑MEK介导的，例如血液肿瘤、实体瘤和/或它们的转移，如白血病和骨髓增生异常综合征、恶性淋巴瘤、包括脑瘤和脑转移在内的头颈部肿瘤、包括非小细胞肺肿瘤和小细胞肺肿瘤在内的胸部肿瘤、胃肠道肿瘤、内分泌肿瘤、乳腺肿瘤和其他妇科肿瘤、包括肾肿瘤、膀胱瘤和前列腺瘤在内的泌尿系统肿瘤、皮肤肿瘤和肉瘤、和/或它们的转移。
因此，根据另一方面，本发明涉及如本文所述和定义的通式(I)的化合物、其立体异构体、互变异构体、N‑氧化物、水合物、溶剂合物、或盐特别是药学可接受的盐、或者它们的混合物，其用于治疗或预防如上文所述的疾病。
因此，本发明的另一具体方面是如上文所述的通式(I)的化合物用于制备治疗或预防疾病的药物组合物的用途。
前两段中所提及的疾病是不受控制的细胞生长、增殖和/或存活、不适当的细胞免疫应答或不适当的细胞炎症应答的疾病，或者伴有不受控制的细胞生长、增殖和/或存活、不适当的细胞免疫应答或不适当的细胞炎症应答的疾病，特别地，其中所述不受控制的细胞生长、增殖和/或存活、不适当的细胞免疫应答或不适当的细胞炎症应答是由Mps‑1介导的，例如血液肿瘤、实体瘤和/或它们的转移，如白血病和骨髓增生异常综合征、恶性淋巴瘤、包括脑瘤和脑转移在内的头颈部肿瘤、包括非小细胞肺肿瘤和小细胞肺肿瘤在内的胸部肿瘤、胃肠道肿瘤、内分泌肿瘤、乳腺肿瘤和其他妇科肿瘤、包括肾肿瘤、膀胱瘤和前列腺瘤在内的泌尿系统肿瘤、皮肤肿瘤和肉瘤、和/或它们的转移。
在本发明的语境中，特别是如本文所使用的在“不适当的免疫应答或不适当的细胞炎症应答”的语境中，术语“不适当的”应理解为优选表示比正常应答更弱或更强并且与所述疾病的病理相关、引起或导致所述疾病的病理的应答。
优选地，所述用途是用于疾病的治疗或预防，其中所述疾病是血液肿瘤、实体瘤和/或它们的转移。
治疗过度增殖性病症的方法
本发明涉及使用本发明化合物及其组合物治疗哺乳动物的过度增殖性 病症的方法。可利用化合物来抑制、阻断、降低、减少(等等)细胞增殖和/或细胞分裂和/或引起凋亡。该方法包括向有此需要的包括人在内的哺乳动物给药一定量的可有效治疗所述病症的本发明化合物、其药学可接受的盐、异构体、多晶型物、代谢物、水合物、溶剂合物或酯等。过度增殖性病症包括但不限于银屑病、瘢痕疙瘩和其他影响皮肤的增生、良性前列腺增生(BPH)、实体瘤例如乳腺癌、呼吸道癌、脑癌、生殖器官癌、消化道癌、泌尿道癌、眼癌、肝癌、皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌以及它们的远端转移。所述病症还包括淋巴瘤、肉瘤和白血病。
乳腺癌的实例包括但不限于浸润性导管癌、浸润性小叶癌、原位导管癌和原位小叶癌。
呼吸道癌症的实例包括但不限于小细胞肺癌和非小细胞肺癌以及支气管腺瘤和胸膜肺母细胞瘤。
脑癌的实例包括但不限于脑干和下丘脑胶质瘤、小脑和大脑星形细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤以及神经外胚层瘤和松果体瘤。
男性生殖器官肿瘤包括但不限于前列腺癌和睾丸癌。女性生殖器官肿瘤包括但不限于子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌和外阴癌以及子宫肉瘤。
消化道肿瘤包括但不限于肛门癌、结肠癌、结直肠癌、食管癌、胆囊癌、胃癌、胰腺癌、直肠癌、小肠癌和唾液腺癌。
泌尿道肿瘤包括但不限于膀胱癌、阴茎癌、肾癌、肾盂癌、输尿管癌、尿道癌以及人乳头状肾癌。
眼癌包括但不限于眼内黑素瘤和视网膜母细胞瘤。
肝癌的实例包括但不限于肝细胞癌(有或无纤维板层变异的肝细胞癌)、胆管上皮癌(肝内胆管癌)和混合性肝细胞胆管上皮癌。
皮肤癌包括但不限于鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、恶性黑素瘤、梅克尔细胞皮肤癌以及非黑素瘤皮肤癌。
头颈癌包括但不限于喉癌、下咽癌、鼻咽癌、口咽癌、唇癌、口腔癌以及鳞状上皮细胞。淋巴瘤包括但不限于爱滋病相关淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金病以及中枢神经系统淋巴瘤。
肉瘤包括但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴 肉瘤以及横纹肌肉瘤。
白血病包括但不限于急性髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病以及多毛细胞白血病。
这些病症已在人类中得到良好的表征，但是还以相似的病因学存在于其他哺乳动物中，并且可通过给药本发明的药物组合物进行治疗。
本文件通篇提及的术语“治疗”的使用是常规的，例如为了抵抗、减轻、减少、缓解、改善诸如肉瘤的疾病或病症的情况等。
治疗激酶病症的方法
本发明还提供用于治疗与异常的丝裂原胞外激酶活性相关的病症的方法，所述病症包括但不限于中风、心力衰竭、肝大、心脏扩大症、糖尿病、阿尔茨海默氏病、囊性纤维化病、异种移植物排斥的症状、感染性休克或哮喘。
有效量的本发明化合物可用于治疗此类病症，包括上文背景技术部分提及的那些疾病(例如癌症)。而且，可用本发明的化合物治疗此类癌症和其他疾病，而与作用机制和/或所述激酶与所述病症的关系无关。
短语“异常的激酶活性”或“异常的酪氨酸激酶活性”包括编码所述激酶的基因或其编码的多肽的任何异常表达或活性。此类异常活性的实例包括但不限于所述基因或多肽的过度表达；基因扩增；产生组成型活性的或高活性的激酶活性的突变；基因突变、缺失、置换、添加等。
本发明还提供抑制激酶活性特别是丝裂原胞外激酶活性的方法，所述方法包括给药有效量的本发明化合物，包括其盐、多晶型物、代谢物、水合物、溶剂合物、前药(例如酯)以及其非对映异构体形式。可在细胞中(例如体外)或在哺乳动物个体特别是需要治疗的人类患者的细胞中抑制激酶活性。
治疗血管生成病症的方法
本发明还提供治疗与过度和/或异常的血管生成相关的病症和疾病的方法。
血管生成的不适当表达和异常表达对生物体可能是有害的。许多病理状态与无关(extraneous)血管的生长相关。这些包括例如糖尿病性视网膜 病、缺血性视网膜静脉阻塞以及早产儿视网膜病[Aiello等人，New Engl.J.Med.1994,331,1480；Peer等人，Lab.Invest.1995,72,638]、年龄相关性黄斑变性[AMD；参见Lopez等人Invest.Opththalmol.Vis.Vis.1996,37,855]、新生血管性青光眼、银屑病、晶体后纤维增生症、血管纤维瘤、炎症、类风湿性关节炎(RA)、再狭窄、支架内再狭窄、血管移植后再狭窄等。另外，与癌组织和肿瘤组织相关的血液供给增加促进生长，导致快速的肿瘤增大和转移。此外，肿瘤中新血管和淋巴管的生长为癌变细胞(renegade cells)提供了离开途径，促进转移并且导致癌症扩散。因此，可使用本发明的化合物来治疗和/或预防任何前文提及的血管生成病症，其方式为例如抑制和/或减少血管形成；抑制、阻断、降低、减少(等等)内皮细胞增殖或与血管生成相关的其他类型，以及引起此类细胞的细胞死亡或凋亡。
剂量和给药
基于已知用来评价用于治疗过度增殖性病症和血管生成病症的化合物的标准实验室技术，通过标准毒性试验以及通过用于确定对哺乳动物中上文所述病症的治疗的标准药理学试验，并且通过将这些结果与用于治疗这些病症的已知药物的结果进行比较，可容易地确定用于治疗每一种期望适应症的本发明化合物的有效剂量。在这些病症之一的治疗中所给药的活性成分的量可根据如下考量而发生很大变化：所使用的具体化合物和剂量单位、给药方式、疗程、受治疗患者的年龄和性别以及被治疗病症的性质和程度。
待给药的活性成分的总量一般为约0.001mg/kg‑约200mg/kg体重/天，并且优选约0.01mg/kg‑约20mg/kg体重/天。临床上有用的给药方案会是每日一至三次的给药至每四周一次的给药。另外，“停药期”(其中在某一段时间内不给予患者药物)对于药理学效力和耐受性之间的整体平衡可能是有利的。单位剂量可包含约0.5mg‑约1500mg活性成分，并且可每日一次或多次地给药，或者少于每日一次地给药。通过包括静脉内、肌内、皮下和肠胃外注射在内的注射以及使用输注技术给药的平均每日剂量优选可以为0.01‑200mg/kg总体重。平均每日直肠剂量方案优选为0.01‑200mg/kg总体重。平均每日阴道剂量方案优选为0.01‑200mg/kg总体重。平 均每日局部剂量方案优选为每日一至四次给药0.1‑200mg。透皮浓度优选为维持0.01‑200mg/kg的每日剂量所需要的浓度。平均每日吸入剂量方案优选为0.01‑100mg/kg总体重。
当然每一名患者的具体的起始剂量和维持剂量方案会根据以下因素而变化：临床诊断医生所确定的病症的性质和严重度、所使用的具体化合物的活性、所述患者的年龄和整体健康状况、给药时间、给药途径、药物的排泄速率、药物组合等。因此，本发明的化合物、其药学可接受的盐、酯或组合物的期望的治疗方式和给药数量可由本领域技术人员利用常规的治疗试验来确定。
优选地，所述方法所针对的疾病是血液肿瘤、实体瘤和/或它们的转移。
本发明的化合物尤其可用于治疗和防止(即预防)肿瘤生长和转移，特别是接受或未接受所述肿瘤生长的预治疗的所有适应症和阶段的实体瘤的肿瘤生长和转移。
具体的药理学性质或药物性质的测定方法是本领域技术人员公知的。
本文描述的实施例测定实验用于举例说明本发明并且本发明不限于所提供的实施例。
生物学评价
本发明化合物的效用可以通过例如下述体外肿瘤细胞增殖实验中它们的体外活性来说明。本领域中已很好地确定了体外肿瘤细胞增殖实验中的活性与临床环境中抗肿瘤活性之间的联系。例如,紫杉醇(Silvestrini等人，Stem Cells1993,11(6),528‑35)、泰帝索(Bissery等人，Anti Cancer Drugs1995,6(3),339)和拓扑异构酶抑制剂(Edelman等人，Cancer Chemother.Pharmacol.1996,37(5),385‑93))的治疗效果是由体外肿瘤增殖测定中的效用证明的。
通过本领域公知的体外、先体外后体内和体内测定可以表明本发明化合物的活性。例如,为了表明本发明化合物的活性，可以采用以下测定。
生物学测定
体外肿瘤细胞增殖测定：
增殖测定
用于试验本发明化合物的粘附肿瘤细胞增殖测定包括由Promega开发的称作Cell Titer‑Glo读出器(Cunningham,BA"A Growing Issue:Cell Proliferation Assays.Modern kits ease quantification of cell growth"The Scientist2001,15(13),26,和Crouch,S P等人,"The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity"Journal of Immunological Methods1993,160,81‑88)。
测定1：HCT116Cell Titer Glo(CTG)增殖测定：
将HCT116细胞[人结直肠细胞系，表达突变型BRAF V600E]以3000细胞/孔的密度接种在于37°C下温育的96孔黑透底组织培养板(Costar3603黑/透底)中，每孔100μl具有10%胎牛血清(FBS)和稳定谷氨酰胺的DMEM培养基(DMEM/Ham’s F12)。在单独的平板上接种姐妹孔用于时间零测定。所有平板在37°C下温育过夜。取下时间零平板：将100μl/孔CTG溶液(Promega Cell Titer Glo溶液)添加到姐妹平板的时间零孔中；将平板在定轨摇床上混合2min，以确保细胞溶解，温育10分钟，在VICTOR3(Perkin Elmer)上读取发光。细胞接种后24小时，将试验化合物稀释在50μl培养基中，并以范围为10μM高至300pM低的终浓度添加，取决于DMSO终浓度为0.4%的连续稀释的试验化合物的活性。加入试验化合物后，将孔在37°C下温育72小时。然后，使用Promega Cell Titer Glo测定试剂盒，将包含荧光素酶和其底物荧光素的混合物的100μl溶胞缓冲液添加到各孔中，并在黑暗中在室温下培养10min，以稳定发光信号。使用发光方案在VICTOR3(Perkin Elmer)上读取样品。通过将测量值相对于零点板的消光(=0%)和未治疗(0μM)细胞的消光(=100%)进行标准化，计算细胞生长的百分比改变。使用公司自有软件，通过4参数拟合测定IC50值。
测定2：A549Cell Titer Glo(CTG)增殖测定：
将A549细胞[人非小细胞肺癌细胞系，表达突变型K‑Ras G12S]以2000细胞/孔的密度接种在于37°C下温育的96孔黑透底组织培养板(Costar3603黑/透底)中，每孔100μl具有10%胎牛血清(FBS)和稳定谷氨酰胺的DMEM培养基(DMEM/Ham’s F12)。利用与以上关于HCT116细胞所述相同的方案进行A549细胞的Cell Titer Glo增殖测定。
测定3：Colo205Cell Titer Glo(CTG)增殖测定：
将Colo205细胞以3000细胞/孔接种在96孔组织培养板中的补充了10%FBS的RPMI1640生长培养基中。将细胞在含有5%CO2的增湿培养箱中于37℃温育过夜。在接下来的一天，将试验化合物添加到孔中，连续稀释在包含10%FBS和0.03%DMSO的RPMI1640培养基中，并将平板在37℃下温育72h。在不同时间点（给药后0和72h），通过向各孔添加Cell Titer Glo试剂(cat#G7572,Promega,Madison WI)，然后将平板在振荡器上于室温下培养10min，然后在Victor3仪器上读取发光，来进行细胞密度的评价。对于IC50分析，使用Analyze5软件进行数据分析。
测定4：A375Cell Titer Glo(CTG)增殖测定：
将A375细胞[人恶性黑素瘤细胞，ATCC#CRL‑1619，表达突变型BRAF V600E]以3000细胞/孔的密度接种在于37°C下温育的96孔黑透底组织培养板(Costar3603黑/透底)中，每孔100μl具有10%胎牛血清(FBS)和稳定谷氨酰胺的DMEM培养基(Biochrom;FG0435;+3,7g/L碳酸氢钠;+4,5g/L D‑葡萄糖)。在单独的平板上接种姐妹孔用于时间零测定。所述平板在37°C下温育过夜。取下时间零平板：将67μl/孔CTG溶液(Promega Cell Titer Glo溶液)添加到姐妹平板的时间零孔中；将平板在定轨摇床上混合2min，以确保细胞溶解，温育10分钟，在VICTOR3(Perkin Elmer)上读取发光。细胞接种后24小时，将稀释在50μl培养基中的试验化合物以范围为10μM高至300pM低的终浓度添加，取决于DMSO终浓度为0.4%的连续稀释的试验化合物的活性。加入试验化合物后，将孔在37°C下温育72小时。然后，使用Promega Cell Titer Glo测定试剂盒，将包含荧光素酶和其底物荧光素的混合物的100μl溶胞缓冲液添加到各孔 中，并在黑暗中在室温下培养10min，以稳定发光信号。使用发光方案在VICTOR3(Perkin Elmer)上读取样品。通过将测量值相对于零点板的消光(=0%)和未治疗(0μM)细胞的消光(=100%)进行标准化，计算细胞生长的百分比改变。使用公司自有软件，通过4参数拟合测定IC50值。
或者，通过结晶紫(CV)染色测定细胞增殖：
测定5：A375结晶紫(CV)增殖测定：
通过结晶紫(CV)染色测定A375细胞[人黑素瘤细胞系，表达突变型BRAF V600E]的细胞增殖：将培养的人A375细胞以1500细胞/测量点的密度接种在96孔微量滴定板的200μl生长培养基(具有10%FBS和2mM谷氨酰胺的DMEM/HAMS F12)中。24小时后，用结晶紫（见下文）将来自平板（零平板）的细胞染色，而其他平板中的培养基被其中已添加了不同浓度(0μM,和0.3nM‑30μM的范围;溶剂二甲基亚砜的终浓度为0.5%)的试验物质的新鲜培养基(200μl)替换。在试验物质的存在下将细胞培养4天。通过结晶紫将细胞染色来测定细胞增殖：通过每测量点加入20μl11%戊二醛溶液将细胞在室温下固定15min。将固定的细胞用水洗涤三次，然后将平板在室温下干燥。通过每测量点加入100μl0.1%结晶紫溶液(通过加入乙酸将pH调节至pH3)，将细胞染色。将染色的细胞用水洗涤三次，然后将平板在室温下干燥。通过每测量点加入100μl10%乙酸溶液溶解染料，并通过光度测定法在595nm波长处测定消光。通过将测量值相对于零点板的消光(=0%)和未治疗(0μM)细胞的消光(=100%)进行标准化，计算细胞生长的百分比改变。使用公司自有软件，通过4参数拟合测定IC50值。
或者，可以如下进行结晶紫(CV)染色测定：
测定6：A375结晶紫(CV)增殖测定的其他条件：
将培养的人A375细胞以1500细胞/测量点的密度接种在96孔微量滴定板的200μl生长培养基(具有10%FBS和2mM谷氨酰胺的DMEM/HAMS F12(Biochrom;FG4815))中。24小时后，用结晶紫（见下文）将来自平板（零平板）的细胞染色，而其他平板中的培养基被其中已添加了不同浓度(0μM,和0.3nM‑30μM的范围;溶剂二甲基亚砜的终浓度为0.5%) 的试验物质的新鲜培养基(200μl)替换。在试验物质的存在下将细胞培养4天。通过结晶紫将细胞染色来测定细胞增殖。通过每测量点加入20μl11%戊二醛溶液将细胞在室温下固定15min。将固定的细胞用水洗涤三次，然后将平板在室温下干燥。通过每测量点加入100μl0.1%结晶紫溶液(通过加入乙酸将pH调节至pH3)，将细胞染色。将染色的细胞用水洗涤三次，然后将平板在室温下干燥。通过每测量点加入100μl10%乙酸溶液溶解染料，并通过光度测定法在595nm波长处测定消光。通过将测量值相对于零点板的消光(=0%)和未治疗(0μM)细胞的消光(=100%)进行标准化，计算细胞生长的百分比改变。使用公司自有软件，通过4参数拟合测定IC50值。
与上述方法类似地，可以测定其他细胞系增殖的体外抑制。以下提供示例性的其它肿瘤细胞系的细节：
另外，以下测定可用于评价本发明化合物的生物学重要性。
测定7：抑制人碳酸酐酶1和2
本发明的原理基于通过碳酸酐酶水解4‑硝基苯基乙酸酯，随后进行染料4‑硝基酚盐的光度测定(Pocker&Stone,Biochemistry,1967,6,668)。
以0.03‑10μM(最终)的浓度将溶于DMSO(100x终浓度)的2μl试验化合物吸移入（4x测定）96孔微量滴定板的孔中。包含溶剂但不含试验化合物的孔用作参照值(1.没有碳酸酐酶的孔用于底物的非酶水解的校正，以及2.具有碳酸酐酶的孔用于测定未抑制的酶的活性)。
将具有或不具有3单位/孔的碳酸酐酶I或II(Sigma‑Aldrich#C4396,resp.Sigma‑Adrich#C6165)的188μl测定缓冲液(10mM Tris/HCl,pH7.4,80mM NaCl)吸移入微量滴定板的孔中。通过加入10μl底物溶液(溶于无水乙腈中的1mM4‑硝基苯基乙酸酯(Fluka#4602))(终浓度:50μM)启动酶反应。将平板在室温下温育60分钟。通过光度测定法在400nm波长处测定消光。在将测量值相对于无酶孔的反应的消光(=100%抑制)和未抑制酶的孔的反应的消光(=0%抑制)进行标准化之后，计算酶抑制。使用公司自有软件，通过4参数拟合测定IC50值。
测定8：测定血和血浆之间的化合物分布（血/血浆比）
使用0.5ml新鲜的肝素化(人)血（其已加入了不同浓度的药物（血中的最大溶剂浓度为0.5%）并充分混合），评价了试验化合物在(人)血中的浓度(Cbl)相对于其血浆浓度(Cpl)，即血/血浆比。在架空振荡器中于37°C温育15min后，通过以1000xg离心制备血浆。通过向血浆加入不同量的 药物和连续稀释，制备由至少5个浓度点组成的校正曲线。用4倍体积的包含适当量内标的甲醇使校正样品和平行三份血浆样品沉淀，于‑20°C培养过夜，并以2000xg离心20min。通过LC‑MS分析上清液，并由校正曲线估计血浆中的药物浓度。
(人)血/血浆比计算为：Cbl/Cpl=加入的药物在血中的浓度(标称值)/血浆浓度(测量值)。
测定9
MEK生物化学测定：DELFIA
DELFIA MEK激酶测定用于监测MEK抑制剂的活性。通过首先将70μL激酶反应缓冲液(50mM HEPES pH7.5,5mM NaF,5mM磷酸甘油,1mM钒酸钠,10mM MgCl2,1mM DTT和1%(v/v)DMSO)与20nM GST‑MEK、20nM His‑Raf和100nM生物素化ERK1(终浓度)混合，在96孔微量滴定板中进行激酶反应。然后，加入终浓度为1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM、0.003μM、0.001μM、0.0003μM和0μM的化合物，以生成剂量反应抑制曲线。通过加入20μL ATP(终浓度100μM)启动激酶反应。2h温育后，通过加入20μl0.5M EDTA终止反应。然后，将100μL反应混合物转移到96孔链霉亲和素平板(cat#15120,Pierce Inc.Rockford,IL)中，然后温育2h。收集生物素化底物ERK1，然后用TBST洗涤平板。加入抗磷酸‑p44/42MAPK抗体(cat#91065,Cell Signaling Technologies,Danvers,MA)并与磷酸化底物结合。之后，与铕标记的抗小鼠抗体(cat#AD0124,Wallac Inc,Turku,Finland)温育，然后进行洗涤步骤。加入增强溶液以使铕离子解离进入溶液，它们在所述溶液中与增强溶液的组分形成高度荧光的螯合物。各样品的荧光与激酶活性成比例，并且在VICTOR5仪器(Wallac Inc.)上计数。对于IC50分析，使用Analyze5软件进行数据分析。
测定10
MEK1激活激酶测定
激酶Cot1通过磷酸化MEK1的激活环将其激活。使用以下段落描述的HTRF测定定量本发明化合物对该MEK1激活的抑制活性。
使用表达于昆虫细胞(SF21)中并通过Ni‑NTA亲和色谱纯化的人Cot1N‑端His6‑标记的重组激酶结构域(氨基酸30–397，购自Millipore,cat.no14‑703)作为激酶。使用无活性C‑端His6‑标记的GST‑MEK1融合蛋白(Millipore cat.no14‑420)作为激酶反应的底物。
为了测定，将50nl的浓缩100倍的试验化合物在DMSO中的溶液吸移入黑色小体积的384孔微量滴定板(Greiner Bio‑One,Frickenhausen,Germany)中，加入24nM GST‑MEK1和166.7μM腺苷三磷酸(ATP)在测定缓冲液[50mM TRIS/HCl pH7.5,5mM MgCl2,2mM二硫苏糖醇,0.01%(v/v)Igepal CA630(Sigma),5mMβ‑磷酸甘油]中的溶液(3μl)，并在22°C下温育混合物10min，以使试验化合物与GST‑MEK1在激酶反应开始之前预先结合。然后，通过加入Cot1在测定缓冲液中的溶液2μl启动激酶反应，并将所得混合物在22°C下温育20min的反应时间。在该测定中，根据酶批次的活性，调节Cot1的浓度，并适当选择Cot1的浓度以使该测定在线性范围内，典型的酶浓度是约2ng/μl(在5μl测定体积中的终浓度)。通过加入HTRF检测试剂(13nM抗GST‑XL665[#61GSTXLB,Fa.Cis Biointernational,Marcoule,France],1nM Eu‑穴状化合物标记的抗磷酸‑MEK1/2(Ser217/221)[#61P17KAZ,Fa.Cis Biointernational])在EDTA水溶液(100mM EDTA,500mM KF,于100mM HEPES/NaOH中的0.2%(w/v)牛血清白蛋白pH7.5)中的溶液（5μl）终止反应。
将所得混合物在22°C温育2h，以使磷酸化的GST‑MEK1结合至抗GST‑XL665和Eu‑穴状化合物标记的抗磷酸‑MEK1/2抗体。然后，通过测定由Eu‑穴状化合物标记的抗磷酸‑MEK1/2抗体向抗GST‑XL665的共振能转移，评价Ser217/Ser221磷酸化底物的量。因此，在HTRF读数器，例如Rubystar(BMG Labtechnologies,Offenburg,Germany)或Viewlux(Perkin‑Elmer)中测定在350nm处激发后在620nm和665nm处的荧光发射。在665nm与在622nm处的发射的比值视为磷酸化底物的量的量度。将数据标准化(无抑制剂的酶反应=0%抑制，除了酶之外的所有其他测定组分=100%抑制)。通常，在相同的微量滴定板上，以20μM‑1nM范围内的10种不同浓度(20μM,6.7μM,2.2μM,0.74μM,0.25μM,82nM,27nM,9.2nM,3.1nM和1nM,在测定前，在浓缩100倍的储备溶液的水 平，通过1:3系列稀释制备该稀释系列)，平行双份地测定各浓度的试验化合物的值，并使用自身软件按照4参数拟合计算IC50值。
测定11
磷酸‑ERK机制测定
将A375和Colo205细胞以25000细胞/孔接种在96孔组织培养板中的补充了10%FBS的RPMI1640生长培养基中。将细胞在含有5%CO2的增湿培养箱中于37℃温育过夜。在接下来的一天，为了制备测定板，在室温下用100μl5%MSD封闭缓冲液将抗兔Meso‑Scale Discovery(MSD)平板(cat#L41RA‑1,Meso‑Scale Discovery,Gaithersburg,MD)封闭1h，然后用200μl TBST缓冲液将它们洗涤3次。将以1:200稀释在2.5%MSD Blocker A‑TBST中的抗磷酸‑ERK兔多克隆抗体加(25μl)到各孔中，然后将平板在室温下并在振摇下温育1h。然后，将平板用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次并准备好接受细胞溶胞产物。在进行测定平板的制备的时候，将试验化合物添加到来自前一天的含细胞的平板的孔中，连续稀释在含有10%FBS、0.1%牛血清白蛋白(BSA)和0.03%DMSO的RPMI1640培养基中，并将平板在37℃温育1.5h。在该温育之后，将化合物处理的平板用PBS洗涤三次，在30μl Bio‑Rad溶胞缓冲液(cat#98601,Bio‑Rad Laboratories,Hercules,CA)中溶解，然后在冰上振摇30min。然后，将溶胞产物加到磷酸‑ERK涂覆的MSD平板上，并将平板在4℃温育过夜。在接下来的一天，将平板用TBST洗涤三次，并向平板加入25μl1:3000稀释的总ERK单克隆抗体(Cat#610123,BD Biosciences,San Diego,CA)，然后将平板在室温下并在振摇下温育1h。温育后，如前所述将平板用TBST洗涤三次，并向各孔加入25μl以1:1000稀释的MSD sulfo‑tag抗小鼠抗体(cat#R32AC‑5)。在室温下并在振摇下将平板温育1h，然后用TBST洗涤四次。邻读板前，加入150μl MSD Read缓冲液T并立即在MSD仪器上读取平板。对于IC50分析，使用Analyze5软件进行数据分析。
测定12
机制性pERK测定的其他条件
为了测定肿瘤细胞系中的ERK1/2磷酸化，使用Singleplex Mesoscale Discovery(MSD)。像夹心免疫测定那样建立该测定。将产生自用连续稀释的MEK抑制剂化合物处理的不同肿瘤细胞系的细胞溶胞产物加到MSD板上。存在于样品中的磷酸化的ERK1/2结合至固定化在工作电极表面的包被抗体。通过使检测抗体结合固定化的磷酸‑ERK1/2完成夹心。该检测抗体用电化学发光化合物标记。向平板电极施加电压导致通过抗体‑磷酸ERK1/2夹心复合物与电极表面结合的标记发光。发光的测定提供存在于样品中的磷酸化的ERK1/2的量的定量测定。详细而言，对于测定所用的每一细胞系，通过逐渐增加细胞数，必须测得磷酸ERK信号测定的线性范围。对于最终测定，将之前测定的细胞数接种在96孔板中。接种后24h，用连续稀释的变构MEK抑制剂化合物处理细胞1.5h，然后将细胞溶解并将溶胞产物转移到MSD测定平板中。改变了生产商的方案，因为磷酸化的ERK与包被抗体的结合是在4°C下过夜进行的，而不是在室温下进行3h，这产生更好的信号强度。
将A375或Colo205细胞分别以45000细胞/孔接种在96孔组织培养板的50μL补充了10%FBS(Biochrom#S0410)的DMEM生长培养基(Biochrom FG0435)(A375)、补充了10%FBS(Biochrom#S0410)、10mMHEPES(Biochrom L1613)、4.5g/L葡萄糖和1mM丙酮酸钠(Biochrom L0473)的RPMI生长培养基(Biochrom FG1215)(Colo‑205)中。将细胞在含有5%CO2的增湿培养箱中于37℃温育过夜。
按照生产商的推荐，利用Mesoscale Discovery(MSD)(#K111DWD)进行磷酸‑ERK测定。简言之，方案为：
在制备测定平板的细胞接种后的那天，在室温下用150μl MSD封闭缓冲液将MSD封闭1h，之后将它们用150μl Tris清洗缓冲液洗涤四次。在进行测定平板的制备的时候，将试验化合物添加到来自前一天的含细胞的平板的孔中，连续稀释在含有10%FBS和0.1%DMSO的相应生长培养基中，并将平板在37℃温育1.5‑2h。在该温育后，向培养基通气，将细胞溶解在50μl溶胞缓冲液中，然后在4°C下振摇30min。然后将25μL溶胞产物加到封闭的MSD平板上，并在4°C将平板温育过夜。在接下来 的一天，将平板用Tris清洗缓冲液洗涤四次，并向平板添加25μl检测抗体溶液，然后将平板在室温下并在振摇下温育1h。在温育后，将平板用Tris清洗缓冲液洗涤四次，加入150μl MSD Read缓冲液T，并立即在MSD仪器上读取平板。对于IC50分析，使用自身软件进行数据分析。
测定13
体内效力研究：阶段性人类异种移植物模型
使用人BRAF突变型黑素瘤和结肠癌的异种移植物模型，在小鼠中评价了先导化合物的体内抗肿瘤活性。向雌性无胸腺NCR裸鼠皮下移植得自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Maryland)的人黑素瘤(LOX)或人结肠癌(Colo205)细胞系。当肿瘤尺寸达到约100mg时，开始治疗。化合物口服给药并新鲜配制在PEG/水(分别80%/20%)中。每天监测小鼠的一般健康并记录死亡率。由治疗第一天开始，每周两次记录肿瘤尺寸和体重。按照Bayer IACUC指南将动物安乐死。产生大于20%的致死率和/或20%净重损失的治疗被认为是“有毒的”。
每周三次用电子测径器测量肿瘤生长，肿瘤重量(mg)按照下式计算：[长(mm)x宽(mm)2]/2。根据肿瘤生长抑制(%TGI)测定抗肿瘤效力。使用下式，计算治疗天数的TGI：(100–治疗的肿瘤平均值(T)/对照的重量平均值(C)x100)=%T/C。计算中使用的对照是“未治疗的对照”或“载体”，任何一个提供最保守的数据代表。显示大于或等于50%的TGI的化合物被认为是有活性的。使用单尾或双尾T检验测定统计学显著性。试验化合物在LOX和Colo205两个模型中均显示显著的剂量依赖性肿瘤生长抑制。
测定14
脑渗透
在雌性NMRI小鼠中，在静脉给药后，评价了试验化合物进入脑的渗透。以良好耐受的量使用诸如PEG400或乙醇的增溶剂，以溶液形式将试验化合物以5mg/kg的标准剂量给药。在给药后第5min、15min、30min、1h和3h处死各组动物（每组3只动物），并对血和脑取样。将血收集到肝素锂试管中并在3000rpm下离心15min。从上清液（血浆）取100μL的等分部分，通过加入400μL冷乙腈沉淀并 在‑20°C下冷冻过夜。用50mM Tris‑HCl缓冲液（pH7.5(1:5w/v)）将脑样品匀浆，用乙腈(1:5,v/v)沉淀并在‑20°C下冷冻过夜。然后将血浆和脑样品融化并在4°C以3000rpm离心20分钟。取上清液等分部分，使用具有LCMS/MS检测的Agilent1200HPLC系统进行分析试验。
由浓度‑时间曲线计算血浆和脑中的AUC(浓度‑时间曲线下面积)，AUC脑/AUC血浆比值报告为脑‑血浆比。由于未灌流脑组织中残留血液，利用该方法的脑‑血浆比的下限约为1‑2%。
测定15
大鼠体内的药代动力学
对于体内药代动力学实验，向大鼠以0.5‑1mg/kg的剂量静脉内给药以及以1‑10mg/kg的剂量灌胃给药配制成溶液（以良好耐受的量使用诸如PEG400的增溶剂）的试验化合物。
对于静脉给药后的药代动力学，以静脉推注给药试验化合物，并在给药后第2min、8min、15min、30min、45min、1h、2h、4h、6h、8h和24h时对血和脑取样。取决于预期的半衰期，在更迟的时间点(例如第48h、72h)取额外的样品。对于灌胃给药后的药代动力学，向禁食大鼠灌胃给药试验化合物，并在给药后第5min、15min、30min、45min、1h、2h、4h、6h、8h和24h时取血样。取决于预期的半衰期，在更迟的时间点(例如第48h、72h)取额外的样品。将血收集到肝素锂试管 中并在3000rpm下离心15min。从上清液（血浆）取100μL的等分部分，通过加入400μL冷乙腈沉淀并在‑20°C冷冻过夜。然后将样品融化并在4°C以3000rpm离心20分钟。取上清液等分部分，使用具有LCMS/MS检测的Agilent1200HPLC系统进行分析试验。通过非房室分析，使用PK计算软件计算PK参数。
得自i.v.后的浓度‑时间曲线的PK：试验化合物的CL血浆：总血浆清除率(L/kg/h)；试验化合物的CL血液：总血液清除率：CL血浆*Cp/Cb(L/kg/h)，其中Cp/Cb为血浆和血液中浓度的比。由i.g.后的浓度‑时间曲线计算得到的PK参数：Cmax：最大血浆浓度(mg/L);Cmaxnorm：Cmax除以给药剂量(kg/L);Tmax：观察到Cmax的时间点(h)。由i.v.和i.g.浓度‑时间曲线计算得到的参数：AUCnorm：t=0h至无穷(外推)的浓度‑时间曲线 下面积除以给药剂量(kg*h/L)；AUC(0‑tlast)norm：t=0h至可以测定血浆浓度的最后时间点的浓度‑时间曲线下面积除以给药剂量(kg*h/L)；t1/2：终末半衰期(h);F：口服生物利用度：灌胃给药后的AUCnorm除以静脉给药后的AUCnorm(%)。
测定16
测定热力学(平衡)溶解度‑摇瓶法
1.引言
在许多研发试验中，新化学实体(NCE)的溶解度是影响化合物性能的重要理化特征。
热力学（或平衡）溶解度研究作为平衡的饱和溶液的化合物的溶解度。
2.方法原理
通过烧瓶法测定化合物的热力学溶解度。通过HPLC和UV检测进行定量。
起始物质为固体化合物。测定需要约2‑3mg干燥化合物用于样品制备和校正。
取决于问题，可以使用任何pH的含水缓冲液作为溶剂。
制备药物的饱和溶液，并将该溶液混合24h以保证达到平衡。然后离心或过滤溶液，以除去不溶部分，并使用标准校正曲线测定溶液中的化合物浓度。
测定的溶解度的测定范围为约0.1至约2000mg/l。
3.材料和仪器
样品建立（work up）
4ml螺旋帽玻璃小瓶
螺旋帽
1.1ml HPLC玻璃小瓶
Eppendorf管
注射器式滤器
1ml注射器
称量舟
化学品和溶剂
水(Millipore)
乙腈
NH4OH
三氟乙酸
Na2HPO4x2H2O
KH2PO4
磷酸盐缓冲液pH6.5
Riedel缓冲液，各种pH
仪器
搅拌器
离心机
HPLC
UV检测器
色谱条件：
HPLC柱： Xterra MS C182.5μm4.6x30mm
进样体积：样品：3x5μl和3x50μl
标准样:5μl,10μl,20μl
流速： 1.5ml/min
流动相： 两种梯度，取决于试验化合物的性质
梯度1（酸性的）：
A：水/0.01%TFA
B:乙腈/0.01%TFA
0min→95%A5%B
0‑3min→35%A65%B,线性梯度
3‑5min→35%A65%B,等度的
5‑6min→95%A5%B,等度的
梯度2(碱性的):
A:水/0.025%NH4OH
B:乙腈/0.025%NH4OH
0min→95%A5%B
0‑3min→35%A65%B,线性梯度
3‑5min→35%A65%B,等度的
5‑6min→95%A5%B,等度的
UV检测器:邻近吸收最大值的波长(200‑400nm)
4.方法
样品和标准样的制备
样品的制备
·在4ml玻璃小瓶内称量化合物(约1‑2mg,精确重量)
·加入1.0ml缓冲液
·将悬浮液置于搅拌器上并在室温下搅拌24h(±2h)
·使样品溶液过滤通过注射器式滤器进入HPLC小瓶或离心样品
标准样的制备：
·在称量舟内称量化合物(约1‑2mg,精确重量)
·将化合物溶于乙腈/水60:40并稀释至50ml
5.分析
通过HPLC和UV检测分析样品和标准样。
对于各样品，平行三份进行两个进样体积(5和50μl)。对于标准样，进行三个进样体积。
6.解释和文档编制
通过适合的HPLC软件测定样品进样和标准样进样的面积。使用Excel自动评价理论溶解度值(单位mg/l)并通过LIM系统处理。结果以Pix报道
测定17
CYP抑制测定
已表明，作为策略的一部分，使用用来评价新候选药物对CYP介导的代谢的抑制效力的体外测定可有效将药物与联合给药的药物发生相互作用的可能性最小化。
测定了试验化合物对5种人细胞色素P450亚型(CYP1A2、2C8、2C9、2D6和3A4)的抑制效力。在CYP3A4的情况下，还通过在代谢活性 温育系统中对试验化合物施加30min预温育时间，测试了时间依赖性抑制效力。
在存在和不存在浓度增加的试验化合物的情况下，将人肝微粒体(收集自>30个男性和女性供体)与单一CYP亚型选择性标准探针(非那西丁、阿莫地喹(amodiquine)、双氯芬酸、右美沙芬和咪达唑仑)温育，以比较形成相应代谢物的程度。此外，将在不存在试验化合物的情况下进行的一系列温育作为阴性对照。此外，将标准抑制剂的抑制效力包括在内作为阳性对照(对于CYP1A2进行氟伏沙明预温育，对于CYP2C8进行孟鲁司特预温育，对于CYP2C9进行磺胺苯吡唑预温育，对于CYP2D6进行氟西汀预温育，对于CYP3A4进行酮康唑预温育，以及对于CYP3A4进行米贝拉地尔预温育)。针对线性和代谢物转化，优化温育条件（蛋白质和底物浓度、温育时间）。温育介质由50mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)组成，所述缓冲液包含1mM EDTA、NADPH生成系统(1mM NADP,5mM葡萄糖‑6‑磷酸,葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶(1.5U/mL))。在37°C，在Genesis Workstation(Tecan,Crailsheim,FRG)上，于96孔板上进行连续稀释和温育。使用200μL的最终温育体积。通过加入100μL包含相应内标的乙腈终止反应。通过将96孔板离心除去沉淀的蛋白，合并上清液并通过LC‑MS/MS进行分析。用PE SCIEX API3000LC/MS/MS系统(Applied Biosystems,MDS Sciex,Concord,Ontario,Canada)进行代谢物对乙酰氨基酚(CYP1A2)、去乙基阿莫地喹(desethylamodiaquine)(CYP2C8)、4‑羟基双氯芬酸(CYP2C9)、右啡烷(CYP2D6)和1‑羟基咪达唑仑(CYP3A4)的LC‑MS/MS定量。
数据分析：将存在抑制剂情况下的CYP介导的活性表示为相应对照值的百分比。用S形曲线拟合数据，并使用对照活性百分比对试验抑制剂浓度曲线的非线性最小二乘回归分析，计算酶抑制参数IC50。
使用上述测定方法中的一种或多种，对本发明的化合物进行活性试验。结果示于下表：
表
在上表中，“NT”表示“未试验”。
相信，本领域技术人员利用以上信息和本领域可获得的信息，可以最大程度地利用本发明。本领域技术人员会认识到，在不偏离此文中提出的本发明精神或范围的情况下，对本发明中所公开的结构、材料、组合物和方法可以进行改变，并且认为这样的变化是在本发明的范围内。实施例中所述的化合物是用来作为本发明的代表，要认识到本发明的范围不局限于实施例的范围。以上所提出的标题旨在指引在本申请的什么地方可以发现某信息，但是不应视为本发明中仅有的可发现关于这样主题的信息之处。
以上引用的所有出版物和专利均通过援引加入本文。
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