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1、(10)申请公布号 CN 103145813 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103145813 A *CN103145813A* (21)申请号 201310061920.X (22)申请日 2013.02.27 C07K 14/31(2006.01) C07K 1/14(2006.01) C07K 1/20(2006.01) (71)申请人 广州康盛生物科技有限公司 地址 510660 广东省广州市高新技术产业开 发区科学城神舟街 8 号 (72)发明人 陈校园 余波光 张海珍 周彤 (74)专利代理机构 珠海智专专利商标代理有限 公司 44262 代理人 许淑文 (5。
2、4) 发明名称 一种分离纯化重组蛋白 A 的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种分离纯化重组蛋白 A 的方 法， 属于生物工程技术领域的蛋白质分离纯化技 术。本发明提供一种利用加热处理和活性炭吸附 相结合分离纯化重组蛋白 A 的方法。应用该方法 分离纯化得到的重组蛋白 A， 其纯度可达 95% 以 上， 最终蛋白 A 的回收率可达 60% 以上， 回收的蛋 白质溶液中的内毒素含量 10EU/mg， 如果纯化方 法中还包含疏水层析， 则内毒素含量可降至 1EU/ mg 以下。该方法具有成本低， 回收率高， 便于工业 化生产的优点， 为重组蛋白 A 的规模化生产提供 了一条切实可行的途径。 (51。
3、)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书6页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103145813 A CN 103145813 A *CN103145813A* 1/2 页 2 1. 一种分离纯化蛋白 A 的方法， 其步骤如下 ： （1） 菌体悬浮液加热处理 ； （2） 对步骤 （1） 所得破碎上清第一次活性炭吸附 ； （3） 对步骤 （2） 所得上清溶液第二次活性炭吸附。 2. 根据权利要求 1 所述的一种分离纯化蛋白 A 的方法， 其特征在于还包括步骤 （4） ： 将 步骤 （。
4、3） 中获得的蛋白 A 溶液上样至已用缓冲液平衡的疏水相互作用层析柱， 收集穿流峰， 得精纯蛋白 A 溶液。 3. 根据权利要求 1 所述的一种分离纯化蛋白 A 的方法， 其步骤如下 ： （1） 取含重组蛋白 A 的菌体， 用 PBS 缓冲液混匀菌体， 加入溶菌酶， 水浴搅拌后， 置于沸 水浴搅拌， 冷却后离心得破碎上清 ； （2） 破碎上清中加入无机盐 、 Triton X-100， 搅拌均匀后， 加入活性炭， 置水浴中搅拌 进行第一次吸附， 离心得上清溶液 ； （3） 上步所得的上清溶液中， 再加入无机盐、 Triton X-100， 搅拌均匀后， 加入活性炭， 置水浴中搅拌进行第二次吸附。
5、， 离心后得蛋白 A 溶液。 4. 根据权利要求 3 所述的一种分离纯化蛋白 A 的方法， 其特征在于还包括步骤 （4） ： 将 步骤 （3） 中所得的蛋白 A 溶液上样至已用 PBS 缓冲液平衡的疏水相互作用层析柱， 收集穿 流峰， 即得精纯蛋白 A 溶液。 5. 根据权利要求 3 所述的一种分离纯化蛋白 A 的方法， 其步骤如下 ： （1） 取含重组蛋白 A 的菌体， 用 4 倍体积重量比的 PBS 缓冲液混匀菌体， 加入溶菌酶至 浓度为 1mg/ml， 于 60水浴搅拌 1h， 置于沸水浴搅拌 30min， 冷却后离心得破碎上清， 所述 PBS 缓冲液为含浓度为 8.0mmol/L 的磷。
6、酸氢二钠、 2.0mmol/L 的磷酸二氢钾和 131mmol/L 的 NaCl 的混合溶液 ； （2） 破碎上清中加入无机盐至浓度增加了 0.3mol/L ， 加入 Triton X-100 至体积百分 浓度为 0.5-4%（v/v） ， 搅拌均匀后按重量体积比加入 4% 的活性炭， 置 60水浴中搅拌 4h 进行第一次吸附， 离心得上清溶液 ； （3） 再加入无机盐至浓度增加了 0.3mol/L ， 加入 Triton X-100 至体积百分比浓度增 加了 0.5-4%（v/v） ， 搅拌均匀后按重量体积比加入 4% 活性炭， 置 60水浴中搅拌 4h 进行 第二次吸附， 离心后得蛋白 A。
7、 溶液。 6. 根据权利要求 5 所述的一种分离纯化蛋白 A 的方法， 其特征在于还包括步骤 （4） ： 将 步骤 （3） 中所得的蛋白A溶液上样至已用PBS缓冲液平衡的疏水相互作用层析柱， 收集穿流 峰， 即得精纯蛋白 A 溶液， 所述 PBS 缓冲液为含浓度为 8.0mmol/L 的磷酸氢二钠、 2.0mmol/L 的磷酸二氢钾、 1.5mol/L 的 NaCl、 体积百分比浓度为 0.5% 的 Triton X-100 的混合溶液。 7. 根据权利要求 5 所述的一种分离纯化蛋白 A 的方法， 其特征在于 ： 步骤 （2） 所述的 加入 Triton X-100 至体积百分比浓度为 2%。
8、（v/v） ； 步骤 （3） 所述的加入 Triton X-100 至 体积百分比浓度增加为 2%（v/v） 。 8. 根据权利要求 3 或 5 所述的一种分离纯化蛋白 A 的方法， 其特征在于 ： 所述无机盐 选自含有钠、 钾或铵离子的无机盐。 9. 根据权利要求 3 或 5 所述的一种分离纯化蛋白 A 的方法， 其特征在于 ： 所述无机盐 选自 NaCl、 KCl 或硫酸铵。 权 利 要 求 书 CN 103145813 A 2 2/2 页 3 10. 根据权利要求 2、 4 或 6 所述的一种分离纯化蛋白 A 的方法， 其特征在于 ： 所述的疏 水相互作用层析柱所用介质为苯基琼脂糖凝胶 。
9、6 FF。 权 利 要 求 书 CN 103145813 A 3 1/6 页 4 一种分离纯化重组蛋白 A 的方法 技术领域 0001 本发明属于生物工程技术领域， 尤其涉及重组蛋白 A 的纯化及内毒素的去除方 法。 背景技术 0002 金黄色葡萄球菌蛋白 A（Staphylococcus aureus Protein A， SPA） 是金黄色葡萄 球菌细胞壁的组成成分。 SPA能与人及多种哺乳动物的血清IgG分子中的Fc片段特异性结 合， 因此已经被广泛用于抗体的分离纯化， 以及在临床上用于治疗抗体相关性疾病。 0003 由于蛋白 A 的用途广泛， 市场需求量日益增加。仅从金黄色葡萄球菌中直。
10、接提取 天然蛋白， 不仅无法满足市场需求而且这种获取蛋白 A 的方法复杂性高 ； 金黄色葡萄球菌 是致病菌， 大规模生产危险性大， 容易发生治病物质残留等一系列问题。 因此近年来人们开 始转向基因工程的方法来生产重组蛋白 A。由于使用的基因工程菌 - 大肠杆菌含大量的内 毒素， 因此生产的重组蛋白A极易受到内毒素污染 ； 而对于蛋白A用于抗体药物的纯化生产 或临床治疗而言， 内毒素的危害都是显而易见的。因此， 对于蛋白 A 的分离纯化而言， 不仅 要求达到较高的纯度， 还要严格控制内毒素的含量。 0004 目前， 重组蛋白 A 的分离纯化主要有如下几种 ： a) 一步法， 即通过一步凝胶筛分 。
11、（CN 1432578A,CN 1524957A 等） 、 一步镍离子螯合层析 （CN 101050464A） 或一步亲和层析 （CN 101921818A） 获得目的产物 ； b) 多步法， 包括采用亲和层析阴离子交换层析两步法 （US 5075423A） 、 疏水层析阳离子交换层析两步法 （US6555661B1） 和热处理离子交换层 析乙醇沉淀三步法 （US 5314993 A） 。 0005 国内专利申请所公开的重组蛋白 A 的纯化方法均未涉及到内毒素去除的效果。对 凝胶筛分法而言， 由于处理量小、 速度慢， 而且无法去除内毒素， 因而根本无法用于蛋白 A 的工业化生产。 而对于亲和层。
12、析、 离子交换层析和金属离子螯合层析等的纯化方法， 为去除 内毒素， 必须使用大量的含表面活性剂的缓冲液 （体积为层析介质体积的十几倍至几十倍） 冲洗层析介质， 这不仅很不环保， 而且在冲洗过程中由于蛋白 A 的脱吸附而极大的影响回 收率， 特别是在介质经多次使用而性能下降时， 蛋白 A 的损失尤为明显。另外， 层析介质一 般价格昂贵、 稳定性不高 （如镍离子螯合层析介质、 亲和层析介质等） ； 并且在实际生产蛋白 A 的两个批次之间， 必须使用 NaOH 或盐酸胍等对介质进行在位清洗和消毒， 这也会加速层 析介质的性能下降、 使用寿命缩短。这些因素都使得采用层析的纯化方法成本较高。综上 所述。
13、， 目前在工业上使用的蛋白 A 纯化方法主要存在回收率较低或成本高的缺点。 0006 另一方面， 众所周知的是， 活性炭可以吸附内毒素， 却很难用于去除蛋白溶液中的 内毒素， 原因是在去除内毒素的同时， 活性炭也能吸附蛋白质， 导致回收率很低。因此若要 使用活性炭去除蛋白溶液中的内毒素， 必须解决蛋白回收率的问题。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种成本低、 回收率高、 适于工业化生产的蛋白 A 分离纯 说 明 书 CN 103145813 A 4 2/6 页 5 化方法， 以解决目前的蛋白 A 纯化方法存在的回收率较低或成本高的问题， 同时解决活性 炭吸附过程中蛋白回收率低的问题。。
14、 0008 本发明所述的蛋白A或重组蛋白A是指全长或仅含其中某个或某些结构域的蛋白 A 基因经克隆、 转化、 并在大肠杆菌细胞内表达得到的重组蛋白质。 0009 本发明所采用的技术方案是 ： 一种重组蛋白 A 分离纯化的方法， 它包括如下步骤 ： （1） 菌体悬浮液加热处理 ； （2） 对步骤 （1） 所得破碎上清第一次活性炭吸附 ； （3） 对步骤 （2） 所得上清溶液第二次活性炭吸附 ； 特别地， 还包括 ： （4） 将步骤 （3） 获得的蛋白 A 溶液上样至已用缓冲液平衡的疏水相互作用层析柱， 收集 穿流峰， 得精纯蛋白 A 溶液。 0010 具体地， 其步骤如下 ： （1） 取含重组蛋。
15、白 A 的菌体， 用 PBS 缓冲液混匀菌体， 加入溶菌酶， 水浴搅拌后， 置于沸 水浴搅拌， 冷却后离心得破碎上清 ； （2） 破碎上清中加入无机盐 、 Triton X-100， 搅拌均匀后， 加入活性炭， 置水浴中搅拌 进行第一次吸附， 离心得上清溶液 ； （3） 上步所得的上清溶液中， 再加入无机盐、 Triton X-100， 搅拌均匀后， 加入活性炭， 置水浴中搅拌进行第二次吸附， 离心后得蛋白 A 溶液。 0011 另外， 上述步骤之后还附加包括下述步骤 ： （4） 将步骤 （3） 中所得的蛋白 A 溶液上样至已用 PBS 缓冲液平衡的疏水相互作用层析 柱， 收集穿流峰， 即得精。
16、纯蛋白 A 溶液。 0012 更为具体地， 包括如下步骤 ： （1） 取含重组蛋白 A 的菌体， 用 4 倍体积重量比的 PBS 缓冲液混匀菌体， 加入溶菌酶至 浓度为 1mg/ml， 于 60水浴搅拌 1h， 置于沸水浴搅拌 30min， 冷却后离心得破碎上清， 所述 PBS 缓冲液为含浓度为 8.0mmol/L 的磷酸氢二钠、 2.0mmol/L 的磷酸二氢钾和 131mmol/L 的 NaCl 的混合溶液 ； （2） 破碎上清中加入无机盐至浓度增加了 0.3mol/L ， 加入 Triton X-100 至体积百分 比浓度为 0.5-4% （v/v） ， 搅拌均匀后按重量体积比加入 4%。
17、 的活性炭， 置 60水浴中搅拌 4h 进行第一次吸附， 离心得上清溶液 ； （3） 再加入无机盐至浓度增加了 0.3mol/L ， 加入 Triton X-100 至体积百分比浓度增 加了 0.5-4%（v/v） ， 搅拌均匀后按重量体积比加入 4% 活性炭， 置 60水浴中搅拌 4h 进行 第二次吸附， 离心后得蛋白 A 溶液。 0013 特别地， 还包括 ： （4） 将步骤 （3） 中所得的蛋白 A 溶液上样至已用 PBS 缓冲液平衡的疏水相互作用层析 柱， 收集穿流峰， 即得精纯蛋白 A 溶液， 所述 PBS 缓冲液为含浓度为 8.0mmol/L 的磷酸氢二 钠、 2.0mmol/L的。
18、磷酸二氢钾、 1.5mol/L的NaCl和体积百分比浓度为0.5%的Triton X-100 的混合溶液。 0014 本发明中用 1mg/ml 的溶菌酶对菌悬液在 60下处理 1h 后， 继续加热煮沸 30min 说 明 书 CN 103145813 A 5 3/6 页 6 处理， 与溶菌酶 - 超声破碎相比， 操作更为简单， 且破碎效率也更高。溶菌酶 - 超声破 碎中， 破碎后释放出的蛋白含量约占总细胞蛋白含量的 70%， 而加热煮沸处理后， 可达到 80%-90%。 0015 本发明步骤 （2） 中， Triton X-100 的体积百分比浓度为 0.5-4%， 优选 2% ； 步骤 （3。
19、） 中， 加入 Triton X-100 至体积百分比浓度增加 0.5-4%， 优选 2%。 0016 本发明步骤 （2） 中所用活性炭为粉末状， 优选为药用活性炭， 具有纯度高， 过滤速 度快， 孔隙结构较大 （200-325 目） ， 性质稳定等特点。本发明加入了无机盐可以提高离子强 度， 可选用的含有钠、 钾、 铵离子的无机盐， 如 ： NaCl、 KCl、 硫酸铵 ； 优选 NaCl。 0017 经过两次活性炭吸附后， 蛋白 A 纯度可达 95% 以上， 回收率可达 60% 以上， 蛋白 A 的内毒素含量 10EU /mg。 0018 为进一步去除内毒素， 本发明还可以包括步骤 （4）。
20、 ， 经疏水相互作用后， 蛋白 A 的 内毒素含量可降至 1EU /mg 以下， 同时蛋白 A 纯度进一步提高。层析介质可采用市场上流 通的任一种疏水层析介质， 优选是苯基琼脂糖凝胶 （Phenyl Sepharose ） 6FF。 0019 活性炭吸附在去除内毒素的同时， 也会吸附蛋白质。本发明在进行活性炭吸附时 加入Triton X-100， 可有效抑制活性炭对蛋白的吸附， 从而提高蛋白回收率。 未使用Triton X-100 时， 蛋白 A 回收率为 20-40%， 加入 Triton X-100 后升高至 60% 以上。 0020 离子螯合层析或离子交换层析也可以用于纯化蛋白 A， 但。
21、需要采用大量的冲洗液 才能去除内毒素。在冲洗过程中， 由于蛋白 A 脱吸附， 回收率往往只有 50-60%， 特别是在层 析介质经多次使用性能下降后， 冲洗过程中脱吸附的蛋白A更多， 回收率可低至15-25%。 另 外， 层析介质往往价格昂贵， 大量冲洗液的使用也大大增加了成本。总的来看， 离子螯合层 析方法每生产 1g 蛋白 A 需要成本 3500 元人民币， 离子交换层析每生产 1g 蛋白 A 需要成本 500 元人民币， 而采用本发明方法每生产 1g 蛋白 A 只需 280 元。本发明的成本最低， 且材料 易于获得。 0021 根据杂蛋白与内毒素的疏水性都很强， 容易与疏水填料结合， 而。
22、重组蛋白 A 的疏 水性较弱的特点， 在本发明的步骤 （4） 中， 目的蛋白流经疏水层析柱经穿流峰收集， 而杂蛋 白及内毒素与层析填料结合， 进一步去除内毒素并提高蛋白 A 纯度。 0022 综上所述， 与现有技术相比， 本发明的有益效果是 ： 提供了一种新的重组蛋白 A 的 纯化方法， 可有效纯化蛋白 A 和去除内毒素， 并且蛋白回收率较高、 成本低， 适合于工业化 生产重组蛋白 A。 附图说明 0023 图 1 为本发明实施例 3 纯化过程的 SDS-PAGE 凝胶电泳图。 具体实施方式 0024 以下通过实施例结合附图对本发明作进一步的详细说明， 这并不限制本发明的保 护范围。 0025。
23、 实施例 1 ： 活性炭吸附除内毒素 1） 取含重组蛋白 A 的菌体 700g， 按质量 ： 体积比为 1 ： 4 加入 2800 mL 的 PBS 缓冲液 （含 8.0mM磷酸氢二钠、 2.0mM磷酸二氢钾、 131mM NaCl） ， 充分搅拌使菌体溶解， 然后加入溶菌酶 说 明 书 CN 103145813 A 6 4/6 页 7 至浓度为 1mg/ml， 于 60水浴搅拌 1h， 再置于沸水浴搅拌 30min， 冷却后离心得破碎上清 ； 2） 将破碎上清分成 7 等份， 每份加入 NaCl 至浓度增加 0.3mol/L， 加入 Triton X-100 至浓度分别为 0、 0.25%、。
24、 0.5%、 1%、 2%、 4%、 6%（v/v） ， 搅拌均匀后按质量 ： 体积比加入 4% 活性 炭， 置 60水浴中搅拌 4h 进行第一次吸附， 离心得上清溶液 ； 3） 再加入 NaCl 至浓度增加 0.3mol/L， 加入 Triton X-100 至浓度分别增加 0、 0.25%、 0.5%、 1%、 2%、 4%、 6%（v/v） ， Triton X-100 的增加量与步骤 2） 中添加量一一对应。搅拌均 匀后按质量 ： 体积比加入 4% 活性炭， 置 60水浴中搅拌 4h 进行第二次吸附， 离心除去活性 炭得蛋白 A 溶液。经凝胶法检测得到的重组蛋白 A 溶液中内毒素含量，。
25、 经 BCA 法检测吸附 前后蛋白质回收率。检测结果如表一所示 ： 表一 ： Triton X-100 添加量对内毒素和蛋白质回收率的影响。 0026 实施例 2 ： 疏水层析去除内毒素 1） 取含重组蛋白 A 的菌体 100g， 按质量 ： 体积比为 1 ： 4 加入 400mL 的 PBS 缓冲液 （含 8.0mM磷酸氢二钠、 2.0mM磷酸二氢钾、 131mM NaCl） ， 充分搅拌使菌体溶解， 然后加入溶 菌酶至浓度为1mg/ml， 于60水浴搅拌1h， 再置于沸水浴搅拌30min， 冷却后离心得破碎上 清 ； 2） 破碎上清中加入 NaCl 至浓度增加 0.3mol/L， 加入 T。
26、riton X-100 至浓度为 0.5% （v/ v） ， 搅拌均匀后按质量 ： 体积比加入 4% 活性炭， 置 60水浴中搅拌 4h 进行第一次吸附， 离 心得上清溶液 ； 3） 再加入 NaCl 至浓度增加 0.3mol/L， 加入 Triton X-100 至浓度浓度增加 0.5%（v/ v） ， 搅拌均匀后按质量 ： 体积比加入 4% 活性炭， 置 60水浴中搅拌 4h 进行第二次吸附， 离 心除去活性炭得蛋白 A 溶液 ； 4) 用 pH=7.0 的 PBS 缓冲液 （含 8.0mM 磷酸氢二钠、 2.0mM 磷酸二氢钾、 1.5MNaCl、 0.5%Triton X-100） 平。
27、衡 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow 疏水相互作用层析柱， 至基线 ； 5) 取步骤 3） 得到的重组蛋白 A 溶液 （内毒素小于 10EU/mg） ， 调节离子强度和 pH 值与 步骤 4） 中 PBS 缓冲液一致然后上样， 收集穿流峰， 得到精纯重组蛋白 A 溶液 ； 6） 经凝胶法检测得到回收的重组蛋白 A 溶液中内毒素含量小于 1EU/mg， 经 BCA 法测得 过柱前后蛋白质回收率为 95%。 0027 实施例 3 ： 疏水层析去除内毒素 说 明 书 CN 103145813 A 7 5/6 页 8 1） 取含重组蛋白 A 的菌体 100g， 按质量 ： 体积。
28、比为 1 ： 4 加入 400mL 的 PBS 缓冲液 （含 8.0mM磷酸氢二钠、 2.0mM磷酸二氢钾、 131mM NaCl） ， 充分搅拌使菌体溶解， 然后加入溶 菌酶至浓度为1mg/ml， 于60水浴搅拌1h， 再置于沸水浴搅拌30min， 冷却后离心得破碎上 清 ； 2） 破碎上清中加入 NaCl 至浓度增加 0.3mol/L， 加入 Triton X-100 至浓度为 2%（v/ v） ， 搅拌均匀后按质量 ： 体积比加入 4% 活性炭， 置 60水浴中搅拌 4h 进行第一次吸附， 离 心得上清溶液 ； 3） 再加入 NaCl 至浓度增加 0.3mol/L， 加入 Triton 。
29、X-100 至浓度增加 2%（v/v） ， 搅拌 均匀后按质量 ： 体积比加入 4% 活性炭， 置 60水浴中搅拌 4h 进行第二次吸附， 离心除去活 性炭得蛋白 A 溶液 ； 4) 用 pH=7.0 的 PBS 缓冲液 （含 8.0mM 磷酸氢二钠、 2.0mM 磷酸二氢钾、 1.5MNaCl、 0.5%Triton X-100） 平衡 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow 疏水相互作用层析柱， 至基线 ； 5) 取步骤 3） 得到的重组蛋白 A 溶液 （内毒素小于 10EU/mg） ， 调节离子强度和 pH 值与 步骤 4） 中 PBS 缓冲液一致然后上样， 收集穿流峰。
30、， 得到精纯重组蛋白 A 溶液 ； 6） 经凝胶法检测得到回收的重组蛋白 A 溶液中内毒素含量小于 1EU/mg， 经 BCA 法测得 过柱前后蛋白质回收率为 96%。 0028 本发明实施例 3 纯化过程的 SDS-PAGE 凝胶电泳结果如图 1 所示， 其中泳道 1 为菌 体破碎后的上清， 泳道2为活性炭第一次吸附后的上清溶液， 泳道3活性炭第二次吸附后的 蛋白 A 溶液， 泳道 4 为精纯重组蛋白 A， 重组蛋白 A 的分子量大小约为 21 kDa。泳道 5 为低 分子量蛋白 marker， 由上往下分子量大小分别为 97.2kDa、 66.4 kDa、 44.3 kDa、 29.0 k。
31、Da、 20.1 kDa、 14.3 kDa。 0029 实施例 4 ： 疏水层析去除内毒素。 0030 1） 取含重组蛋白 A 的菌体 100g， 按质量 ： 体积比为 1 ： 4 加入 400mL 的 PBS 缓冲液 （含 8.0mM 磷酸氢二钠、 2.0mM 磷酸二氢钾、 131mM NaCl） ， 充分搅拌使菌体溶解， 然后加入溶 菌酶至浓度为1mg/ml， 于60水浴搅拌1h， 再置于沸水浴搅拌30min， 冷却后离心得破碎上 清 ； 2） 破碎上清中加入 NaCl 至浓度增加 0.3mol/L， 加入 Triton X-100 至浓度为 4%（v/ v） ， 搅拌均匀后按质量 ： 。
32、体积比加入 4% 活性炭， 置 60水浴中搅拌 4h 进行第一次吸附， 离 心得上清溶液 ； 3） 再加入 NaCl 至浓度增加 0.3mol/L， 加入 Triton X-100 至浓度增加 4%（v/v） ， 搅拌 均匀后按质量 ： 体积比加入 4% 活性炭， 置 60水浴中搅拌 4h 进行第二次吸附， 离心除去活 性炭得蛋白 A 溶液 ； 4) 用 pH=7.0 的 PBS 缓冲液 （含 8.0mM 磷酸氢二钠、 2.0mM 磷酸二氢钾、 1.5MNaCl、 0.5%Triton X-100） 平衡 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow 疏水相互作用层析柱， 至基线 。
33、； 5) 取步骤 3） 得到的重组蛋白 A 溶液 （内毒素小于 10EU/mg） ， 调节离子强度和 pH 值与 步骤 4） 中 PBS 缓冲液一致然后上样， 收集穿流峰， 得到精纯重组蛋白 A 溶液 ； 6） 经凝胶法检测得到回收的重组蛋白 A 溶液中内毒素含量小于 1EU/mg， 经 BCA 法测得 过柱前后蛋白质回收率为 96%。 0031 实施例 5 ： 效果评价 说 明 书 CN 103145813 A 8 6/6 页 9 以重组蛋白 A 为配基的吸附剂， 对人血清中抗体的吸附效果评价。 0032 利用高碘酸钠氧化法， 将实施例 1 步骤 2）中 Triton X-100 加入量或步。
34、骤 3 中 Triton X-100 增加量为 0.5%、 2%、 4% 时得到的蛋白 A 溶液及实施例 2、 3、 4 得到的精纯蛋白 A溶液分别偶联到Sepharose 6 F.F上。 具体方法如中国专利20100512304.8所述。 通过模 拟临床上免疫吸附的步骤， 采用体外对血浆内免疫球蛋白吸附性能测试， 以此来评价免疫 吸附材料的吸附性能， 进而可以了解其临床使用价值， 具体步骤如中国专利 20100512304.8 所示， 以差值法计算以重组蛋白 A 为配基的免疫吸附剂对人血浆中 IgG 的吸附量。结果如 表二所示 ： 表二 蛋白 A 吸附性能测定 实施例编号TritonX-100 加入量 （%）吸附量 （mg/mL 胶） 10.526 1227 1426 20.529 3230 4429 说 明 书 CN 103145813 A 9 1/1 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 103145813 A 10 。