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1、(10)申请公布号 CN 103146847 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146847 A *CN103146847A* (21)申请号 201310093869.0 (22)申请日 2013.03.22 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/94(2006.01) (71)申请人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗 1 号 (72)发明人 陶小荣 李靖玉 卫其巍 张雯娜 吴鉴艳 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人。
2、 徐冬涛 李晓峰 (54) 发明名称 一种黄瓜绿斑驳花叶病毒的 RT-LAMP 快速检 测试剂盒及检测方法 (57) 摘要 本发明一种黄瓜绿斑驳花叶病毒的 RT-LAMP 快速检测试剂盒及检测方法， 其中该方法包括 ： 植物病毒总RNA的提取， RT-LAMP反应和电泳检测 或荧光染料检测， 确定植物是否带病。 本发明根据 CGMMV 的外壳蛋白基因保守区域设计了 RT-LAMP 引物， 采用 RT-LAMP 技术建立了一种快速、 灵敏、 高度特异性的检测黄瓜、 西瓜和葫芦等葫芦科植 物植株上 CGMMV 的检测技术及其在病害诊断上的 应用方法。本发明可以利用快速抽提 RNA 和常规 RNA 。
3、抽提作为 RNA 模板用于 RT-LAMP 实验。利用 这一方法可以快速鉴定出黄瓜绿斑驳花叶病毒植 株样本， 进而采取针对性的检疫性保护措施， 减少 病害带来的损失。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图6页 (10)申请公布号 CN 103146847 A CN 103146847 A *CN103146847A* 1/1 页 2 1. 一种用于黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测的 RT-LAMP 引物组， 其特征在于所述的 RT-LAMP 引。
4、物组包含一对外引物和一对内引物， 所述外引物对 F3、 B3 的序列分别为 SEQ ID No.1 和 SEQ ID No.2 所示， 所述内引物对 FIP、 BIP 的序列分别为 SEQ ID No.3 和 SEQ ID No.4 所示。 2. 权利要求 1 所述的引物组在制备黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测试剂盒或检测试 剂中的应用。 3.一种含有权利要求1所述的引物组的黄瓜绿斑驳花叶病毒RT-LAMP快速检测试剂盒。 4. 根据权利要求 3 所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒 RT-LAMP 快速检测试剂盒， 其特征在于 所述的试剂盒包含主要由植物病毒 RNA 快速提取液、 RT-LAMP 反应液、 。
5、DEPC 水和荧光染料 SYBR Green 检测液组成的检测体系。 5. 根据权利要求 4 所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒 RT-LAMP 快速检测试剂盒， 其特征在于 所述植物病毒 RNA 快速提取液包含 0.5M NaOH 和 Tris-HCL（pH8.0） ； 采用植物病毒 RNA 快 速提取液提取样品粗提总 RNA， 将提取的样品粗提总 RNA 加入到 RT-LAMP 反应液中混合， 建 立扩增体系 ； 以反应总体积 10L 为例， 所述扩增体系中各组分的含量为 ： 样品粗提总 RNA 0.8L， 1ThermoPol Buffer， 4mM MgCl2， 0.8mM dNTP， 0.8M。
6、 Betaine， 3.2U 的 Bst DNA Polymerase， 0.5U 的 AMV Polymerase， 1M 的 FIP 和 1M 的 BIP， 0.2M 的 F3和 0.2M 的 B3， 补充 DEPC 水至 10L。 6. 一种黄瓜绿斑驳花叶病毒的 RT-LAMP 快速检测方法， 其特征在于使用权利要求 1 所 述的引物组对待测样品进行 RT-LAMP 扩增， 利用电泳检测或荧光染料技术鉴定出待检测样 本中是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。 7. 根据权利要求 6 所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的 RT-LAMP 快速检测方法， 其特征在于 具体包括以下步骤 ： （1） 提取样品粗提总。
7、 RNA ； （2） 取步骤 （1） 提取的样品粗提总 RNA 加入到 RT-LAMP 反应液中混合， 建立扩增体系 ； （3） 在 6364恒温水浴中反应 6075min ； （4） 结果诊断 ： 取荧光染料检测液 SYBR Green 加入到步骤 （3） 扩增反应产物中进行 诊断， 在紫外光下观察， 呈阳性即显绿色的表示样本中含有黄瓜绿斑驳花叶病毒， 呈阴性即 保持染料橙色的表示样本不含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。 8. 根据权利要求 7 所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的 RT-LAMP 快速检测方法， 其特征在于 步骤 （1） 所述样本粗提总 RNA 的提取方法为 ： 用刚采集的病叶在 0.5M N。
8、aOH 溶液中快速研 磨制成研磨液， 将研磨液加入到 Tris-HCL（pH8.0） 中制成样品粗提总 RNA 提取液。 9. 根据权利要求 8 所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的 RT-LAMP 快速检测方法， 其特征在于 所述的病叶和 0.5M NaOH 溶液的质量体积比 g ： mL 为 1 ： 4 ； 所述混合液和 Tris-HCL （pH8.0） 的体积比为 1 ： 49。 10. 根据权利要求 7 所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的 RT-LAMP 快速检测方法， 其特征在 于步骤 （2） 中所述反应总体积 10L 为例， 扩增体系中各组分的含量为 ： 样品粗提总 RNA 0.8L， 1Therm。
9、oPol Buffer， 4mM MgCl2， 0.8mM dNTP， 0.8M Betaine， 3.2U 的 Bst DNA Polymerase， 0.5U 的 AMV Polymerase， 1M 的 FIP 和 1M 的 BIP， 0.2M 的 F3和 0.2M 的 B3， 补充 DEPC 水至 10L。 权 利 要 求 书 CN 103146847 A 2 1/7 页 3 一种黄瓜绿斑驳花叶病毒的 RT-LAMP 快速检测试剂盒及检 测方法 技术领域 0001 本发明属于农业科学技术领域， 涉及西瓜、 黄瓜和葫芦等葫芦科植物上黄瓜绿斑 驳花叶病毒的快速检测技术及其在病害诊断上的应用。
10、， 具体涉及一种黄瓜绿斑驳花叶病毒 的 RT-LAMP 快速检测试剂盒及检测方法。 背景技术 0002 黄瓜绿斑驳花叶病毒 （Cucumber green mottle mosaic virus， CGMMV） 属番茄丛 矮病毒科 （Tombusviridae） 、 烟草花叶病毒属 （Tobamovirus） 成员。该病严重为害葫芦科作 物， 为我国的检疫性有害生物。黄瓜绿斑驳花叶病毒苗期染病幼苗顶尖部的 2 3 片叶子 现亮绿或暗绿色斑驳， 叶片较平， 产生暗绿色斑驳的病部隆起， 新叶浓绿， 后期叶脉透化， 叶 片变小， 引起植株矮化， 叶片斑驳扭曲， 呈系统性传染。 瓜条染病现浓绿色花斑，。
11、 有的也产生 瘤状物， 致果实成为畸形瓜， 影响商品价值， 严重的减产 25% 左右。自然界主要侵染甜瓜、 西 瓜、 黄瓜、 南瓜及瓠瓜等多种葫芦科作物， 通过种子和土壤传播， 此外也可通过汁液， 农事操 作及叶片接触等方式进行传播。带毒种子传播是该病毒远距离传播的主要途径。 0003 该病自 1935 年被发现以来， 曾先后在英国、 德国、 丹麦、 荷兰、 俄罗斯、 印度、 日本、 韩国以及我国台湾发生并造成严重危害。黄瓜绿斑驳病毒病以前在我国大陆没有发生记 载， 2006 年国内个别地方发现西瓜绿斑驳病毒病， 2006 年 12 月份中国农业部发布 788 号公 告， 将其列为全国植物检疫。
12、性有害生物。 0004 目前在植物病毒鉴定识别上常采用的方法有 ： 生物学实验， 血清学检测， 电镜观察 及分子生物学检测。 由于传统的植物病毒监测方法， 如电镜观察、 传统的生物学接种鉴定等 这些方法很难分别出是否是黄瓜绿斑驳花叶病毒， 因此需要一个快速准确的方法来检测该 病毒。 环介导恒温核酸扩增技术 （Loop-mediated isothermal amplification,LAMP） ， 是由 Notomi 等在 2000 年发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法， 他是一种高灵敏度的链置换技 术， 一种新型的 PCR 替代技术。LAMP 特点是针对靶基因的 6 个区域设计了 4 个特异。
13、引物， 利 用一种链置换 DNA 聚合酶Bst DNA polymerase 在恒温的条件下反应 60min 就可以完成 核酸扩增反应， 通过荧光染色后在紫外光下观察可以清晰的观察到反应结果。不需要长时 间的温度循环， 不需要昂贵的 PCR 仪， 不需要繁琐的电泳紫外观察等过程。目前已广泛应用 于人类和动植物各种病毒、 细菌、 寄生虫等引起的疾病监测和快速诊断。但是， 目前尚没有 将 RT-LAMP 技术应用在黄瓜绿斑驳花叶病毒 （CGMMV） 的检测上。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种用于黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测的 RT-LAMP 引物 组。 0006 本发明的另一目的在于提。
14、供一种黄瓜绿斑驳花叶病毒 RT-LAMP 快速检测试剂盒。 0007 本发明又一目的在于提供一种黄瓜绿斑驳花叶病毒的 RT-LAMP 快速检测方法。该 说 明 书 CN 103146847 A 3 2/7 页 4 方法用于快速检测西瓜、 黄瓜和葫芦等葫芦科上黄瓜绿斑驳花叶病毒， 通过该方法可以快 速诊断出疑似病株是否携带黄瓜绿斑驳花叶病毒。 0008 本发明的目的可以通过以下技术方案实现 ： 0009 一种用于黄瓜绿斑驳花叶病毒快速检测的 RT-LAMP 引物组， 其在于所述的 RT-LAMP 引物组包含一对外引物和一对内引物， 所述外引物对 F3、 B3 的序列分别为 SEQ ID No.1。
15、 和 SEQ ID No.2 所示， 所述内引物对 FIP、 BIP 的序列分别为 SEQ ID No.3 和 SEQ ID No.4 所示。 0010 上述的引物组在制备黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测试剂盒或检测试剂中的应 用。 0011 一种含有上述的引物组的黄瓜绿斑驳花叶病毒 RT-LAMP 快速检测试剂盒。 0012 上述的黄瓜绿斑驳花叶病毒 RT-LAMP 快速检测试剂盒， 其在于所述的试剂盒包含 主要由植物病毒 RNA 快速提取液、 RT-LAMP 反应液、 DEPC 水和荧光染料 SYBR Green 检测 液组成的检测体系。 0013 上述的黄瓜绿斑驳花叶病毒 RT-LAMP 快。
16、速检测试剂盒， 其在于所述植物病毒 RNA 快速提取液包含 0.5M NaOH 和 Tris-HCL（pH8.0） ； 采用植物病毒 RNA 快速提取液 提取样品粗提总 RNA， 将提取的样品粗提总 RNA 加入到 RT-LAMP 反应液中混合， 建立扩 增体系 ； 以反应总体积 10L 为例， 所述扩增体系中各组分的含量为 ： 样品粗提总 RNA 0.8L， 1ThermoPol Buffer， 4mM MgCl2， 0.8mM dNTP， 0.8M Betaine， 3.2U 的 Bst DNA Polymerase， 0.5U 的 AMV Polymerase， 1M 的 FIP 和 1。
17、M 的 BIP， 0.2M 的 F3和 0.2M 的 B3， 补充 DEPC 水至 10L。 0014 一种黄瓜绿斑驳花叶病毒的 RT-LAMP 快速检测方法， 其在于使用上述的引物组对 待测样品进行 RT-LAMP 扩增， 利用电泳检测或荧光染料技术鉴定出待检测样本中是否含有 黄瓜绿斑驳花叶病毒。 0015 上述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的 RT-LAMP 快速检测方法， 具体包括以下步骤 ： 0016 （1） 提取样品粗提总 RNA ； 0017 （2） 取步骤 （1） 提取的样品粗提总 RNA 加入到 RT-LAMP 反应液中混合， 建立扩增体 系 ； 0018 （3） 在 6364恒温水浴中。
18、反应 6075min ； 0019 （4） 结果诊断 ： 取荧光染料检测液 SYBR Green 加入到步骤 （3） 扩增反应产物中 进行诊断， 在紫外光下观察， 呈阳性即显绿色的表示样本中含有黄瓜绿斑驳花叶病毒， 呈阴 性即保持染料橙色的表示样本不含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。 0020 步骤 （1） 所述样本粗提总RNA的提取方法为 ： 用刚采集的病叶在0.5M NaOH溶液中 快速研磨制成研磨液， 将研磨液加入到 Tris-HCL（pH8.0） 中制成样品粗提总 RNA 提取液。 0021 所述的病叶和0.5M NaOH溶液的质量体积比g ： mL为1 ： 4 ； 所述混合液和Tris-HCL。
19、 （pH8.0） 的体积比为 1 ： 49。 0022 步骤 （2） 中所述反应总体积 10L 为例， 扩增体系中各组分的含量为 ： 样品粗提 总 RNA 0.8L， 1ThermoPol Buffer， 4mM MgCl2， 0.8mM dNTP， 0.8M Betaine， 3.2U 的 Bst DNA Polymerase， 0.5U 的 AMV Polymerase， 1M 的 FIP 和 1M 的 BIP， 0.2M 的 F3和 0.2M 的 B3， 补充 DEPC 水至 10L。 说 明 书 CN 103146847 A 4 3/7 页 5 0023 本发明所提供的快速检测病株上黄。
20、瓜绿斑驳花叶病毒的方法， 具体包括以下详细 步骤 ： 0024 1） 根据NCBI已报道的黄瓜绿斑驳花叶病毒核苷酸序列， 通过软件DNAstar分析后 找出该病核酸外壳蛋白基因保守区域序列作为模板参考序列使用在线 LAMP 引物设计软件 Primer Explorer V4 （http:/primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html） 设计引物 ； 0025 2） 快速提取法提取植株样品粗提总 RNA ； 0026 3） 设置不同 Mg2+浓度、 dNTP 浓度、 内外引物浓度比例、 Betaine 浓度、 确定最佳反 应体系 ； 分别改变反应时间和温度进行 。
21、RT-LAMP 扩增反应， 确定最佳反应条件。 0027 4） 通过紫外光或肉眼判断 SYBR Green 染色对 RT-LAMP 产物进行可视化处理。 0028 5） 在最佳反应参数条件下， 与 RT-PCR 方法进行比较， 验证 RT-LAMP 的灵敏度 ； 0029 6） 以 CMV 和 TMV 为对照验证这一反应的特异性 ； 0030 本发明提供的引物序列如下 ： 0031 0032 其中， 所述检测试剂盒包括以下溶液 ： 0033 溶液 1 ： 植物病毒 RNA 快速提取液包括 ： 0.5M NaOH 和 Tris-HCL（pH8.0） ； 0034 RT-LAMP 反应液包括溶液 。
22、2 和溶液 3 ： 0035 溶液 2 ： 10ThermoPol Buffer， MgCl2（25mM） ， dNTP（10mM each)， Betaine（5M） ， Bst DNA Polymerase（8U/L） ， AMV Polymerase（10U/L） ； 0036 溶液 3 ： RT-LAMP 引物混合液包括 ： 内引物 FIP（20M） 和 BIP（20M） ， 外引物 F3 （10M） 和 B3（10M） ； 0037 溶液 4 ： DEPC 水 ； 0038 溶液 5 ： 荧光染料检测液 SYBR Green 。 0039 进一步， 所述检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的 RT。
23、-LAMP 快速检测方法， 包括如下步骤 ： 0040 1） 用刚采集的病叶 0.1g， 在 400L 的 0.5M NaOH 溶液中研磨， 取 10L 研磨液加 入到 490L Tris-HCL（pH8.0） 中， 直接取 0.8L 的液体作为检测的粗提取总 RNA 模板 ； 0041 2）配制 RT-LAMP 反应液 ： 按总体积 10L 建立扩增体系为 ： 5.45L 溶液 2 【10ThermoPol Buffer 1L， MgCl2（25mM） 1.6L， dNTP（10mM each) 0.8L， Betaine （5M） 1.6L， Bst DNA Polymerase（8U/L。
24、） 0.4L， AMV Polymerase（10U/L） 0.05L】 ， 1.4L 溶液 3【FIP（20M） 和 BIP（20M） 各 0.5L， 外引物 F3（10M） 和 B3（10M） 各 0.2L】 ， 2.35L DEPC 水 ； 0042 3） 取步骤 1） 提取的样品粗提总 RNA 0.8L 加入到步骤 2） 配制的 RT-LAMP 反应 说 明 书 CN 103146847 A 5 4/7 页 6 液中， 混合 ； 0043 4） 在 6364恒温水浴中反应 6075min ； 0044 5） 结果诊断 ： 将 1L 溶液 5 加入到步骤 4） 扩增反应产物中进行诊断， 。
25、在紫外光 下观察， 呈阳性即绿色的表示样本中含有黄瓜绿斑驳花叶病毒， 呈阴性即保持染料橙色的 表示样本不含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。 0045 相比现有技术， 本发明具有如下优点 ： 0046 本发明根据 GenBank 发布的黄瓜绿斑驳花叶病毒 （CGMMV） 的基因序列， 针对外壳 蛋白基因保守区域设计了 CGMMV 的 RT-LAMP 检测方法的特异性引物 2 对， 一对外引物 F3、 B3 和一对内引物 FIP、 BIP， 2 对引物序列如上所示。以快速提取样本总 RNA 为模板， 建立了 快速检测 CGMMV 的 RT-LAMP 技术。 0047 本发明 RT-LAMP 检测技术利用特异。
26、性引物 (4 条 )， 以识别 CGMMV 病毒靶基因的几 个特定区域， 特异性更强。反应在等温条件 （6364） 下进行， 不需要昂贵的 PCR 仪器， 扩 增反应极快， 一般在 6075min 就能完成， 扩增产物量大， 利用电泳检测或荧光染料技术鉴 定出待测样本是否含有 CGMMV 病毒 ； 灵敏度高、 特异性强， 适合病毒的准确检测。 0048 本发明RT-LAMP技术不需要单独反转录过程和RT-PCR的两次扩增， 减少分子检测 的一些环节， 减少了检测的污染率。且实验证明检测灵敏度比 RT-PCR 高 100 倍， 使该方法 对 CGMMV 病毒的早期诊断更精确。 0049 本发明具。
27、有操作简单、 成本低、 反应快速、 特异性强、 灵敏度高的优点， 且用时短， 灵敏度比普通RT-PCR高100倍， 对病毒早期诊断准确性更高。 可广泛利用本样本快速检测、 CGMMV 流行监控、 检疫检测和病毒的鉴别。 附图说明 0050 图 1 为不同 Mg2+浓度、 dNTP 浓度、 内外引物浓度比例、 Betaine 浓度的优化电泳图 0051 A 为 Mg2+浓度优化结果图 （1 为阴性 ； 2-6 为 Mg2+浓度 ： 2、 3、 4、 5、 6mM ； M 为 Marker） ； 0052 B为dNTP浓度优化结果图 （1为阴性 ； 2-6为dNTP浓度 ： 0.2、 0.4、 0。
28、.6、 0.8、 1.0mM ； M 为 Marker） ； 0053 C为外引物F3和B3浓度优化结果图 （1为阴性 ； 2-6为F3、 B3各 ： 0.05、 0.10、 0.15、 0.20、 0.25M ； M 为 Marker） ； 0054 D 为 FIP 和 BIP 浓度优化结果图 （1 为阴性 ； 2-6 为 FIP、 BIP 各 ： 0.4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2M ； M 为 Marker） ； 0055 E 为 Betaine 浓度优化结果图 （1 为阴性 ； 2-6 为 Betaine 浓度 ： 0、 0.4、 0.8、 1.2、 1.6M） 0056 。
29、图 2 为不同反应温度条件下 RT-LAMP 结果的电泳图 0057 M为Marker ； 1为61阳性， 2为61阴性， 3为62阳性， 4为62阴性， 5为63 阳性， 6 为 63阴性， 7 为 64阳性， 8 为 64阴性， 9 为 65阳性， 10 为 65阴性。 0058 图 3 为不同反应时间条件下 RT-LAMP 结果的电泳图 0059 1为阴性 ； 2为15min ； 3为30min ； 4为45min ； 5为60min ； 6为75min ； M为Marker。 0060 图 4 为 RT-LAMP 与 RT-PCR 灵敏度比较图及荧光染料方法检测 RT-LAMP 扩增产。
30、物 图 说 明 书 CN 103146847 A 6 5/7 页 7 0061 A 为 RT-LAMP 反应结果图 ； B 为 RT-PCR 反应结果图 ； C 为 SYBR Green 荧光染料 方法检测结果图 ； M 为 Marker ； 1 为 72ng/L ； 2 为 7.2ng/L ； 3 为 7.210-1ng/L ； 4 为 7.210-2ng/L ； 5 为 7.210-3ng/L ； 6 为 7.210-4ng/L ； 7 为 7.210-5ng/L ； 8 为 7.210-6ng/L ； 9 为阴性对照。 0062 检测结果 ： 自左到右， 第 1-4 个试管为绿色， 5-。
31、9 为橙色。 0063 图 5 为利用快速提取植物 RNA 做为模板进行 RT-LAMP 反应结果图 0064 1 为阴性 ； 2 为快速提取健康植物的 RNA ； 3 为快速提取带 CGMMV 病株的 RNA ； 4 为 阳性。 0065 图 6 为利用快速提取样检测 CGMMV 的 RT-LAMP 特异性的结果图 0066 A 为 RT-LAMP 反应结果图 ； B 为 RT-PCR 反应结果图 ； M 为 Marker ； 1 为阳性 ； 2 为粗 提 CGMMV 病样 ； 3 为粗提 CMV 病样 ； 4 为粗提 TMV 病样 ； 5 为粗提健康植株 ； 6 为阴性。 0067 检测结。
32、果 ： 自左到右， 第 1-2 个试管为绿色， 3-6 为橙色。 具体实施方式 0068 实施例 1 黄瓜绿斑驳花叶病毒 RT-LAMP 反应条件的优化 0069 黄瓜绿斑驳花叶病毒 RT-LAMP 引物的设计 0070 根据 NCBI 已报道的黄瓜绿斑驳花叶病毒 0071 （http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_001 0072 801.1） 完整核苷酸基因组序列， 通过软件 DNAstar 分析后找出该病毒核苷酸外 壳蛋白区域 57636248bp， 利用 NP_044580.1 上的对应区域 57636248bp 作为模板参考 序列， 使用在线 LA。
33、MP 引物设计软件 Primer Explorer V4 (http:/primerexplorer.jp/ elamp4.0.0/index.html) 设计引物。再通过软件提供的引物相对应的 3 端或 5 端稳定性 及引物二聚体等参数对设计出的多对引物进行比较选择， 最终选取一组最适合的引物， 序 列如下 ： 0073 F3 CCGTCAGGACTTTACTTA 0074 B3 GAGCTGAGAAGCGAAACGA 0075 FIP ACTCGCGGAAAGAATCTCTTCCTTCTAGTTGCTTCACAAGGTAC 0076 BIP CTGTCGTAGATATTAATTCTAGAT。
34、TCCAACACAGGACCGTTGAGGAA 0077 黄瓜绿斑驳花叶病毒 RT-LAMP 的 Mg2+浓度优化实验 0078 从南京农业大学植物病毒学实验室获得病株， 采用 RT-PCR 筛选出黄瓜绿斑驳花 叶病毒病株用于 RT-LAMP 检测实验， 使用 RNA simple Total RNA Kit 总 RNA 提取试剂盒提 取样品总 RNA。RT-LAMP 体系为 ： 10ThermoPol Buffer 1L， dNTP （10mM each) 0.8L， 内引物 FIP（20M） 和 BIP（20M） 各 0.5L， 外引物 F3（10M） 和 B3（10M） 各 0.2L， 。
35、Betaine（5M） 1.6L， Bst DNA Polymerase（8U/L） 0.4L， AMV Polymerase（10U/L） 0.05L， MgCl2（25mM） 的终浓度在 26mM， 以每 1mM 的量递增， 0.8L 总 RNA 模板， 补充 DEPC 水至 10L。反应条件 63 60min， 80 10min。1% 的凝胶电泳观察结果。经优化选取扩 增效率最高的最低终浓度 4mM（图 1 A)， 作为反应体系中 MgCl2的用量。 0079 黄瓜绿斑驳花叶病毒 RT-LAMP 的 dNTP 浓度优化实验 0080 采用实施例 1 中电泳条带清晰、 明亮的反应组对应的 。
36、MgCl2用量进一步作 dNTP 说 明 书 CN 103146847 A 7 6/7 页 8 浓度的优化实验， 反应条件不变， dNTP的终浓度在0.21mM， 以每0.2mM的量递增， 扩增产物 用 1% 凝胶电泳观察结果。经过优化， 确定本发明 dNTP 的终浓度为 0.8mM（图 1 B） 。 0081 黄瓜绿斑驳花叶病毒 RT-LAMP 的外引物浓度优化实验 0082 固定优化好的量， 外引物 F3、 B3 按 1:1 的比例混合， F3、 B3 终浓度以 0.05mM、 0.10mM、 0.15mM、 0.20mM、 0.25mM的量依次递增， 反应条件不变， 1%凝胶电泳观察结果。
37、。 选F3 和 B3 的终浓度各为 0.20M（图 1C） 。 0083 黄瓜绿斑驳花叶病毒 RT-LAMP 的内引物浓度优化实验 0084 固定以上优化好的量， 内引物 FIP、 BIP 按 1:1 的比例混合， FIP、 BIP 终浓度以 0.4mM、 0.6mM、 0.8mM、 1.0mM、 1.2mM 的量依次递增， 反应条件不变， 因此经过重复试验后选择 内引物终浓度各为 1M（图 1 D） 。 0085 黄瓜绿斑驳花叶病毒 RT-LAMP 的 Betaine 浓度的优化 0086 在以上优化试验的基础上进行 Betaine 用量的优化， Betaine 终浓度以 0M、 0.4M、。
38、 0.8M、 1.2M、 1.6M 的量依次递增， 反应条件不变， 反应至少重复三次， 1% 凝胶电泳观察结果。 当 Betaine 的浓度为 0.8M 时扩增效果最好 （图 1 E） 。 0087 黄瓜绿斑驳花叶病毒 RT-LAMP 的温度梯度实验 0088 虽然Bst DNA polymerase 的最适反应温度是65， 但许多报道已经证实RT-LAMP 适合反应温度在 6065之间， 同时由于不同引物在设计时不可能保证所有引物的 Tm 值完 全一致， 而且 RT-LAMP 还要考虑到反转录酶的适宜温度， 鉴于此， 本发明对 RT-LAMP 反应温 度进行优化试验。按实施例 优化的量添加反。
39、应体系， 体系在 61， 62， 63， 64， 65五种条件下恒温反应 1h， 80反应 10min 终止 RT-LAMP 反应， 扩增产物上样， 在 1琼 脂糖凝胶上进行跑电泳， 结果显示在同样反应体系条件下， 在 6163条带亮度越来越亮， 而 6465时条带亮度越来越暗， 且各个温度下的阴性对照无扩增产物 （图 2） 。因此本发明 RT-LAMP 的反应温度为 6364。 0089 黄瓜绿斑驳花叶病毒 RT-LAMP 的反应时间梯度实验 0090 许多报道已经证实了 RT-LAMP 反应时间少于 1h 也能检测到扩增产物。按已经优 化好的 RT-LAMP 体系加样后置于 63恒温条件下。
40、反应， 分别设置温度反应 15min， 30min， 45min， 60min， 75min五种处理， 完成反应后电泳检测。 结果显示当反应时间为45min时已经 有扩增产物， 但产物较少， 但是当反应时间为 6075min 时， RT-LAMP 扩增产物开始增多， 此 后当继续增加反应时间时， 扩增产物的量变化不大 （图 3） ， 因此本发明确定的 RT-LAMP 的反 应时间为 6075min。 0091 RT-LAMP 与 RT-PCR 灵敏性比较 0092 为 了 确 定 RT-LAMP 和 RT-PCR 两 种 检 测 方 法 的 灵 敏 度， 将 提 取 的 总 RNA 用 Nan。
41、oDrop1000 测定浓度 （72ng/L）后用 RNase-free ddH2O 进行 10 倍比稀释， -80保 存作为模板。分别取 10 倍比稀释后的各浓度 RNA 稀释液 0.8L 作为模板， 采用优化好的 RT-LAMP反应体系进行反应 （63反应60min） 。 取3L扩增产物上样， 在1琼脂糖凝胶上 跑电泳。同时， 和 RT-LAMP 保持相同的 RNA 比例， 取 10L 总 RNA 为模板， 1.5L B3 为反转 录引物和1L dNTP在65反应5min， 然后冰浴2min， 冰浴后加入4L 5M-MLV buffer, 2L DTT(50mM), 1L M-MLV 和 。
42、0.5L RRI进行反转录合成cDNA第一链。 取1.6L反 转录合成的 cDNA 为模板， 以 F3 和 B3 为引物进行 PCR 扩增， 使用体系为 10L 的常规 PCR 说 明 书 CN 103146847 A 8 7/7 页 9 反应体系进行反应。反应结束后取 3L 扩增产物上样， 在 1琼脂糖凝胶上跑电泳。结果 显示用RT-LAMP方法可以检测到浓度是7.210-2ng/L的CGMMV的总RNA， 而RT-PCR也能 检测到浓度是 7.2ng/L 的 CGMMV 的总 RNA， 即 RT-LAMP 比 RT-PCR 灵敏度高 100 倍 （图 4A、 B） 。 0093 荧光染料方。
43、法检测 RT-LAMP 灵敏度扩增产物 0094 按实施例 1 中 RT-LAMP 反应产物电泳检测后， 向 PCR 管中加入 SYBR Green I 0.7L （1:1000） ， 几分钟后观察结果， 在紫外光下阳性扩增产物会变成绿色， 而无扩增产物 及阴性对照保持染料的橙色 （图 4C） 。 0095 实施例 2， 粗提黄瓜绿斑驳花叶病毒样做 RT-LAMP 反应的特异性和可视化试验 0096 利用快速提取的样品粗提总 RNA 做 RT-LAMP 0097 快速粗提 RNA 的方法， 可以使 CGMMV RT-LAMP 在检测中快速检测病样， 提高效率。 快速提起 RNA 方法是 ： 用。
44、刚采集的病叶 0.1g， 在 400L 的 0.5M NaOH 溶液中研磨， 取 10L 研磨液加入到 490L Tris-HCL（pH8.0） 中， 直接取 0.8L 的液体作为粗提取总 RNA 模 板做 CGMMV RT-LAMP 检测实验 （图 5） 。 0098 黄瓜绿斑驳花叶病毒 RT-LAMP 特异性试验 0099 为了验证 RT-LAMP 方法的特异性， 选择可以侵染瓜类的病毒作为对照黄瓜花叶病 毒 （CMV） 和烟草花叶病毒 （TMV） 作为对照。分别用试剂盒提取的 CGMMV 总 RNA 和粗体的 CGMMV， CMV， TMV和健康植株的总RNA作为模板， 用实施例1中优化。
45、好的RT-LAMP反应体系进 行反应。结果显示用 RT-LAMP 引物去扩增 TMV 和 CMV 的 RNA 模板时， 没有扩增出条带 ； 而扩 增试剂盒扩增粗提取的CGMMV总RNA时能够扩增出目的条带， 这表明本发明建立的RT-LAMP 检测方法具有很好的特异性 （图 6A） 。 0100 荧光染料方法检测 RT-LAMP 特异性结果 0101 按例2 中RT-LAMP反应产物电泳检测后， 向PCR管中加入SYBR Green I 0.7L （1:1000） ， 几分钟后观察结果， 在紫外光下阳性扩增产物会变成绿色， 而无扩增产物及阴性 对照保持染料的橙色 （图 6B） 。 0102 这种。
46、检测植株上黄瓜绿斑驳花叶病毒方法的应用包括 ： 在甜瓜、 西瓜、 黄瓜、 南瓜 及瓠瓜等多种葫芦科作物疑似病植株的快速诊断与鉴别。 0103 上述实施不以任何形式限定本发明。 说 明 书 CN 103146847 A 9 1/2 页 10 0001 序 列 表 CN 103146847 A 10 2/2 页 11 0002 序 列 表 CN 103146847 A 11 1/6 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 103146847 A 12 2/6 页 13 图 2 说 明 书 附 图 CN 103146847 A 13 3/6 页 14 图 3 说 明 书 附 图 CN 103146847 A 14 4/6 页 15 图 4 说 明 书 附 图 CN 103146847 A 15 5/6 页 16 图 5 说 明 书 附 图 CN 103146847 A 16 6/6 页 17 图 6 说 明 书 附 图 CN 103146847 A 17 。