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1、(10)申请公布号 CN 103146823 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146823 A *CN103146823A* (21)申请号 201310062218.5 (22)申请日 2013.02.27 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 西北农林科技大学 地址 712100 陕西省西安市杨凌示范区邰城 路 3 号西北农林科技大学 (72)发明人 李学军 杨子博 李立群 吴青霞 杨林 邵慧 冉从福 (74)专利代理机构 北京爱普纳杰专利代理事务 所 ( 特殊普通合伙 ) 11419 代理人 何自刚 (54) 发明名称 一种设计碱基替换或插入缺失。
2、的 SNP 分子标 记的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种设计碱基替换或插入缺失 的 SNP 分子标记的方法， 该方法针对由于平常所 用的 TaqDNA 聚合酶要进行正常扩增， 其 5可以 不需要与模板完全匹配， 而其 3要求完全配对。 针对这个特性， 可以特异地将所发现的 SNP 位点 设计在引物 3位置 ； 针对突变型的基因设计的 引物与野生型的基因会形成 3端错配， 导致不 能正常扩增 ； 同样以野生基因设计的引物与突变 型基因的 3端产生错配， 也同样在突变型个体 基因组中不能正常扩增。本发明通过两次 PCR， 再 通过特定技术检测 PCR 结果， 可以方便地确定该 个体 SNP 。
3、位点的基因型。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 3 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103146823 A CN 103146823 A *CN103146823A* 1/1 页 2 1. 一种设计碱基替换或插入缺失的 SNP 分子标记的方法， 其特征在于， 该方法以已 知功能基因 SNP 突变位点为参照， 将此位点设计在特异引物的 3位置 ； 通过分别设计 Allele1 和 Allele2 特异位点两对引物， 通过两次 PCR， 再通。
4、过技术检测 PCR 结果， 确定出个 体 SNP 位点的基因型， 通过标记功能验证及稳定性检测， 将该分子标记用于辅助选择育种。 2.如权利要求1所述的设计碱基替换或插入缺失的SNP分子标记的方法， 其特征在于， 该方法引物设计方法为 ： 两个个体相同的基因处有一个T碱基和C碱基的替换， 由Allele1特异位点T设计特异 引物 P1， 同样由 Allele2 特异位点 C 设计特异引物 P2 ； 两对引物在 Genotype1 中扩增时， P1 引物能够正常扩增出 PCR 产物， P2 引物不能正常扩增而没有 PCR 产物， 确定该基因的基因 型为 TT ； 用相同的方法扩增可以确定 Gen。
5、otype2 基因型为 CC ； 若两者都能得到扩增产物， 可确定 Genotype3 基因型为 TC， 从而分析出 SNP 位点。 权 利 要 求 书 CN 103146823 A 2 1/8 页 3 一种设计碱基替换或插入缺失的 SNP 分子标记的方法 技术领域 0001 本发明属于 SNP 检测技术领域， 尤其涉及一种设计碱基替换或插入缺失的 SNP 分 子标记的方法。 背景技术 0002 单核苷酸多态性 （SNP） 标记技术， 属于新一代的标记技术。 常用来表示不同生物个 体在同一等位基因处个别碱基的差异， 常常出现的单核苷酸多态性有碱基替换、 碱基的插 入缺失。目前， SNP 是所发。
6、现的生物中存在最广泛的变异类型， 即使在不同生物个体中序列 差异不大的基因中也存在一定数量的 SNP 位点， 因此是植物遗传研究中理想的分子标记。 作为新兴的分子标记， SNP 有如下优点 ： 数量多分布广， SNP 比微卫星标记密度更高， 是等位 基因间序列差异最为普遍的类型 ； SNP 具有二态性特点， 其不再以 DNA 序列长度的不同来检 测多态性， 能够用不同的方法进行基因的检测 ； 在启动子区的 SNP 可能对基因的表达造成 影响， 而在编码序列的 SNP 可能会影响到所编码蛋白的结构和功能， 是目前遗传研究的热 点。 0003 目前， 检测 SNP 的方法很多， 常用的有如下几种 。
7、： 利用生物信息学的方法在已有的 DNA 数据库中搜索 SNP， 这种方法比较直接、 快捷 ； 单链构象多态性 （SSCP） ， 通过个别碱基的 变化影响 DNA 的构象的原理来检测 SNP， 操作简单、 经济、 适用面广。但影响因素较多， 如电 泳温度、 凝胶浓度均可影响其灵敏性， 所以稳定性不高 ； 酶切法， 基因中个别碱基的变化， 可 造成原来基因中部分酶切位置的变化， 通过特异酶切割所扩增的序列， 产生大小不一的切 割片段， 再利用简单的检测手段来可达到区分该位点的目的。酶切检测法方便、 准确， 但只 能分析酶切位点处的 SNP， 而不能检测酶切位点以外的 SNP， 所以有一定局限性 。
8、； 杂交法， 如 DNA 芯片技术， 可以大大提高检测速度， 但价格较昂贵 ； 测序法， 对不同个体等位基因片段 进行测序分析， 检测序列中的碱基变异。该法直观、 准确， 但工作量大， 价格昂贵 ； PCR 法， 利 用引物序列 3端的 SNP 不能与模板有效结合， 导致 PCR 扩增结果的不一， 通过特定的手段 检测PCR结果来达到确定SNP位点的目的。 PCR法方便快捷但受较多其它因子的干扰， 重复 性较差。利用 SNP 标记， 人们已成功标记了一些抗病、 抗逆和优质基因 （Buren etal.2000 ； Brooks et al.2006 ； Mondini et al.2012） 。
9、。 0004 从以上方法可以看出， 目前常用的方法存在稳定性不高、 有一定局限性、 价格较昂 贵、 重复性差等。 发明内容 0005 本发明实施例的目的在于提供一种设计碱基替换或插入缺失的 SNP 分子标记的 方法， 在获得基因序列后， 针对该基因的变异开发相应的功能标记， 对研究基因的功能并有 效利用该基因提供坚实的基础。 0006 本发明实施例是这样实现的， 一种设计碱基替换或插入缺失的 SNP 分子标记的方 法， 该方法将所发现的SNP位点设计在引物3位置 ； 该方法通过两次PCR， 再通过技术检测 说 明 书 CN 103146823 A 3 2/8 页 4 PCR 结果， 确定出个体。
10、 SNP 位点的基因型。 0007 进一步， 该方法引物设计方法为 ： 0008 两个个体相同的基因处有一个 T 碱基和 C 碱基的替换， 由 Allele1 特异位点 T 设 计特异引物 P1， 同样由 Allele2 特异位点 C 设计特异引物 P2 ； 两对引物在 Genotype1 中扩 增时， P1 引物能够正常扩增出 PCR 产物， P2 引物不能正常扩增而没有 PCR 产物， 确定该基因 的基因型为 TT ； 用相同的方法扩增可以确定 Genotype2 基因型为 CC ； 若两者都能得到扩增 产物， 可确定 Genotype3 基因型为 TC， 从而分析出 SNP 位点。 00。
11、09 本发明提供的方法针对由于平常所用的 TaqDNA 聚合酶要进行正常扩增， 其 5可 以不需要与模板完全匹配， 而其 3要求完全配对。针对这个特性， 可以特异地将所发现的 SNP 位点设计在引物 3位置 ； 针对突变型的基因设计的引物与野生型的基因会形成 3端 错配， 导致不能正常扩增 ； 同样以野生基因设计的引物与突变型基因的 3端产生错配， 也 同样在突变型个体基因组中不能正常扩增。本发明通过两次 PCR， 再通过特定技术检测 PCR 结果， 可以方便地知道该个体 SNP 位点的基因型。 附图说明 0010 图 1 是本发明实施例提供的等位基因特异 PCR 技术原理 0011 图 2 。
12、是本发明实施例提供的 AS-PCR 引物设计 ； 黑体表示加入的错配碱基 ； 0012 图 3 是本发明实施例提供的 AS-PCR 引物组合筛选 0013 图 4 是本发明实施例提供的部分 F2后代基因分型结果 ； 泳道 1-20 为 F2代第 300-319 个单株的基因型结果 ； 0014 图 5 是本发明实施例提供的 AS-PCR 引物在 24 个品种中的扩增 ； M ： DNA Ladder ； 1 中国春 ； 2 兰考大粒 ； 3 长武 0318 ； 4 郑麦 366 ； 5 烟农 192 ； 6 西农 979 ； 7 皖麦 38 ； 8 济麦 22 ； 9 郑麦 9623 ； 10。
13、 皖麦 50 ； 11 小偃 22 ； 12 周麦 18 ； 13 四川大粒 ； 14 陕麦 229 ； 15 淮麦 20 ； 16 西农2611 ； 17西农9871 ； 18兰考185 ； 19郑麦0856 ； 20明贤169 ； 21BYL3 ； 22大地98 ； 23宿 7075 ； 24 徐麦 9074 ； 0015 图 6 是本发明实施例提供的 5 个品种的籽粒图。 具体实施方式 0016 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合附图及实施例， 对 本发明进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并 不用于限定本发明。 001。
14、7 如图 1 表示的是该技术引物设计原理， 两个个体相同的基因处有一个 T 碱基和 C 碱基的替换。 这样可以由Allele1特异位点T设计特异引物P1， 同样由Allele2特异位点C 设计特异引物P2(图1A)。 两对引物在Genotype1中扩增时， P1引物能够正常扩增出PCR产 物， P2 引物不能正常扩增而没有 PCR 产物 ( 图 1B)， 可以确定该基因的基因型为 TT ； 用相同 的方法扩增可以确定Genotype2基因型为CC ； 若两者都能得到扩增产物， 可确定Genotype3 基因型为 TC。这样可通过简单的电泳技术来分析该 SNP 位点 ( 图 1C)。 0018 。
15、本发明用克隆的小麦粒重基因 TaGW2 的大小粒品种碱基差异为例， 该基因全长 cDNA1275bp, 大粒品种兰考大粒在 977bp 处和小粒品种中国春相比有一个 “T” 碱基的插入， 说 明 书 CN 103146823 A 4 3/8 页 5 其余部分碱基基本相同， 如图 2 所示， 在突变位点处， 根据兰考大粒的序列设计了三个引 物 ： F4、 F6 和 R4。其中 F4、 F6 为上游引物分别在其 3端第 2 位和第 3 位加入错配碱基 G ； R4为下游引物在其3端第2位加入了错配碱基G。 由中国春的序列设计一个引物F5， 在其 3端第 2 位引入错配碱基 G。此外， 还分别在突变。
16、位点两侧 200bp 处设计一对内参引物 F3 和R3， 扩增片段长度约540bp。 通过特异引物F4、 F5、 F6和R4分别与内参引物F3和R3组合， 便形成了 4 套引物组合 （TaGW2-AS-P1、 TaGW2-AS-P2、 TaGW2-AS-P3 和 TaGW2-AS-P4） ， 用于 扩增兰考大粒和中国春的特异序列。 以兰考大粒特异引物组合 （TaGW2-AS-P1、 TaGW2-AS-P3 和 TaGW2-AS-P4） 结合中国春特异引物组合 （TaGW2-AS-P2） 可鉴定基因型。引物序列列于 表 1 中， 由大连宝生物生物工程有限公司合成。 0019 表 1 AS-PCR。
17、 引物设计 ； 黑体表示加入的错配碱基 0020 0021 .3 本发明技术方案带来的有益效果 0022 3.1 基因组 DNA 的提取 说 明 书 CN 103146823 A 5 4/8 页 6 0023 取田间兰考大粒 / 中国春 F2代 327 单株及另外 22 个小麦品种幼苗叶片， 采用微 量 CTAB 法提取基因组 DNA。 0024 3.2SNP 标记的筛选 0025 首先以中国春和兰考大粒的基因组DNA为模板， 用AS-PCR引物进行扩增， 并对PCR 条件进行优化， 筛选多态性比较好的引物标记。 0026 PCR 程序有所不同， 以中国春和兰考大粒的 cDNA 为模板， 4 。
18、套引物组合进行扩增。 以TaGW2-AS-P1引物组合为例， 冰浴状态下向PCR管中加入反应体系如下 ： 2.5L PCR缓冲 液 (10x)、 2L dNTPs(10mmo1L-1)、 0.4L F3(10mo1L-1)、 0.6L F4(10mo1L-1)、 1L R3(10mo1 L-1)、 0.125L TaqDNA 聚合酶 (4U L-1)、 1L DNA 模板及 17.375L 无 菌双蒸水， 总反应体系为 25L。 0027 PCR 扩增程序如下， 94预变性 5min ； 94 30s， 56-58优化退火 30s， 72延伸 1min， 39 个循环 ； 72温育 10min。
19、。 0028 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测 ,Marker 为 DL2000。 0029 以中国春 （CS） 和兰考大粒 （LK） 基因组 DNA 为模板， 四个引物组合进行 PCR 扩增， 并对引物所需的最适温度 （56、 57 和 58） 进行了优化。结果显示， 四个引物组合中， 除了 TaGW2-AS-P1， 其它三个组合都得到了预期特异的扩增产物， 并表现出良好的多态性。其 中 TaGW2-AS-P2 只在中国春的基因组中得到了特异性扩增产物， 片段大小在 320bp 左右 ； TaGW2-AS-P3和TaGW2-AS-P4都只在兰考大粒中获得了特异扩增产物， 其中TaGW2-AS-P3。
20、特 异片段在 320bp 左右 ,TaGW2-AS-P4 特异片段大小在 260bp 左右。除此之外， 每一套引物组 合都扩增到了 540bp 左右大小的内参片段。 0030 对每一套引物都进行了三个温度的筛选， 其都在 57的温度下获得了最佳扩增片 段 （图 3） 。 0031 F2 群体基因型检测 0032 以兰考大粒特异引物组合 TaGW2-AS-P4 结合中国春特异引物组合 TaGW2-AS-P2， 在两亲本组成的F2群体327个单株的基因组DNA中进行扩增以确定各单株的基因型。 其中 仅用 TaGW2-AS-P4 引物组合能扩增出条带与兰考大粒带型一样的就记为纯和基因型 （TT） ，。
21、 仅用 TaGW2-AS-P2 引物组合能扩增出条带与中国春带型一样的就记为纯和基因型 （tt） , 用 两引物都能扩增出条带的记为杂合基因型 （Tt） 。 0033 两套引物在 F2群体中显示出良好的多态性 （图 4） ， 其基因分型结果显示 327 个单 株中 , 共有 75 个 TT 基因型个体， 184 个杂合基因性 Tt 个体， 68 个 tt 基因型个体。该比例 符合单基因分离的 1:2:1 的比例 (2=5.44,P 0.05)。这样 F2:3群体根据基因型就相应 地分成三组。 0034 3.3 关联分析 0035 分别收获各地 F2:3群体的小麦籽粒， 并进行粒宽 （KW） 、。
22、 粒长 （KL） 和千粒重 （TKW） 的 测量。后用 SPSS 数据分析软件分别对各地区收获的各基因型群体的籽粒进行统计分析。 0036 通过对各地区每个基因型群体数据统计结果显示， 三个环境下都检测到 TT 基因 型群体的粒宽、 粒长和千粒重都与 tt 基因型各性状的差异都达到了极显著的水平， Tt 基因 型群体的各性状与tt基因型性状的差异都达到了极显著的水平， 可见T碱基的插入突变显 著提高了籽粒的粒重相关性状 ； 对三个环境数据总和及杨凌地区的分析显示 TT 基因型的 说 明 书 CN 103146823 A 6 5/8 页 7 粒宽与 Tt 基因型的粒宽的差异达到了显著水平， 而粒。
23、长和千粒重的差异却不显著， 表明该 突变位点对粒宽的影响更大， 并且对粒宽的效应可能受环境的影响也较大 ； 数据分析发现， TT 和 Tt 基因型的粒宽比 tt 基因型分别增加 0.18 和 0.13mm, 其千粒重比 tt 基因型分别增 加 3.94 和 2.92g。 0037 4.SNP 标记在其它品种中的应用 0038 是否 TaGW2 基因中的 T 插入突变是仅仅发生在兰考大粒中而被筛选出来， 还是 在其它品种中也广泛存在？带着这个疑问， 又选取了 22 个籽粒大小各不同的小麦品种， 用所开发的 AS-PCR 标记进行筛选。除了用 TaGW2-AS-P4 和 TaGW2-AS-P2 引。
24、物组合， 也用 TaGW2-AS-P3 引物组合进行了筛选。 0039 结果显示， 利用TaGW2-AS-P4引物组合， 在22个品种中又筛选出两个品种， 四川大 粒与皖麦38， 它们与兰考大粒有相同的PCR扩增产物， 而用TaGW2-AS-P2引物组合没有特异 扩增， 说明这两个品种的基因型也为 TT 与兰考大粒基因型相同。用 TaGW2-AS-P3 引物组合 也得到了相同的结果， 说明标记的稳定性比较好 （图 5） 。对四川大粒与皖麦 38 的籽粒的测 量数据显示， 四川大粒的粒长 (8.440.10mm) 和粒宽 （3.800.03mm） 比兰考大粒更长更 宽， 其千粒重 (66.711。
25、.54g) 也更大。而皖麦 38 的籽粒不长 (6.890.02mm) 但粒宽却较 大 (3.450.04mm)。其它品种与中国春带型一样， 为 tt 基因型， 它们的籽粒都小于四川大 粒 （表 2） 。结果表明 TaGW2 基因的 T 碱基插入突变也存在于其它品种中， 但数量较少， 推测 该突变是最近引入小麦基因库中的， 已经被人们在选择育种中利用。 0040 表 2 22 个品种的表型与基因型数据 0041 说 明 书 CN 103146823 A 7 6/8 页 8 0042 5. 对 SNP 标记的验证 0043 为进一步检验标记扩增的准确性， 利用扩增片段包含突变位点的引物 TaGW。
26、2-P3 及四川大粒、 皖麦 38 及明贤 169 的基因组 DNA 为模板， 对 TaGW2 基因第 8 外显子的部分片 段进行克隆测序。 0044 结果表明， 利用 TaGW2-P3 引物， 在四川大粒和皖麦 38 中的测序结果中有 539bp 的 序列， 而明贤 169 中的序列为 538bp。比对兰考大粒、 四川大粒、 皖麦 38、 中国春和明贤 169 的序列， 发现在同样的位置， 四川大粒和皖麦 38 中都有与兰考大粒一致的 T 碱基插入 ( 见 序列表 )。而明贤 169 是个小粒品种 ( 图 6)， 千粒重仅有 27.250.75g, 其序列与中国春 说 明 书 CN 1031。
27、46823 A 8 7/8 页 9 一致， 没有 T 碱基的插入。该结果说明所设计的 SNP 标记不仅稳定性好， 而且准确可靠， 可 用于分子标记辅助育种。 0045 以下是本发明实施例提供的 5 个品种第 8 外显子部分序列比对 .SC 四川大粒 ,WM 皖麦 38,LK 兰考大粒 ,MX 明贤 169,CS 中国春 * 指示 T 碱基插入突变位点 ； 0046 SC 1 GCTTGTGGGAGTTTTATGCCTTTTGAGCAACCAACGCGTGAGAGGCAGGCATTCGTTGCA 0047 WM 1 GCTTGTGGGAGTTTTATGCCTTTTGAGCAACCAACGCGTG。
28、AGAGGCAGGCATTCGTTGCA 0048 LK 1 GCTTGTGGGAGTTTTATGCCTTTTGAGCAACCAACGCGTGAGAGGCAGGCATTCGTTGCA 0049 MX 1 GCTTGTGGGAGTTTTATGCCTTTTGAGCAACCAACGCGTGAGAGGCAGGCATTCGTTGCA 0050 CS 1 GCTTGTGGGAGTTTTATGCCTTTTGAGCAACCAACGCGTGAGAGGCAGGCATTCGTTGCA 0051 SC 61 GCTCCTCCTCTAGAAATGCCCCATCCTGGTGGATTTTCTTGTGCTGTTGCTGCTA。
29、TGGCT 0052 WM 61 GCTCCTCCTCTAGAAATGCCCCATCCTGGTGGATTTTCTTGTGCTGTTGCTGCTATGGCT 0053 LK 61 GCTCCTCCTCTAGAAATGCCCCATCCTGGTGGATTTTCTTGTGCTGTTGCTGCTATGGCT 0054 MX 61 GCTCCTCCTCTAGAAATGCCCCATCCTGGTGGATTTTCTTGTGCTGTTGCTGCTATGGCT 0055 CS 61 GCTCCTCCTCTAGAAATGCCCCATCCTGGTGGATTTTCTTGTGCTGTTGCCGCTATGGCT 0056 S。
30、C 121 GAGCACCAGCCATCAAGCATGGATTTCTCTTACATGACTGGTAGTAGTGCGTTCCCGGTC 0057 WM 121 GAGCACCAGCCATCAAGCATGGATTTCTCTTACATGACTGGTAGTAGTGCGTTCCCAGTC 0058 LK 121 GAGCACCAGCCATCAAGCATGGATTTCTCTTACATGACTGGTAGTAGTGCGTTCCCAGTC 0059 MX 121 GAGCACCAGCCATCAAGCATGGATTTCTCTTACATGACTGGTAGTAGTGCGTTCCCAGTC 0060 CS 121 GA。
31、GCACCAGCCATCAAGCATGGATTTCTCTTACATGACTGGTAGTAGTGCGTTCCCAGTC 0061 SC 181 TTTGACATGTTCCGCCGACCGTGCAACATTGCTGGTGGAAGCATGGGTGCTGCGGAAAGT 0062 WM 181 TTTGACATGTTCCGCCGACCGTGCAACATTGCTGGTGGAAGCATGGGTGCTGCGGAAAGT 0063 LK 181 TTTGACATGTTCCGCCGACCGTGCAACATTGCTGGTGGAAGCATGGGTGCTGCGGAAAGT 0064 MX 181 TTTGACATGT。
32、TCCGCCGACCGTGCAACATTGCTGGTGGAAGCATGGGTGCTGCGGAAAGT 0065 CS 181 TTTGACATGTTCCGCCGACCGTGTAACATTGCTGGTGGAAGCATGGGTGCTGCGGAAAGT 0066 * 0067 SC 241 TTCACCAGATAGCTGGAGCGGGATAGCGCCAAGTTGCAGCAGAAGGGAAGTGGTAAGAGA 0068 WM 241 TTCACCAGATAGCTGGAGCGGGATAGCGCCAAGTTGCTGCAGAAGGGAAGTGGTAAGAGA 0069 LK 241 TTCACCAGATA。
33、GCTGGAGCGGGATAGCGCCAAGTTGCAGCAGAAGGGAAGTGGTAAGAGA 0070 MX 241 T-CACCAGATAGCTGGAGCGGGATAGCGCCAAGTTGCAGCAGAAGGGAAGTGGTAAGAGA 0071 CS 241 T-CACCAGATAGCTGGAGCGGGATAGCGCCAAGTTGCAGCAGAAGGGAAGTGGTAAGAGA 0072 SC 301 GGAAGGAGAGTGCTCAACCGACCACTTGTCAGAGGGTGCAGAGGCCGGGACAAGCTATGC 0073 WM 301 GGAAGGAGAGTGCTCAACC。
34、GACCACTTGTCAGAGGGTGCAGAGGCCGGGACAAGCTATGC 0074 LK 301 GGAAGGAGAGTGCTCAACCGACCACTTGTCAGAGGGTGCAGAGGCCGGGACAAGCTATGC 0075 MX 300 GGAAGGAGAGTGCTCAACCGACCACTTGTCAGAGGGTGCAGAGGCCGGGACAAGCTATGC 0076 CS 300 GGAAGGAGAGTGCTCAACCGACCACTTGTCAGAGGGTGCAGAGGCCGGGACAAGCTATGC 0077 SC 361 CGGCTCGGACATTGTGGTGGATGCGGG。
35、GACAATGCTACCGTTGCCTTTTGCTGACAATTA 0078 WM 361 CGGCTCGGACATTGTGGTGGATGCGGGGACAATGCTACCGTTGCCTTTTGCTGACAATTA 0079 LK 361 CGGCTCGGACATTGTGGTGGATGCGGGGACAATGCTACCGTTGCCTTTTGCTGACAATTA 0080 MX 360 CGGCTCGGACATCGTGGTGGATGCGGGGACAATGCCACCGTTGCCTTTTGCTGACAATTA 说 明 书 CN 103146823 A 9 8/8 页 10 0081 CS 360 CGG。
36、CTCGGACATTGTGGTGGATGCGGGGACAATGCTACCGTTGCCTTTTGCTGACAATTA 0082 SC 421 CAGTATGGTTGCAAGCCATTTCCGTCCTGAGAGCATCGAAGAACAAATGATGTATTCCAT 0083 WM 421 CAGTATGGTTGCAAGCCATTTCCGTCCTGAGAGCATCGAAGAACAAATGATGTATTCCAT 0084 LK 421 CAGTATGGTTGCAAGCCATTTCCGTCCTGAGAGCATCGAAGAACAAATGATGTATTCCAT 0085 MX 420 CAGTATGGTTG。
37、CAAGCCATTTCCGTCCTGAGAGCATCGAAGAACAAATGATGTATTCCAT 0086 CS 420 CAGTATGGTTGCAAGCCATTTCCGTCCTGAGAGCATCGAAGAACAAATGATGTATTCCAT 0087 SC 481 GGCTGTTTCTTTAGCAGAAGCTCATGGTAGAACGCACACGCAAGGGTTGGCATGGTTGT 0088 WM 481 GGCTGTTTCTTTAGCAGAAGCTCATGGTAGAACGCACACGCAAGGGTTGGCATGGTTGT 0089 LK 481 GGCTGTTTCTTTAGCAGAAGC。
38、TCATGGTAGAACGCACACGCAAGGGTTGGCATGGTTGT 0090 MX 480 GGCTGTTTCTTTAGCAGAAGCTCATGGTAGAACGCACACGCAAGGGTTGGCATGGTTGT 0091 CS 480 GGCTGTTTCTTTAGCAGAAGCTCATGGTAGAACGCACACGCAAGGGTTGGCATGGTTGT 0092 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103146823 A 10 1/3 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 103146823 A 11 2/3 页 12 0003 序 列 表 CN 103146823 A 12 3/3 页 13 序 列 表 CN 103146823 A 13 1/3 页 14 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103146823 A 14 2/3 页 15 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103146823 A 15 3/3 页 16 图 6 说 明 书 附 图 CN 103146823 A 16 。