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1、(10)申请公布号 CN 103145722 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103145722 A *CN103145722A* (21)申请号 201310068308.5 (22)申请日 2013.03.05 C07D 493/04(2006.01) (71)申请人 福建省微生物研究所 地址 350000 福建省福州市仓山区进步路 25 号 (72)发明人 杨煌建 张祝兰 唐文力 任林英 庄鸿 陈宏 孙菲 郑卫 (74)专利代理机构 福州市鼓楼区京华专利事务 所 ( 普通合伙 ) 35212 代理人 宋连梅 (54) 发明名称 一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法 。
2、(57) 摘要 本发明提供一种高速逆流色谱分离提纯埃博 霉素的方法， 所述方法的步骤如下 ： 制备构成高 速逆流色谱仪固定相和流动相的溶剂体系 ； 将高 速逆流色谱仪填充满固定相， 设置恒温循环器的 温度， 调节高速逆流色谱仪主机转速， 最后泵入流 动相， 至整个体系建立动态平衡 ； 将埃博霉素粗 提物溶解于流动相中， 有进样阀进样 ； 根据紫外 检测器图谱或高效液相色谱， 收集目标产物。 本发 明对于埃博霉素粗提物的分离度高， 且提纯后获 得的目标产物纯度高， 同时适合自动化生产， 具有 很高的经济效益。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 (19)中华。
3、人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103145722 A CN 103145722 A *CN103145722A* 1/1 页 2 1. 一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法， 其特征在于 ： 所述方法以高速逆流色 谱仪为分离提纯设备， 以粘细菌发酵产生的埃博霉素粗提物为原料进行分离提纯 ； 所述方 法的步骤如下 ： 步骤 10、 制备构成高速逆流色谱仪固定相和流动相的溶剂体系 ； 步骤 20、 将高速逆流色谱仪填充满固定相， 设置恒温循环器的温度， 调节高速逆流色谱 仪主机转速， 最后泵入流动相， 至整个固定相。
4、 - 流动相体系建立动态平衡 ； 步骤 30、 将埃博霉素粗提物溶解于流动相中， 有进样阀进样 ； 步骤 40、 根据紫外检测器图谱或高效液相色谱， 收集目标产物。 2. 根据权利要求 1 所述的一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法， 其特征在于 ： 所述高速逆流色谱仪是分析型、 半制备型或制备型高速逆流色谱仪。 3. 根据权利要求 1 所述的一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 10 的溶剂体系包括烷烃、 脂肪酸酯、 甲醇和水， 将烷烃、 脂肪酸酯、 甲醇和水混合、 摇匀后静置， 取分层后的上相为固定相， 下相为流动相。 4. 根据权利要求 3 所述的一种高速。
5、逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法， 其特征在于 ： 所述溶剂体系中烷烃、 脂肪酸酯、 甲醇、 水体积比为 0.6 1.5 ： 0.8 2.0 ： 0.8 1.5 ： 1。 5. 根据权利要求 1 所述的一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 20 设置的恒温循环器的温度为 15 25。 6. 根据权利要求 5 所述的一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法， 其特征在于 ： 所述恒温循环器的温度设置为 20。 7. 根据权利要求 1 所述的一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 20 泵入的流动相流速为 1.0 2.5ml/min。 8. 根。
6、据权利要求 7 所述的一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法， 其特征在于 ： 所述流动相流速为 1.5ml/min。 9. 根据权利要求 1 所述的一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 20 的高速逆流色谱仪主机转速为 800 880rpm。 10. 根据权利要求 9 所述的一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法， 其特征在于 ： 所述高速逆流色谱仪主机转速 850rpm。 权 利 要 求 书 CN 103145722 A 2 1/5 页 3 一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法 【技术领域】 0001 本发明涉及一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法。 【背。
7、景技术】 0002 埃 博 霉 素 (epothilone，) 是 目 前 临 床 上 继 紫 杉 醇 （paclitaxel,）之后最为成功的抗肿瘤化疗药物。1993 年赫弗勒 （Hofle）等报 道从南非 Zambesi 河岸的泥土中找到一种黏细菌纤维素堆囊菌 (Sorangium cellulosum Myxococcales) 菌株， 并从其培养物中分离得到新的 16 元大环内酯化合物埃博霉素 A 和 B。获得的埃博霉素的示意图由赫弗勒 （Hofle） 等在 WO 93/10121 中描述。埃博霉素 (epothilone)A 和 B 具有以下结构式 ： 0003 0004 Epoth。
8、ilone B R=CH3 0005 1995 年博拉格 （Bollag） 等人发现埃博霉素是一种具有类似紫杉醇的促微管蛋白 聚合特性 （Bollag,D.M.,Cancer Res 55,2325-2333,1995） 。在治疗用途实例中， 国际申请 WO 99/43320 描述了埃博霉素作为抗增生疾病、 尤其是抗肿瘤疾病药物制剂的各种给药方 式。WO 99/39694 公开了埃博霉素、 尤其是埃博霉素 A 和 B 的一些具体制剂。与已经确立的 治疗相比， 埃博霉素比紫杉醇有更好的水溶性， 毒副作用很小 （施用会伴随一些临 床的副作用， 如中性白细胞减少症、 外周神经病变、 脱发与过敏反应等。
9、） ， 而且埃博霉素不是 P2 糖蛋白的底物， 对多药耐药细胞有很强的细胞毒性， 尤其是用治疗已经产生耐药 性的情况下， 埃博霉素、 尤其是埃博霉素 A 且最优选埃博霉素 B 仍然有很强的细胞毒作用。 因此， 为了满足临床的需要， 迫切需要生产大量高纯度的埃博霉素。 0006 迄今为止， 生产埃博霉素最有效的方法至少包括由粘细菌生物合成步骤和从其发 酵培养基分离纯化的步骤。赫弗勒 （Hofle） 等在 WO 93/10121 中描述， 在纤维堆囊菌培养 过程中加入了吸附树脂， 然后将埃博霉素从吸附树脂洗脱下来， 进一步通过反相色谱法分 离各种埃博霉素并使其结晶。然而， 赫弗勒 （Hofle） 。
10、等承认这种方法只能生产低数量的埃 博霉素， 以及纯埃博霉素的回收率低。 其它的如硅胶柱层析法同样存在分离周期长、 回收率 低、 分离效果差等问题。 因此， 在技术上需要有生产埃博霉素以及分离和纯化埃博霉素的改 说 明 书 CN 103145722 A 3 2/5 页 4 进方法。 0007 高速逆流色谱 （High-speed Counter-current Chromatograph,HSCCC） 是国际上 于 20 世纪 80 年代以来在液液分配色谱基础上发展起来的新型分离技术， 它具有传统 液固色谱无法比拟的优势。首先， 它的流动相、 固定相都是液体， 不需要固体支撑或载体 而避免对样品。
11、的不可逆吸附， 可以保证样品在不损失的情况下进行各组分的分离， 理论上 样品的回收率是非常高的， 因此可以节省样品和溶剂消耗， 对于珍贵样品的分离是最佳的 选择 ； 其次， 它的分离效率高， 分离时间短， 一般一次分离只需几个小时 ； 此外， 它还具有操 作便捷、 液液分配体系选择广泛、 分离量大及重现性好等优点， 易形成自动化， 已成功应 用于生物、 医药、 化工等领域各种物质的制备分离和纯化。 0008 利用粘细菌产生埃博霉素并进一步分离提取埃博霉素的描述见于 WO 93/10121、 WO 99/42602 等， 但现有文献中， 未见有高速逆流色谱用于埃博霉素 A/B 分离的国内外报 道。
12、。 【发明内容】 0009 本发明要解决的技术问题， 在于提供一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方 法， 该方法对于埃博霉素粗提物的分离度高， 且提纯后获得的目标产物纯度高， 同时适合自 动化生产， 具有很高的经济效益。 0010 本发明是这样实现的 ： 0011 一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法， 所述方法以高速逆流色谱仪为分离 提纯设备， 以粘细菌发酵产生的埃博霉素粗提物为原料进行分离提纯 ； 所述方法的步骤如 下 ： 0012 步骤 10、 制备构成高速逆流色谱仪固定相和流动相的溶剂体系 ； 0013 步骤 20、 将高速逆流色谱仪填充满固定相， 设置恒温循环器的温度， 调节高速逆。
13、流 色谱仪主机转速， 最后泵入流动相， 至整个固定相 - 流动相体系建立动态平衡 ； 0014 步骤 30、 将埃博霉素粗提物溶解于流动相中， 有进样阀进样 ； 0015 步骤 40、 根据紫外检测器图谱或高效液相色谱， 收集目标产物。 0016 进一步地， 所述高速逆流色谱仪是分析型、 半制备型或制备型高速逆流色谱仪。 0017 进一步地， 所述步骤 10 的溶剂体系包括烷烃、 脂肪酸酯、 甲醇和水， 将烷烃、 脂肪 酸酯、 甲醇和水混合、 摇匀后静置， 取分层后的上相为固定相， 下相为流动相。 0018 进一步地， 所述溶剂体系中烷烃、 脂肪酸酯、 甲醇、 水体积比为 0.6 1.5 ： 。
14、0.8 2.0 ： 0.8 1.5 ： 1。 0019 进一步地， 所述步骤 20 设置的恒温循环器的温度为 15 25。 0020 进一步地， 所述恒温循环器的温度设置为 20。 0021 进一步地， 所述步骤 20 泵入的流动相流速为 1.0 2.5ml/min。 0022 进一步地， 所述流动相流速为 1.5ml/min。 0023 进一步地， 所述步骤 20 的高速逆流色谱仪主机转速为 800 880rpm。 0024 进一步地， 所述高速逆流色谱仪主机转速 850rpm。 0025 本发明具有如下优点 ： 0026 1. 本发明可以有效避免因固体分离介质不可逆吸附作用引起的样品损失、。
15、 样品组 说 明 书 CN 103145722 A 4 3/5 页 5 分的化学变性 ； 0027 2. 本发明可通过调节溶剂体系的配比关系、 主机转速和流动相流速等工艺条件， 以实现同时或分别分离出高纯度的不同种类的埃博霉素单体组分。 另外可以根据分离目标 产物的需要量， 选用分析型、 半制备型或制备型高速逆流色谱仪 ； 0028 3. 本发明分离纯化过程条件温和、 分离过程高效便捷、 分离制备量大、 分离度高， 且提纯后获得的目标产物纯度高， 同时本发明节约溶剂、 适合自动化生产， 具有很高的经济 效益。 【附图说明】 0029 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。 0030 图。
16、 1 是实施例 1 的高速逆流色谱图谱。 0031 图 2 是实施例 1 制备的埃博霉素 A 的高效液相及紫外全波段扫描检测图谱。 0032 图 3 是实施例 1 制备的埃博霉素 B 的高效液相及紫外全波段扫描检测图谱。 0033 图 4 是实施例 1 制备的埃博霉素 A 的液相质谱检测图谱。 0034 图 5 是实施例 1 制备的埃博霉素 B 的液相质谱检测图谱。 【具体实施方式】 0035 请参阅图 1 5 所示， 对本发明的实施例进行详细的说明。 0036 如图15所示， 本发明涉及一种一种高速逆流色谱分离提纯埃博霉素的方法， 所 述方法以高速逆流色谱仪为分离提纯设备， 以粘细菌发酵产生。
17、的埃博霉素粗提物为原料进 行分离提纯 ； 所述方法的步骤如下 ： 0037 步骤 10、 制备构成高速逆流色谱仪固定相和流动相的溶剂体系 ； 0038 步骤 20、 将高速逆流色谱仪填充满固定相， 设置恒温循环器的温度， 调节高速逆流 色谱仪主机转速， 最后泵入流动相， 至整个固定相 - 流动相体系建立动态平衡 ； 0039 步骤 30、 将埃博霉素粗提物溶解于流动相中， 有进样阀进样 ； 0040 步骤 40、 根据紫外检测器图谱或高效液相色谱， 收集目标产物。 0041 所述高速逆流色谱仪是分析型、 半制备型或制备型高速逆流色谱仪。 0042 所述步骤 10 的溶剂体系包括烷烃、 脂肪酸酯。
18、、 甲醇和水， 将烷烃、 脂肪酸酯、 甲醇 和水混合、 摇匀后静置， 取分层后的上相为固定相， 下相为流动相 ； 所述溶剂体系中烷烃、 脂 肪酸酯、 甲醇、 水体积比为 0.6 1.5 ： 0.8 2.0 ： 0.8 1.5 ： 1。 0043 所述步骤 20 设置的恒温循环器的温度为 15 25， 较优为 20。 0044 所述步骤 20 泵入的流动相流速为 1.0 2.5ml/min， 较优为 1.5ml/min。 0045 所述步骤 20 的高速逆流色谱仪主机转速为 800 880rpm， 较优为 850rpm。 0046 以下结合实施例对本发明作进一步地说明。 0047 粗提物样品的获。
19、得 ： 在粘细菌发酵过程中， 加入 XAD-16 大孔吸附树脂， 发酵结束 后收集大孔树脂， 进行甲醇浸泡， 浸泡液浓缩至无醇味后， 加入乙酸丁酯与水 （1 ： 1） 配制的 溶液， 萃取 3 次， 收集乙酸丁酯相， 浓缩得到粗提物。 0048 高速逆流色谱仪 ： TBE-300A 高速逆流色谱仪， 上海同田生物技术有限公司。 0049 实施例一 说 明 书 CN 103145722 A 5 4/5 页 6 0050 配制溶剂体系， 其中正己烷 ： 乙酸乙酯 ： 甲醇 ： 水的体积比 1 ： 1 ： 1 ： 1， 共 1500ml 混 溶于分液漏斗中， 摇匀后静置分层， 取上相为固定相， 下相。
20、为流动相， 超声脱气后， 先将固定 相泵入分离柱， 设定恒温循环器的温度为 20， 然后开启高速逆流色谱仪主机， 调节主机转 速 850rpm， 流动相以 1.5ml/min 流速泵入分离柱， 至整个固定相 - 流动相体系建立动态平 衡， 平衡 10min。 0051 计算得平衡时本溶剂体系的保留率 为 78.8（ （V总-V出） /V总100， 其中 V总： 分离柱体管路总体积 (ml)， V出： 平衡过程中流动相推出的固定相体积 (ml)。将 50mg 埃博霉素粗提物样品溶解于 20ml 流动相， 由进样阀进样， 然后根据紫外检测器图谱， 分别收集埃博霉素 A 和埃博霉素 B。 0052 。
21、目标产物鉴定 ： 将收集的目标产物经紫外全波段扫描、 液相质谱联用、 核磁共振谱 验证其结构， 经高效液相色谱分析 （HPLC） 纯度， 由图 1 5 可知， 目标产物分别为埃博霉素 A， 纯度 95.6 ； 埃博霉素 B， 纯度 97.8。 0053 实施例二 0054 配制溶剂体系， 其中正己烷 ： 乙酸乙酯 ： 甲醇 ： 水的体积比 1.2 ： 1.2 ： 1 ： 1， 共 1500ml 混溶于分液漏斗中， 摇匀后静置分层， 取上相为固定相， 下相为流动相， 超声脱气后， 先将固定相泵入整个分离柱体， 设定恒温循环器的温度为 20， 然后开启高速逆流色谱仪 主机， 调节主机转速 850r。
22、pm， 流动相以 1.5ml/min 流速泵入分离柱体， 至整个固定相 - 流动 相体系建立动态平衡， 平衡 10min。 0055 计算得平衡时本溶剂体系的保留率 为 80.5（ （V总-V出） /V总100， 其中 V总： 分离柱体管路总体积 (ml)， V出： 平衡过程中流动相推出的固定相体积 (ml)。将 60mg 埃博霉素粗提物样品溶解于 20ml 流动相， 由进样阀进样， 然后根据紫外检测器图谱， 分别收集埃博霉素 A 和埃博霉素 B。 0056 目标产物鉴定 ： 将收集的目标产物经紫外全波段扫描、 液相质谱联用、 核磁共振谱 验证其结构， 并经高效液相色谱 （HPLC） 分析纯度。
23、， 最后可得， 目标产物分别为埃博霉素 A， 纯度 97.5 ； 埃博霉素 B， 纯度 96.8。 0057 实施例三 0058 配制溶剂体系， 其中正己烷 ： 乙酸乙酯 ： 甲醇 ： 水的体积比 1 ： 0.8 ： 0.8 ： 1， 共 1500ml 混溶于分液漏斗中， 摇匀后静置分层， 取上相为固定相， 下相为流动相， 超声脱气后， 先将固定相泵入整个分离柱体， 设定恒温循环器的温度为 20， 然后开启高速逆流色谱仪 主机， 调节主机转速 850rpm， 流动相以 1.5ml/min 流速泵入分离柱体， 至整个固定相 - 流动 相体系建立动态平衡， 平衡 10min。 0059 计算得平衡。
24、时本溶剂体系的保留率 为 82.5（ （V总-V出） /V总100， 其中 V总： 柱体管路总体积 (ml)， V出： 平衡过程中流动相推出的固定相体积 (ml)。将 40mg 埃博霉素粗提物样品溶解于 20ml 流动相， 由进样阀进样， 然后根据紫外检测器图谱， 分别 收集埃博霉素 A 和埃博霉素粗提物 B。 0060 目标产物鉴定 ： 将收集的目标产物经紫外全波段扫描、 液相质谱联用、 核磁共振谱 验证其结构， 并经高效液相色谱 （HPLC） 分析纯度， 最后可得， 目标产物分别为埃博霉素 A， 纯度 96.2 ； 埃博霉素 B， 纯度 97.3。 0061 本发明可以有效避免因固体分离介。
25、质不可逆吸附作用引起的样品损失、 样品组分 说 明 书 CN 103145722 A 6 5/5 页 7 的化学变性 ； 本发明可通过调节溶剂体系的配比关系、 主机转速和流动相流速等工艺条件， 以实现同时或分别分离出高纯度的不同种类的埃博霉素单体组分。 另外可以根据分离目标 产物的需要量， 选用分析型、 半制备型或制备型高速逆流色谱仪 ； 本发明分离纯化过程条件 温和、 分离过程高效便捷、 分离制备量大、 分离度高， 且提纯后获得的目标产物纯度高， 同时 本发明节约溶剂、 适合自动化生产， 具有很高的经济效益。 0062 虽然以上描述了本发明的具体实施方式， 但是熟悉本技术领域的技术人员应当理 解， 我们所描述的具体的实施例只是说明性的， 而不是用于对本发明的范围的限定， 熟悉本 领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化， 都应当涵盖在本发明的 权利要求所保护的范围内。 说 明 书 CN 103145722 A 7 1/3 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103145722 A 8 2/3 页 9 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103145722 A 9 3/3 页 10 图 5 说 明 书 附 图 CN 103145722 A 10 。