一种培养大苞雪莲(S.involucrata)毛状根生产雪莲黄酮类有效 成份的方法 【技术领域】
本发明属于植物生物技术工程领域，具体地说涉及一种大苞雪莲(S.involucrata Kar.et Kir)高产黄酮的毛状根的培养方法，还包括其黄酮的分离、提取、制备工艺方法。
技术背景
雪莲又名雪莲花，是我国二类珍稀保护植物，早在《西北域记》和《相园小识》中，就有关于雪莲的记载，并把二者合而为一，统称雪莲花。作为雪莲花，原生植物名称随产地而别，如西藏等地用三指雪兔子S.tridactyla Sch.Bip.；四川、云南等地的绵头雪兔子S.lanicps Hand.-Mazz.；甘肃、青海等地的水母雪莲S.medusa Maxim；青海也用雪兔子S.gossypiphora D.Don.；新疆用天山雪莲(雪荷花、大苞雪莲)S.involucrataKar.et Kir；等，但均属于菊科凤毛菊属(Saussurea)雪兔子亚属(SubgenEriocorye)植物，且一般分布于海拔3,500～4,000米以上的高山流石滩上。
雪莲是民间常用的一类名贵药用植物。其性温，味微苦，入肝、脾、肾三经，具有散寒除湿，活血通经、强筋助阳、抗炎、镇痛、收缩子宫等功能。民间常用于治疗风湿性关节炎，动脉硬化、延缓衰老、终止妊娠，妇女小腹冷痛、闭经、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、阳萎等症。雪莲原生植物种类较多，虽然据中药文献记载均可同等入药，但其品质有优劣之分。如天山雪莲(又称大苞雪莲)为大体型的雪莲，产量大，质量好；绵头雪兔子(又称绵头雪莲花)也是一种较大体型的雪莲；而水母雪兔子(又称水母雪莲花)和三指雪兔子(又称三指雪莲花)，则为小体型的雪莲。据有关报道，在以上几种雪莲中销售量最大的是新疆雪莲(大苞雪莲)S.involucrata Kar.et Kir.和水母雪莲S.medusa Maxim。
雪莲为多年生草本植物，其自然生长缓慢，无节制地采集野生雪莲入药对野生植物资源具有严重的破坏性，而且还会造成生态环境的恶化。为此，我国早已将雪莲列为国家二级保护植物。黄酮类化合物(高车前素、金合欢素、槲皮素等)是雪莲中所含有的一类重要地药用成分，其产量在野生雪莲中不高。为此，针对目前现状迫切需要解决药用雪莲资源问题。
目前世界上许多国家如美、英、日、韩及我国的学者都曾对药用植物发根培养进行过大量深入的研究。研究表明，毛状根培养系统不仅生长迅速，遗传稳定，能够大量积累次生代谢物质，而且具有单细胞起源性、激素自主性等特点，这是细胞培养和一般器官培养所不能同时达到的。因此，在几乎所有的双子叶植物以及部分单子叶植物中合成的某些次生代谢物，大多数都可以用毛状根来生产，从而为利用发根培养技术生产重要的次级代谢物(如紫杉醇、青蒿素、长春花碱、多胺类物质、黄酮类物质等药物)开辟了新的途径。目前，国内外关于药用植物毛状根诱导的报道有西洋参、绞股蓝、长春花、直立杂种紫杉、野葛、曼佗罗、芜菁等。然而，由于不同发根农杆菌对不同植物的侵染具有种属的特异性，因此有关雪莲毛状根的诱导及培养在国内外尚未见诸报道。
【发明内容】
针对上述存在的药用雪莲资源的破坏和枯竭问题及雪莲毛状根细胞系的诱导及培养的技术难题，本发明的目的在于建立一种大苞雪莲(S.involucrata Kar.et Kir.)毛状根细胞系及毛状根的培养方法，从而利用培养高产黄酮的雪莲毛状根达到产业化生产雪莲黄酮类化合物的目的。该方法具体涉及的步骤如下：
萌发大苞雪莲的无菌种子。取其萌发2~4天苗龄的子叶柄、叶片、胚根的切段，置于诱导丛生苗培养基上进行培养，获得丛生苗；丛生苗置于苗生长培养基，进行单株培养；单株移置于诱根培养基培养，获得下端长有实生根的苗；有实生根苗的外植体切段，置于预培养培养基上暗培养，经发根农杆菌R1601、R1000、LBA9402、A4侵染，其外植体与感染的发根农杆菌于弱光下共培养，诱导发根。诱导出的毛状根接入筛选培养基上再培养，选择抗Km且甘露碱、PCR检测呈阳性的发根根系，切取1~2cm根尖用于液体扩大培养，收获大苞雪莲毛状根培养物，从培养物中提取黄酮类化合物。
完成上述方法步骤使用的培养基和技术条件：诱导丛生苗培养基是：MS+BA(2.0mg/L)+NAA(0.2mg/L)培养基；丛生苗置MS+BA(1.0mg/L)+NAA(0.1mg/L)培养基，进行单株培养；单株移置诱根培养基为MS+IAA(1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L)；10天后即出现4-7条直径为0.5-1.5mm、长0.5-2.0cm的实生根；以在YEB培养基中培养12小时的发根农杆菌(R1601、R1000、LBA9402、A4)为工程菌，侵染在MS(附加1mg/L BA+0.1mg/L NAA)培养基中生长10~15天的再生苗的叶片、茎段和根段及种子萌发产生的子叶、胚轴、胚根外植体。感染后的外植于弱光下共培养2~3天后，用Cef(500mg/L)进行除菌后，弱光下培养诱导发根。14天后在外植体上有毛状根出现，待毛状根长至2~3cm长时，切下置于N6液体培养基(附加500mg/L Cef)中于39℃下，100rpm除菌48hr。切取6~7mm的根尖接入筛选培养基：1/2MS(3％蔗糖+100mg/L Km+0.5mg/L GA3)中，弱光培养。10~12d后，切取1~4cm抗Km且甘露碱、PCR检测显阳性的发根根系的根尖进行液体扩大培养，培养基使用液体N6培养基(朱自清等，中国科学，1975，5：484-490)，一个周期的生长量(鲜重)为接种量的20~30倍。
本发明的另一个目的还在于提供一种从大苞雪莲毛状根培养物中进一步通过干燥、粉碎、有机溶剂分离、提取制备雪莲黄酮类化合物的工艺方法：取大苞雪莲毛状根培养物于空气循环干燥器中，60℃烘干。以粉碎机粉碎成20目的粗粉，用70％乙醇分离、提取、制备大苞雪莲毛状根培养物中的黄酮类化合物；或直接用新鲜的毛状根培养物浸泡于70％酒精中，进行总黄酮类的提取。本方法由毛状根培养物中得到的总黄酮类化合物的含量为毛状根干重的15~18％，总黄酮生产率为2.5~3.5g/L。
我们通过发根农杆菌R1601诱导大苞雪莲得到的毛状根，在25天左右能够增殖10~25倍，干燥毛根中所测的总黄酮含量最高达毛状根干重的18％，比种植雪莲和野生生药的3~5％有显著的提高。因此，通过毛状根诱导及培养技术解决雪莲资源问题是一种有效的途径，可是目前尚未见到关于用毛状根诱导技术培养生产大苞雪莲黄酮类化合物的报道。因此，本发明不仅可以保护有限的野生植物资源免受破坏和维护人类赖以生存的生态环境，而且为走工业化生产大量培养雪莲黄酮类化合物开辟新径。
本发明与已有的栽培技术相比具有如下优点及积极效果：
(1)应用大苞雪莲毛状根大量培养生产雪莲黄酮类化合物与栽培和野生的植物相比，不但可获得好的质量和高的产量，而且不受自然条件的限制和影响。
(2)不需占用耕地面积，只需要占用有限的厂房和培养室。
(3)可以通过人工调节与控制毛状根的生长和次生产物的合成；可极大地提高黄酮类化合物的产量
(4)该项技术，不使用光照，在暗中进行毛状根培养，故可节省电力，减少成本价格。产量与含量稳定，污染率极低，适合工业化生产。
【附图说明】
图1大苞雪莲的种子萌发；
图2大苞雪莲的再生苗；
图3R1601第二次活化生长曲线；
图4发根农杆菌R1601感染雪莲茎段、根段外植体14天后形成的发根；
图5发根农杆菌R1601感染雪莲叶片外植体14天后形成的发根；
图6液体培养的高产系大苞雪莲发状根Hr1；
图7液体培养的高产系大苞雪莲发状根Hr2；
图8大苞雪莲发根中甘露碱纸层析检测：1，Nr(大苞雪莲的正常根)；
2，Leaf(大苞雪莲的叶片)；
3，Hr1(大苞雪莲的毛状根)；4，Hr2(大苞雪莲的毛状根)；5，Mann(甘露碱标准品)。
图9大苞雪莲发根中RolB基因的PCR检测：1，Marker，(GeneRulerTM100bpDNA ladder)；
2，+CK(R1601质粒)；3，-CK(大苞雪莲的叶片)；4，Hr1(大苞雪莲的毛状根)；5，Hr2(大苞雪莲的毛状根)。
具体实施方案
为了更好理解本发明，通过如下实施例予以进一步说明，但并非是对本发明的限定。
实施例中涉及的缩写术语、培养基：
1外植体：大苞雪莲的无菌试管苗新展开叶片、茎段、根段及种子萌发产生的子叶、胚轴、胚根，切开成1.0cm2、0.1cm×1cm的小段。
2发根农杆菌菌种：(1)R1000；(2)R1601；R1601是R1000的人工改造菌株，涉及的改造为：第一、农杆碱型pRiA4质粒的TL-DNA上插入新霉素磷酸转移霉基因(NPT II)，转基因细胞可以用卡那霉素筛选，第二引入高毒力Ti质粒pTiBo542的Vir区域，提高了R1601的感染效率，该菌株由北京大学林忠平教授赠送；(3)LBA9402、由清华大学郭志钢教授惠赠；(4)A4，A4为野生型。以上所述的四种发根农杆菌菌种的出处如下：
LBA9402：《何首乌毛状根培养及其活性成分的产生》王莉、于荣敏等《生物工程学报》，2002，18(1)：；《PRi 9402转化桔梗的研究》王义、张美萍等，《吉林农业大学学报》，1997，19(4)：52-55；
Ri000：；《发根农杆菌对野葛的遗传转化及其影响因素》于树宏、李玲等，《高技术通讯》，2002，03；《长春花转化毛状根诱导及培养条件的优化》孙敏、汪洪等，《西南师范大学学报》2002，27(4)
R1601：《Ri质粒转化牛膝及其发状根的培养》郭凤蕊、唐桂芬等，《河南科学》，1997，15(4)；《发根土壤杆菌对葛属药用植物的遗传转化》刘传飞、于树宏等，《植物学报》，2002，42(9)：936-939；
A4：《不同理化因子对发根农杆菌Ri质粒转化骆驼刺的影响》，步怀宇、景建洲等，《西北植物学报》，2000，20(4)：577-584；《甘草毛状根培养系统的建立及化学成分分析》向德军等，《植物资源与环境学报》2001，10(1)：7-10；《四倍体菘蓝毛状根培养系统的建立及外界因子对其生长的影响》李博华 张汉明等，《中草药》2000，31(2)。
3发根农杆菌培养基：YEB、YMB、LB
4植物基本培养基：MS(Murashige and Skoog，1962)
5抗生素：卡那霉素Km(kanamycin)、头胞霉素Cef(cephamycin)
6激素：BA(Benzyladenine)、GA3(Gibberellic acid)IAA(Indoleaceticacid)，NAA(Naphthaleneacetic acid)IBA(Indolebutyric acid)
7标准品：甘露碱Man(mannopine)
8其他试剂：乙酰丁香酮AS(3，5-methoxy-4-hydroxyacetophenone)、脯氨酸Pro(proline)
9N6培养基(朱自清等，中国科学，1975，5：484-490)
实施例1
1.建立大苞雪莲高频再生体系
1.1种子消毒处理
种子来源：2002年于新疆天山博格达峰采摘的大苞雪莲(S.Involucrata)干品，从花序中剥得种子
清洗：挑选健康饱满，无霉变的种子，自来水冲洗4遍，室温浸泡过夜，流水冲洗1h。
消毒：70％乙醇浸泡30s，0.1％升汞作用20~25min，无菌水清洗4-6次。
无菌种子培养：用无激素MS培养基，3％蔗糖，0.8％琼脂，25℃，光强2000lux，连续光照，3天后种子陆续萌发。(图1大苞雪莲种子萌发生苗)
1.2诱导子叶出丛生苗
外植体处理：挑选发芽3天后子叶展开，色绿的幼苗，于子叶柄、叶片、胚根处切开，子叶上留2mm左右的子叶柄。
丛生苗诱导培养基：MS+BA(2.0mg/L，)+NAA(0.1mg/L，)+3％蔗糖丛生苗诱导：25℃，光强2000lux，24h光照，3~7天后有子叶柄、叶片、根段上有数个直径1mm左右的深绿色突起出现，两周后于突起上长出丛生苗。(图2大苞雪莲的再生苗)。
1.3试管苗的继代培养和诱导生根
苗的挑选：将健壮、高1cm左右的丛生苗分成单株，苗下端带少量愈伤组织。
苗的培养：培养基为MS+BA(1.0mg/L)+NAA(0.1mg/L)，培养条件为25℃，光强2000lux，24h光照，20天继代一次。
抑制玻璃化：提高琼脂浓度到0.9-1.1％；添加活性碳0.2-0.4％。诱根培养：培养基用MS+IAA(0.5mg/L)+NAA(0.5mg/L)，24h光照，10天后雪莲再生苗的下端出现4~7条直径为0.5~1.5mm、长0.5~2.0cm的实生根。
实施例2：建立大苞雪莲转化体系
2.1转化准备实验1-确定发根农杆菌菌种：
农杆菌菌种的确定：用烟草测试农杆碱型发根农杆菌LBA9402，R1601，R1000、A4的感染效果，发现R1601的毒性最强，被其感染的烟草叶片出发根所用时间最短，所诱导的发根有典型的发根形态特征(抗卡那霉素100mg/L，纤细，多根毛、向地性弱，沿瓶壁生长，斜向次生根)，而且已有同科植物青蒿、水母雪莲被R1601以90％的诱导率得到发根，因此我们首选发根农杆菌R1601感染大苞雪莲。
2..3转化准备实验2--确定Km筛选压
丛生苗在附加有一定浓度(50、100、150、200mg/L)Km的保持培养基中培养，4周后所有的苗都表现出黄化和生长受抑制现象，其中卡那霉素150、200mg/l可以在30天内完全杀死大苞雪莲幼苗。所以，确定100mg/l为Km筛选压浓度。
2.4R1601工程菌液的制备
R1601工程菌液的制备：在YEB(Km100mg/l)的保持平板上挑单菌落接种于5ml液体YEB(Km100mg/l)，于恒温摇床上29℃，180r/min培养24h，4℃保存菌液。感染前取100μl保存菌液加入5ml新鲜液体YEB(Km100mg/l)中，培养条件同上，在600nm波长下测定培养一定时间菌液的OD值，做该条件下R1601的生长曲线(图3R1601的生长曲线)，确定第二次活化的R1601菌液达到生长对数期所需的培养时间为9h左右。达对数生长期的R1601二次活化菌液，用液体无激素MS(pH5.8)稀释4~6倍，添加乙酰丁香酮AS(50μmol/l)和脯氨酸Pro(250mg/l)，室温诱导0.5~1h，作为工程菌液备用。
2.5外植体预培养
外植体切段，于MS(3％蔗糖+0.5mg/l BA+2mg/l NAA)上，暗培养2~4天。
2.6感染：
预培养后，外植体切段浸泡于备用的工程菌液3~10min。
2.7共培养：
取出感染后的外植体，用无菌吸水纸吸去多余的菌液，放回原培养基，暗培养1~2天。
2.8除菌：
当共培养的外植体周围出现明显菌斑时，取出外植体，用无菌水清洗4-6次，然后在液体无激素MS(附加500mg/l Cef)培养基中浸泡20~45min，其间轻微摇动。
2.9诱导发根：
外植体除菌后，于1/2MS(30g/l蔗糖+0.5mg/l GA3+500mg/l Cef)上，光照培养3~5天，然后进行弱光培养诱导发根，5~7天更换一次培养基。7~15天后有发根于外植体切口处出现(图4、图5发根农杆菌R1601感染雪莲外植体14天后形成的发根)。
2.10不同发根农杆菌诱导雪莲外植体产生毛状根的频率：通过下列表1和表2予以说明：
表1 4种发根农杆菌对茎段外植体感染的结果
感染
外植体数 外植体生根数
率(％)
对照 40 2.67 6.68
A4 40 0.67 1.68
R1601 40 33 82.5
R1000 40 2 5
LBA9402 40 0.33 0.83
*上述数据均为发根农杆菌开始感染后21天的统计结果，
每个数据重复三次，P＜0.05
表2 R1601对叶片、茎段以及根段外植体感染产生发状根的频率添加乙酰丁香酮AS(50μmol/l)和脯氨酸Pro(250mg/l)菌株 R1601对叶片、茎段以及根段外植体感染产生发状根的频率外植体外植体数外植体生成发 根数 形成的发根(％)对照叶 50 0 0茎 50 3 6根 34 0 0R1601叶 50 37 74茎 50 43 86根 36 35 97.2
实施例3毛状根的筛选
Km筛选：切取已除菌完全的毛状根1.0~2.5cm长的根尖接入筛选培养基1/2MS(3％蔗糖+300mg/l Cef+100mg/l Km)上，弱光培养。10~12d后，切取抗Km根系的1.0-2.5cm根尖进行液体培养。
实施例4毛状根的检测
4.1甘露碱的纸层析检测
因为甘露碱合成酶基因存在于农杆碱型Ri质粒的TR-DNA中，该基因在发根农杆菌中不表达，当TR-DNA整合进植物基因组时，可以利用寄主植物中的RNA聚合酶系转录并表达，从而在植物体中合成特异的甘露碱。如果能够从大苞雪莲毛状根中检测到甘露碱的存在，而对照未受感染的大苞雪莲外植体中不能检测到，就可以证明R1601质粒的TR-DNA整合进了大苞雪莲的基因组内。甘露碱的检测方法，根据Tannaka(Tannakaet.al plant cell reports 1985，4：74~77)的方法稍做改进。
一、材料
样品：继代后扩大培养的大苞雪莲发根(Hr1)；继代后扩大培养的大苞雪莲发根(Hr2)；大苞雪莲的器官根(NR)；大苞雪莲的叶片外植体(Leaf)；
二、试剂
1.提取液：0.1M HCl
2.标准品：甘露碱Man水溶液(1mg/ml)
3.展展层系统：正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶2
4.显色液：
1)0.2％AgNO3丙酮液
2)1％NaOH乙醇液
3)5％硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)水溶液操作
四、检测
1、农杆碱的提取：取0.4g样品加0.4ml0.1N HCl研磨，浸提24hr，12,000rpm，离心5min，取上清液10μl点样
2、层析：
1)滤纸的制备：将层析滤纸裁成8×8(cm×cm)规格，浸泡于0.4MHCl溶液中24h，然后用蒸馏水淋洗，再依次用乙醇、乙醚洗涤后，平放在托盘上，30℃下凉干，备用。
2)样品点样：距边1.5-2cm处划一直线，铅笔标记出等距离的点样点。以毛细管点上5μl样品，边滴加边吹干。
3)层析展开：干燥滤纸垂直置入密闭的已饱和层析罐，待液体上限距上边缘2-4cm时取出。
3、显色：将滤纸吹干后，浸入0.2％AgNO3丙酮液1min，取出风干；然后浸入1％NaOH乙醇液，2～3min；最后5％硫代硫酸钠液固定；观察并摄影(图8大苞雪莲发根中甘露碱纸层析检测)。
4.2RolB基因的PCR检测：
一、材料
样品：继代后扩大培养的大苞雪莲发根(Hr1)；继代后扩大培养的大苞雪莲发根(Hr2)；大苞雪莲的器官根(NR)；大苞雪莲的叶片外植体(Leaf)；R1601菌体。
二、试剂
1.R1601质粒提取试剂：
STE：0.1M NaCl 10MTris·Cl(pH8.0)1mMEDTA(pH8.0)；
Solution I：4mg/ml溶菌酶，50mM葡萄糖，10mM EDTA，25mM Tris·ClpH8.0；
Solution II：3％SDS，0.2mol/LNaOH；
Solution III：5MNaAc 60ml，冰乙酸11.5ml，超纯水28.5ml，pH4.8；TE buffer：1mM EDTA，10mM Tris·Cl pH8.0；
2.雪莲基因组DNA提取试剂：
2×CTAB：2％CTAB，100Mm Tris-HCl pH8.0，1.4M NaCl，20mmEDTApH8.0，室温下放置；
Rnase：使用前，在100℃下处理10min彻底使残留的Dnase失活，用高压灭菌过的超纯水配成200μg/ml，备用。
三、操作
1、R1601质粒的提取：
1)挑取R1601单菌落于10mlYEB培养基中，28℃，180rpm，过夜培养。
2)吸取8ml培养好的菌液，加入10ml离心管中，4,000rpm，离心5min。倾去培养液，加入2ml预冷的STE，重新悬浮细胞。分别吸取1ml菌悬液，加入1.5mlEppendorf管中，12,000rpm离心2min，倾去培养液，获得适量的菌体细胞。
3)加入200μl冰浴过的Solution I，涡旋振荡使细胞均匀分布，室温下放置10min。
4)加入400μl新鲜配置好的Solution II，轻轻颠倒混匀，冰浴5min。
5)加入300μl Solution III，反复颠倒数次，使溶液在粘稠的菌体裂解物中分散均匀，然后置冰上5min；
6)12,000rpm离心10min，小心吸取上清液加入1.5mlEppendorf管中。
7)加入等体积的饱和酚：氯仿，通过剧烈振荡混合有机相和水相，12,000rpm离心5min。
8)小心吸取上清液加入一新的1.5mlEppendorf管中，用等体积的氯仿重新抽提一次；
9)小心吸取上清液加入一新的1.5mlEppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/LnaAC，冰浴30min，12,000rpm，离心10min。倾去上清液，倒置在吸水纸上，使溶液流尽。
10)加入1ml70％乙醇洗涤两次，12,000rpm离心5min，收集沉淀；
11)倾去洗涤液，倒置于吸水纸上吸干残余的溶液，在超净工作台上吹干。
12)加入50μlTE重悬，备用。
2.CTAB法提取大苞雪莲基因组DNA：
1)取280mg经继代培养的大苞雪莲的毛状根在液氮中充分研磨至粉状；
2)用药匙小心转移至1.5mlEppendorff管中，加入65℃预热的600μl 2×CTAB，在65℃下水浴60min，每隔5~10min轻轻振荡一次；
3)取出Eppendorff管冷却至室温，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀后，12,000rpm，离心10min；
4)用一只剪去前端的枪头，小心将上清液移入一只新的Eppendorf管中，并加入两倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，即见到丝状沉淀，-20℃下放置30min，10,000rpm离心5min，得到淡黄色的沉淀；
5)倾去上清液，并用吸水纸吸净残余溶液，加入300μl超纯水重新溶解，在加入600μl-20℃预冷的无水乙醇，沉淀过夜；
6)12,000rpm，离心10min，得到白色的胶状沉淀。倾去上清液，并用吸水纸吸净残余溶液，加入800μl 70％乙醇洗涤沉淀2~3次；
7)吸净残余溶液，置超净工作台中吹干(约需10~15min)；
8)加入40~60μl超纯水，溶解沉淀，加入3μlRnase，室温放置30min后，于-20℃下保存。
3.PCR检测
PCR引物根据Slightom等RiA4baTL-DNA序列分析结果设计Rol B基因的上、下游引物：
Primer1
5’TACTGCAGCAGGCTTCATGCA 3’
Primer 2
2 5’GCTTTCCCGACCAGAGACTG 3
因为RolB基因存在于Ri质粒的TL-DNA中，而且该基因在发根农杆菌感染植物产生毛状根表型中起到关键性作用，如果能够从大苞雪莲毛状根中扩增出862bp的条带，而对照未受感染的大苞雪莲外植体中不能扩出该条带，就可以证明R1601质粒的TL-DNA已经整合在了大苞雪莲的基因组内。
1)PCR反应体系：
PCR反应体系： 单位μl
10×PCRbuffer： 2.5
dNTP 0.5
Primer1 0.5
Primer2 0.5
Model 1
Taq酶 1U
H2O 20
2)PCR反应条件：
1.94℃，预变性，4min；
2.94℃，热变性，1min；55℃，退火，1min；72℃，延伸，1min；35cycles；
3.72℃，延伸，5min。
3)1％琼酯糖电泳，EB染色，紫外光下摄影，结果分析：(图9PCR检测结果)
实施例5大苞雪莲毛状根的培养：
材料：选择抗Km且甘露碱、PCR检测显阳性的发根根系，切下长2.0~4.0cm根尖部分，于液体培养基中，进行扩大培养，初步获得Hr1和Hr2两个高产毛状根系。
培养基：液体N6培养基，如果有菌再生则加入Cef 200~500mg/L。培养条件：30ml培养基分装于100ml三角瓶，弱光或暗培养条件下，于摇床上以50~80rpm振荡培养，25天继代一次。
培养优化：蔗糖30g/L，GA3 0.5~1.5mg/L，IBA 0.1~0.3mg/L，有利于发状根的生长和黄酮类物质的积累，一个周期的发状根生长量(鲜重)为接种量时的15~18倍。液体培养的大苞雪莲发状根如(图6、图7液体培养的高产系大苞雪莲发状根Hr1、Hr2；)所示。
实施例6雪莲毛状根黄酮类化合物的分离提取工艺：
取雪莲毛状根培养物，于空气循环干燥器中，60℃烘干。干粉以粉碎机粉碎成20目的粗粉，用70％乙醇提取。也可以直接用70％酒精浸泡新鲜的毛状根培养物进行提取。本方法由大苞雪莲毛状根培养物中得到的总黄酮类化合物的含量为毛状根干重的15~18％，总黄酮生产率为2.5~3.5g/L。