疟疾红内期灭活全虫疫苗的新用途.pdf

本发明公开了一种疟疾红内期灭活全虫疫苗的新用途，具体为疟疾红内期灭活全虫疫苗作为传播阻断型疫苗的应用。本发明通过将疟原虫红内期免疫血清应用到疟原虫的蚊期传播阶段，发现用于红内期的全虫疫苗表现出一定的阻断蚊期传播效果，扩大了全虫疫苗的使用范围，不仅对免疫个体起到预防和治疗作用，还能够大幅降低疟疾在群体间的传播机会。

1.  疟疾红内期灭活全虫疫苗作为传播阻断型疫苗的应用。

2.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述红内期灭活全虫疫苗是以疟原虫全部虫体成 分作为抗原，辅以佐剂制备的红内期疫苗。

3.  如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述疟原虫为间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟 原虫、卵形疟原虫、约氏疟原虫、伯氏疟原虫、夏氏疟原虫或文氏疟原虫。

4.  如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述红内期灭活全虫疫苗为NSM虫株虫体抗原 的PBS悬液与氢氧化铝佐剂按1:1的体积比混合而成；所述虫体抗原的PBS悬液中虫体抗原 浓度为1×10⁸个/50μL；所述PBS的pH值为7.4，浓度为0.1mol/L。

5.  如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述NSM虫体抗原为用疟原虫NSM虫株感染 鼠后分别于第4天和第9天收集的NSM原虫。

6.  疟疾红内期灭活全虫疫苗在制备预防或治疗疟疾的传播阻断型药物中的应用。

疟疾红内期灭活全虫疫苗的新用途
技术领域
本发明涉及一种疫苗，具体涉及一种预防和治疗疟疾的红内期灭活全虫疫苗的新用途。
背景技术
疟疾是由疟原虫属(Plasmodium)引起的严重危害人类健康的全球性虫媒传染性疾病，与 结核病、艾滋病并称三大传染病。根据疟原虫的种类不同，疟疾分为间日疟、恶性疟、三日 疟和卵形疟。对抗恶性疟疾传统手段主要依靠抗疟药物预防与治疗，并配合杀虫剂和清除蚊 虫孽生地等卫生措施清除传疟蚊媒。但由于疟原虫对抗疟药物以及按蚊对杀虫剂逐渐产生抗 性，疟疾疫苗的研制依然是全球当前研究关注的重点。
目前疟疾疫苗主要分为三类，红前期疟疾疫苗、红内期疟疾疫苗和传播阻断型疫苗。其 中，红前期疫苗主要针对恶性疟原虫子孢子阶段的环子孢子蛋白(circumsporozoiteprotein， CSP)；而红内期疫苗多数都是基于裂殖子表面抗原和/或涉及入侵红细胞过程的抗原。此类抗 原免疫接种有望刺激免疫者产生抗体，并在血液阶段阻断疟原虫入侵新的红细胞和抑制其在 红细胞内的裂体增殖，从而降低临床发病的风险或严重性；与前两种疫苗不同，传播阻断型 疫苗并不能阻止受试者免于感染，而是主要通过阻断疟疾的传播、防止患者将疾病带到非流 行区或者旅行者从疫区将恶性疟疾带回本地区造成流行。该类疫苗以疟原虫配子体或蚊期阶 段的特异分子为靶标，阻断蚊虫体内疟原虫生长，从而阻断传播。例如针对配子母细胞表面 抗原Pfs230和Pfs48/45的疫苗，其抗体可以阻止按蚊中肠内动合子形成。还有一类针对按蚊 中肠抗原的传播阻断疫苗，抑制病原体对蚊胃壁的吸附，限制动合子穿越蚊胃上皮细胞和子 孢子进入唾液腺。
然而通常情况下传播阻断型抗原的免疫原性较弱且活性维持时间较短，部分免疫佐剂也 因安全隐患问题而限制了其应用。虽然痘病毒载体系统和酵母表达系统改善了原核表达传播 阻断抗原的诸多不足，但重组蛋白不能复性至其天然构象，导致产生的抗体对病原体亲和性 偏低。另外，现有的疟疾传播阻断型疫苗也面临诱导抗体水平较低和免疫佐剂引起的不良反 应等问题。更为重要的是，由于传播阻断型疫苗并不能保护被免疫者，因此不易被人群所接 受，从而严重影响了其推广应用。因此，与单纯的“利他型疫苗”相比，既能预防免疫者感 染又能阻断疟疾传播的疫苗或许可以作为疟疾疫苗发展的新方向。
发明内容
本发明的目的在于提供预防和治疗疟疾的红内期灭活全虫疫苗的一种新用途，即将其作 为传播阻断型疫苗应用于疟疾的传播阻断。
本发明采取的技术方案如下：
1、疟疾红内期灭活全虫疫苗作为传播阻断型疫苗的应用。
灭活全虫疫苗是以疟原虫全部虫体成分为抗原，辅以氢氧化铝等佐剂制备的红内期疫苗， 包含了红内期原虫的全部成分(蛋白、核酸以及多糖等)，现有技术中动物实验表明灭活全虫 疫苗能显著降低疟原虫再次感染时的原虫血症，减轻宿主的症状，缩短宿主患病时间。
进一步，所述红内期灭活全虫疫苗是以疟原虫全部虫体成分作为抗原，辅以佐剂制备的 红内期疫苗。
进一步，所述疟原虫为间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、约氏疟原 虫、伯氏疟原虫、夏氏疟原虫或文氏疟原虫。
进一步，所述红内期灭活全虫疫苗为NSM虫株虫体抗原的PBS悬液与氢氧化铝佐剂按 1:1的体积比混合而成；所述虫体抗原的PBS悬液中虫体抗原浓度为1×10⁸个/50μL；所述PBS 的pH值为7.4，浓度为0.1mol/L。
进一步，所述NSM虫体抗原为用疟原虫NSM虫株感染鼠后分别于第4天和第9天收集 的NSM原虫。
常用的全虫疫苗抗原获取仅在单个时间点收集虫体抗原(比如感染后第4天)，然而由于 疟原虫具有很强的逃避宿主免疫的能力，比如var基因不同的修饰和编码顺序使得疟原虫不 断产生新的抗原逃避宿主体内抗体的识别和杀伤。为此，本发明选择在多个时间点进行虫体 抗原收集，以便获取更丰富的抗原类型。需要说明的是，收集原虫的时间不限于虫株感染后 第4和第9天，还可有其它的时间点设置。
2、疟疾红内期灭活全虫疫苗在制备预防或治疗疟疾的传播阻断型药物中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明通过将疟原虫免疫血清应用到疟原虫的蚊期传播阶段， 发现用于红内期的全虫疫苗表现出一定的传播阻断效果，扩大了全虫疫苗的使用范围，不仅 对个体起到预防和治疗，还能够防止疟疾在个体间相互传播。
红前期遗传减毒子孢子疫苗(Genetic attenuated sporozoite，GAS)作为一种多效性疟疾 疫苗既可以保护免疫者抵御子孢子感染，又能保护免疫者免于低剂量的红内期疟原虫感染， 具有良好应用前景和潜在的市场价值。然而，受蚊媒饲养和感染平台以及子孢子来源、纯化 及运输等问题制约，减毒子孢子疫苗在实际推广应用中受到明显限制。
相对而言，红内期疟原虫可以通过体外培养获得，更具有可操作性。本发明研究发现， 红内期全虫疫苗免疫小鼠的血清可以抑制疟原虫在按蚊体内的发育：通过尾静脉将免疫血清 过继至感染疟原虫的小鼠体内，按蚊叮吸上述处理小鼠后，其卵囊数量较对照组减少 45.6～95.9％(表1)；通过纯化免疫血清中特异性IgG抗体和在小鼠体内添加抗CD4+T细胞 抗体拮抗CD4+T细胞功能实验证实，特异性抗体成分是红内期全虫疫苗发挥蚊期传播阻断效 果的主要因素。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1全虫免疫血清在红内期的保护效果图。
具体实施方式
下面以约氏疟原虫NSM虫株为例，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中 未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1灭活全虫疫苗制备
首先复苏液氮中保存的疟原虫NSM虫株，然后将复苏的NSM感染8-10只Balb/c小鼠， 并分别在感染后第4天和第9天收集NSM原虫作为虫体抗原。虫体抗原获取过程主要流程 为：通过心脏取血获取小鼠血液成分，并加入含有肝素的离心管中避免发生凝血；上述血细 胞经pH值为7.4，浓度为0.1mol/L的PBS清洗3次除去肝素后，添加终浓度为0.5％的皂素 以裂解红细胞释放出胞内虫体抗原；上述组分经PBS清洗3次除去血红素后，通过反复冻融 方式使原虫细胞裂解，以获取可供实验用抗原；将按上述操作获得的第4天和第9天抗原分 别以PBS重悬至最终浓度为5×10⁷个/25μL；上述两种抗原各取25μL混合成为含1×10⁸个/50μL 的悬液，此悬液即为最终抗原。
取50μL上述最终抗原与50μL氢氧化铝佐剂混合，注射器反复抽吸使其充分混匀形成 100μL乳液，此即为1只Babl/c小鼠的免疫用量。采用皮下多点注射的方式(50μL/次)免疫 Balb/c小鼠，并于2周和4周后分别做第2次和第3次免疫，最后收集免疫血清-80℃保存， 供后续使用。
实施例2全虫免疫血清对红内期保护效果
复苏液氮中保存的疟原虫虫株NSM，按1×10⁶个原虫/只的用量感染3只实施例1中3次 免疫后的Balb/c小鼠，并以3只正常Babl/c小鼠作对照；间隔24h取尾尖血制作血涂片统计 原虫血症。实验结果见图1，其中M1-M3为对照小鼠，M4-M6为全虫免疫小鼠。由图1可 知，全虫免疫Balb/c小鼠获得对大剂量红内期疟原虫感染的良好保护效果：受免疫小鼠最大 原虫率降低75％以上，原虫清除时间缩短至7天，这是由于全虫疫苗包含了疟原虫红内期的 所有抗原，故能诱导宿主的免疫系统产生更强的免疫反应。
实施例3灭活全虫疫苗阻断蚊期传播
首先用疟原虫感染按蚊：复苏液氮中保存的疟原虫虫株NSM，按1×10⁶个/只的计量感染6 只Balb/c小鼠，4天后血涂片评价疟原虫配子体情况，从中选取配子体情况相当的小鼠供后续 实验应用。
通过过继全虫免疫血清的方式观察灭活全虫疫苗免疫血清在蚊期传播阻断中的作用；通 过Protein-a蛋白亲和层析凝胶分离得到全虫免疫血清中的特异性IgG抗体，通过IgG过继方式 观察特异性抗体在蚊期传播阻断中的作用(表1)；通过往小鼠体内注射抗CD4+T细胞抗体以 拮抗抑制CD4+T细胞产生以干扰素(IFN-γ)为主的炎症因子的方式，观察细胞因子在蚊期传播 阻断中的作用(表2)。
取实施例1中的全虫免疫血清、IgG抗体、对照血清(正常血清)分别按200μL/只的计量 尾静脉注射至配子体情况相当的小鼠中，然后将小鼠固定以供按蚊“血餐”。“血餐”30min后的 按蚊在23℃饲养7天后，解剖蚊胃并统计卵囊数量，实验结果见表1-2。
表1.全虫免疫血清及其IgG成分对蚊期疟原虫发育抑制率

注：a.在按蚊吸血量一定的前提下，过继免疫成分对疟原虫感染抑制率受疟原虫感染基数影响。在自 然条件下，恶性疟原虫在按蚊体内的感染量通常为十几到几十个卵囊。因此我们预期，全虫免疫疫苗对恶 性疟的传播阻断抑制率将达到90％以上。
表2.全虫免疫疫苗中CD4+T细胞对蚊期疟原虫发育的影响

CD4+T细胞主要介导免疫反应中INF-γ等炎症因子的产生，抗体拮抗使CD4+T细胞功能失 活并没有改变全虫免疫血清的蚊传阻断效果。结合表1中结果说明，特异性IgG是全虫疫苗发 挥传播阻断效果的主要因素。
实验表明，全虫免疫血清可以有效的抑制疟原虫在蚊期内的发育：卵囊数量较对照组减 少45.6～95.9％(表1)；通过纯化免疫血清中特异性IgG抗体和在小鼠体内添加抗CD4+T细胞 抗体拮抗CD4+T细胞功能实验证实，特异性抗体成分是红内期全虫疫苗发挥蚊期传播阻断效 果的主要因素，全虫免疫血清可以抑制45.6～95.9％的蚊期疟原虫发育(取决于蚊媒感染情况)。 同时特异性抗体IgG是抑制疟原虫蚊期发育的主要成分。根据疫区环境中蚊媒自然感染疟原虫 呈现感染程度偏低的特点(通常为0～50卵囊/按蚊)，我们预期此传播阻断疫苗具有90％或以 上的阻断蚊期传播效果。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述 优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和 细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。