灵芝酸A在制备防治丙型肝炎病毒药物中的应用
(一)技术领域
本发明涉及天然药物化学及医药技术领域，具体涉及灵芝酸A(ganoderic acid A)在制备治疗或预防丙型肝炎病毒疾病的药物中的应用。
(二)背景技术
灵芝酸A(ganoderic acid A)是从栽培多孔菌科灵芝属真菌赤芝子Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst得到的四环三萜类化合物，该化合物的结构已有报道(详见：李单单,赤芝子实体的化学成分研究,中国化工贸易,2013；5:159-160；陈曼等,赤芝子实体的化学成分研究,时珍国医国药,2009；20(7):1771-1773)。
有报道灵芝三萜酸粗提物对急性肝损伤有一定的保护作用，其机制可能与其抗脂质过氧化作用有关(李鹏,灵芝三萜酸对小鼠急性肝损伤的保护作用,中国医院药学杂志,2013；33(23):1914-1918)；
灵芝三萜对多种肿瘤细胞的生长和转移都有抑制作用(Francisco Leon,et al.Novel Cytostatic Lanostanoid Triterpenes from Ganodermaaustrale.Helvetica Chimica Acta,2003；86(91):3088-3095)；
灵芝三萜对四氯化碳(CCh)所致的小鼠肝损伤有预防和保护作用(李敏,灵芝三萜对小鼠肝损伤的预防和保护作用研究,现代中西医结合杂志,2009；18(32):3933-3934)；
灵芝三萜可明显抑制CC14引起小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的升高，试验结束时，模型组ALT值为9658.5U/L，中、高剂量组分别为5899.2、3773.3U/L；模型组AST值为4962.8U/L，高剂量组为1999.9U/L，并能改善和恢复肝脏组织的病理指标。结论：灵芝三萜对由CC14引起的肝脏损伤有较好的保护作用(黄宗锈,灵芝三萜对化学性肝损伤保护作用研究,预防医学情报杂志2010；26(11):928-930)。
至今未见灵芝中的四环三萜化合物灵芝酸A有抗丙型肝炎病毒作用的相关报道。
灵芝酸A的化学结构如下：
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(三)发明内容
本发明的目的在于提供灵芝酸A的新的医药用途。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供了式(I)所示的灵芝酸A在制备治疗或预防丙型肝炎病毒疾病的药物中的应用。
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本发明还提供了式(I)所示的灵芝酸A在制备抗丙型肝炎病毒的食品或保健品中的应用。
本发明的有益效果在于：
1、本发明发掘了四环三萜类化合物灵芝酸A的新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。
2、经检测，四环三萜类化合物灵芝酸A药理作用强，预示着很好的药用前景。
3、经检测，四环三萜类化合物灵芝酸A具有显著的抗丙型肝炎病毒(HCV)活性，可用于制备抗丙肝病毒的药物，本发明为寻找抗丙型肝炎病毒的药物提供了新的来源。
(四)具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1灵芝酸A抗丙肝病毒试验
1实验药物、试剂及材料
1.1化合物：灵芝酸A。
1.2细胞系Huh7，人肝癌细胞株(详见：Y.M.Tong,Y.Z.Zhu,X.S.Xia et al.Tupaia CD81,SR-BI,Claudin-1,and Occludin Support Hepatitis C Virus Infection,J.Virol,2011,85(6):2793-2802；Z.Jin,P.Gastaminza,G.F.Cheng et al,Robust hepatitis C virus infection in vitro，PNAS,2005,102(26):9294-9299.)；细胞系293T，人胚肾细胞系(详见：Y.M.Tong,Y.Z.Zhu,X.S.Xia et al.Tupaia CD81,SR-BI,Claudin-1,and Occludin Support Hepatitis C Virus Infection,J.Virol,2011,85(6):2793-2802；F.L.Graham,J.Smiley,V.Russell et al,J.Gen.Virol 1977；36:59-74)。
1.3细胞培养液，配制，其含10％胎牛血清、0.03％谷氨酰胺、非必需氨基酸、氨苄青霉素和链霉素100U/ml，调pH至7.4。
1.4.细胞消化液，配制，其含0.25％胰蛋白酶，用磷酸缓冲液配制。
1.5 HCVcc：细胞培养的感染性丙型肝炎病毒(Y.M.Tong,Y.Z.Zhu,X.S.Xia et al.Tupaia CD81,SR-BI,Claudin-1,and Occludin Support Hepatitis C Virus Infection,J.Virol,2011,85(6):2793-2802；Z.Jin,P.Gastaminza,G.F.Cheng et al,Robust hepatitis C virus infection in vitro，PNAS,2005,102(26):9294-9299.)。
1.6 HCVpp：HCV假病毒(Y.M.Tong,Y.Z.Zhu,X.S.Xia et al.Tupaia CD81,SR-BI,Claudin-1,and Occludin Support Hepatitis C Virus Infection,J.Virol,2011,85(6):2793-2802；Z.Jin,P.Gastaminza,G.F.Cheng et al,Robust hepatitis C virus infection in vitro，PNAS,2005,102(26):9294-9299.)。
2实验方法
2.1 HCVcc的制备
2.1.1病毒扩增：
J6、JFH-1嵌合HCVcc(105ffu/ml)，取50感染接种于24孔板的Huh 7细胞，次日换液，随后根据细胞生长密度传代培养，观察细胞生长状态，待病毒快速增殖导致的细胞病变效应(CPE)出现后，收集第7～20天的培养上清，取适量用于病毒滴度测定，其余8000rpm离心5min弃细胞碎片后分装保存于-70℃备用。
2.1.2病毒滴定
以空白Huh7(1×104cells/孔)，12h后，弃培养上清，每孔加入100μL经10倍梯度稀释的HCVcc上清液，共孵育5h，换新鲜DMEM全培养液继续培养72h，行免疫荧光法检测HCV阳性细胞，一抗用1:100稀释的HCV抗体阳性病人血清，二抗为1:100稀释的FITC标记羊抗人IgG。在荧光显微镜下观察发光细胞，并记录最后一个可观察到绿色荧光阳性细胞的孔内绿色荧光阳性细胞数及相应的稀释梯度，计算出focus forming unit/ml(ffu/ml)数值，以此代表HCVcc滴度。
2.2 HCVcc感染性的检测
取处于对数生长期的Huh7细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，取100μL种96孔板；培养24h后加入化合物及HCVcc，化合物按0.0、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0μg/ml浓度稀释，37度培养4小时后去除化合物及HCVcc混液，换培养基继续培养；48h后进行免疫荧光检测，在荧光显微镜下读取各孔HCVcc阳性克隆数。
2.3结果(见表1)
表1灵芝酸A对丙肝病毒(HCVcc)的抑制活性(％)
浓度(μg/ml) 0 0.1 1.0 10.0 50.0 100.0
抑制率(％) 0.00 1.90 23.45 50.55 91.28 98.26
由表2可见，灵芝酸A具有非常显著抑制丙肝病毒(HCVcc)作用，说明该化合物具有抗丙型肝炎病毒作用。
3 HCVpp的制备及感染实验
3.1将处于对数生长期的HEK293T细胞传代接种于24孔板内，置于37℃5％CO2孵箱内培养过夜。
3.2观察细胞生长状况，待细胞50～70％汇合时，进行质粒转染。将脂质体2μl以及小鼠白血病病毒gag质粒、报告基因—荧光素本科或绿色荧光蛋白表达质粒及HCV全长包膜蛋白表达质粒置于50μL opti-MEM培养液中，混匀，室温放置20min.，吸除HEK293T细胞培养上清，加入3000μL opti-MEM培养液，再加入脂质体－质粒混合液，将细胞培养板置于孵箱内培养。6小时后吸除细胞培养上清，加入500μL含10％胎牛血清DMEM培养液，置于孵箱内培养48h，收集细胞培养上清，高速离心去除残余细胞。
3.3将Huh 7.5细胞接种于96孔板内，贴壁后每孔加入50μL含HCVpp的培养上清，6h后换新鲜含10％胎牛血清DMEM培养液，继续培养72h，裂解细胞检测荧光素酶活性或于荧光显微镜下计数绿色荧光阳性细胞个数。
3.4 HCVpp感染性的检测
取处于对数生长期的Huh7细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，取100μL种96孔板；培养24h后加入化合物及HCVpp，化合物按0.0、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0μg/ml浓度稀释，培养4小时去除化合物及HCVpp混液，换培养基继续培养；72h后在荧光显微镜下读取各孔绿色荧光阳性细胞数。
3.5结果(见表2)
表2灵芝酸A对丙肝假病毒(HCVpp)的抑制活性(％)
浓度(μg/ml) 0.0 0.1 1.0 10.0 50.0 100.0
抑制率(％) 0.00 4.83 4.14 37.24 88.28 94.48
由表2可见，灵芝酸A具有显著抑制丙肝假病毒(HCVpp)作用，说明灵芝酸A具有抗丙型肝炎病毒作用。
上述实验结果表明，灵芝酸A具有显著的抗丙型肝炎病毒活性，因此，可用于制备抗丙型肝炎病毒的药物和保肝的药物。
通过体外建立的细胞培养来源的丙型肝炎病毒(HCVcc)及单周期的假病毒颗粒(HCVpp)模型，利用HCV易感细胞人肝癌Huh7细胞系，对四环三萜类化合物灵芝酸A的抗HCV活性进行了体外实验。结果发现，它具有显著的抗HCV活性，尤其能抑制HCV入侵靶细胞。因此，该化合物灵芝酸A可用于制备抗丙肝病毒(HCV)的药物。本发明为寻找抗丙型肝炎病毒药物提供了新的来源。