木聚糖酶颗粒.pdf

本发明提供木聚糖酶颗粒，在蒸汽处理中(然后任选地进行造粒)，其具有比商业化的现有技术水平产品Ronozyme WX(CT)更好的热稳定性。所述颗粒含有Ronozyme WX，并且不含昂贵的纤维素纤维，因而降低了生产成本。

1.  一种包含木聚糖酶的颗粒，所述木聚糖酶具有与SEQ ID NO:1的残基 32-225具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述颗粒不含纤维素纤维。

2.  权利要求1的颗粒，其包含木聚糖酶、颗粒填充剂和粒化粘合剂的均 匀混合物。

3.  前述任一项权利要求的颗粒，其包含核心和涂层，其中所述核心包含 木聚糖酶，而所述涂层包含具有35℃以上的熔点的疏水物质。

4.  前述权利要求的颗粒，其中所述疏水物质是甘油三酯脂肪。

5.  前述权利要求的颗粒，其中所述涂层进一步包含50-80％的无机填充 剂材料。

6.  权利要求1的颗粒，其包含：
a.颗粒核心，其不含木聚糖酶，
b.包围所述核心的均匀的木聚糖酶层，其包含木聚糖酶并构成所述核心 重量的5-20％，和
c.包围所述木聚糖酶层的涂层，其包含至少60％的盐，所述盐在20℃具 有大于81％的恒定湿度，构成所述核心重量的20-100％。

7.  权利要求1的颗粒，其包含
a.核心，其能吸收至少5w/w(基于核心的重量)的水，并且其中木聚糖 酶被吸收于核心内，和
b.涂层，其包含具有35℃以上的熔点的疏水物质，特别是甘油三酯脂肪。

8.  前述权利要求的颗粒，其中所述涂层进一步包含50-80％的无机填充 剂材料。

9.  一种制造饲料组合物的方法，包括如下步骤：
a.将饲料组分与前述任一项权利要求的木聚糖酶颗粒混合，
b.蒸汽处理所述组合物(a)，和
c.任选地将所述组合物(b)进行造粒。

10.  一种制造饲料组合物的方法，包括如下步骤：
a.将饲料组分与木聚糖酶颗粒混合，其中所述木聚糖酶具有与SEQ ID  NO:1的残基32-225至少有90％同一性的氨基酸序列，并且其中所述颗粒是未 施涂层的，
b.蒸汽处理所述组合物(a)，和
c.任选地将所述组合物(b)进行造粒。

11.  一种生产木聚糖酶颗粒的方法，包括将包含木聚糖酶、颗粒填充剂 和粒化粘合剂的混合物与粒化液体转鼓粒化(drum granulating)以形成所述颗 粒，其中所述木聚糖酶具有与SEQ ID NO:1的残基32-225至少有90％同一性 的氨基酸序列，并且其中所述粒化混合物不含纤维素纤维。

12.  前述权利要求的方法，其进一步包括用包含具有30-100℃的熔点的 脂肪或蜡和50-80％的无机填充剂材料的混合物涂覆所述颗粒。

13.  一种生产木聚糖酶颗粒的方法，其包括：
a.将载体加载入流化床，
b.将包含木聚糖酶(和任选的粘合剂)的水溶液喷在载体上，
c.将流化床中的混合物干燥，
d.将盐的水溶液喷到流化床中的材料中，并干燥。

14.  一种生产木聚糖酶颗粒的方法，其包括：
a.使吸收性核心接触液体介质，所述吸收性核心能吸收至少5％w/w(基 于核心的重量)的水，所述液体介质含有溶解和/或分散形式的木聚糖酶，采 用的所述液体介质的量使得所得产物基本没有出现伴随的凝聚，其中所述木 聚糖酶具有与SEQ ID NO:1的残基32-225至少有90％同一性的氨基酸序列；
b.至少部分地从所述所得产物去除液体介质的挥发组分，和
c.将涂层施于所述颗粒。

木聚糖酶颗粒
发明领域
本发明涉及木聚糖酶颗粒和它们在制造动物饲料中的用途，所述制造通过 蒸汽处理，然后任选地进行造粒来进行。其还涉及产生木聚糖酶颗粒的方法。
发明背景
本领域已知晓将木聚糖酶用于动物饲料中，以改进饲料利用。Ronozyme  WX木聚糖酶是一种单组分的动物饲料木聚糖酶，其来源于细毛嗜热霉/疏棉 状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)，并且商业上可从DSM Nutritional  Products,Switzerland得到。这种木聚糖酶及其在动物饲料中的用途的描述在 WO 96/23062中。
动物饲料的蒸汽处理，然后任选地进行造粒，经常用来提高饲料的可消 化性和杀死沙门氏菌属(Salmonella)细菌，如果其存在的话。这通常包括80℃ 以上的蒸汽处理。
Ronozyme WX商业上可作为CT-颗粒(有涂层的热稳定的)得到，其已知 具有优异的热稳定性并能在蒸汽处理过程中存在的高饲料加工温度中存活。 Ronozyme WX(CT)是一种含有纤维素纤维的T-颗粒(如US 4106991中所述产 生)，并且用氢化棕榈油涂覆(如WO 92/12645中所述)。
发明概述
本发明的发明人开发了木聚糖酶颗粒，其在蒸汽处理(然后任选地造粒) 过程中具有热稳定性，这与商业化的现有技术水平产品Ronozyme WX(CT) 相似或更佳。所述颗粒含有Ronozyme WX，且不含纤维素纤维和/或不含涂 层(coating)，因而降低了原材料成本和生产成本。
因此，本发明提供包含木聚糖酶的颗粒，其中所述木聚糖酶具有与 Ronozyme WX有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中所述颗粒不含纤维 素纤维。
本发明还提供用于制造饲料组合的方法，包括如下步骤：
a.将饲料组分与木聚糖酶颗粒混合，
b.蒸汽处理所述组合物(a)，和
c.任选地将所述组合物(b)进行造粒。
其中木聚糖酶具有与Ronozyme WX有至少90％同一性的氨基酸序列，并 且其中颗粒不含纤维素纤维和/或是未涂覆的。
最后，本发明提供了几种生产木聚糖酶颗粒的方法。
发明详述
木聚糖酶
所述木聚糖酶是Ronozyme WX，或具有与Ronozyme WX有至少90％同一 性的氨基酸序列的变体。Ronozyme WX具有如SEQ ID NO:1的残基32-225所 示的成熟序列(其与WO 96/23062中的SEQ ID NO:2相同)。WO 96/23062还公 开了生产和回收Ronozyme WX的方法。Ronozyme WX序列的一些变体的描 述于WO 01/66711。
序列同一性可具体为至少95％、至少98％、或至少99％。两个氨基酸序 列之间的同一性使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970,J. Mol.Biol.48:443-453)如EMBOSS程序包(EMBOSS:The European Molecular  Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)中的 Needle程序(优选5.0.0版或更新版本)中所实施的来确定。使用的参数为缺口 开放罚分(gap open penalty):10，缺口扩展罚分(gap extension penalty):0.5，以 及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)置换矩阵(substitution matrix)。标 记为“最长同一性”(用nobrief选项获得)的Needle的输出作为百分比同一性 来使用，并如下计算：
(相同的残基x 100)/(比对长度–比对中的缺口总数)
木聚糖酶颗粒
木聚糖酶颗粒特别适于蒸汽处理，然后任选地进行造粒。它们不含US 4106991和WO 92/12645中公开的纤维素纤维。避免使用纤维素纤维有助于减 少原材料成本和加工成本。木聚糖酶颗粒能通过许多方法来生产，如转鼓粒 化(drum granulation)(高剪切粒化)、流化床粒化或用在具有高吸收能力的核 心中吸收。颗粒可为涂覆的(coated)或未涂覆的(uncoated)。
颗粒可具有基质(matrix)结构，其中将组分均匀(均一地)混合，或者其可 为分层的颗粒，所述颗粒包含核心(core)和包围核心的一个或多个层。
基质颗粒(matrix granules)
在一个具体的实施方案中，木聚糖酶存在于均匀的(均一的)基质中。包 含木聚糖酶的基质可包含其他辅助组分。
基质颗粒能通过转鼓粒化(混合器粒化)使用粉末混合物和粒化流体来产 生。除木聚糖酶外，粉末混合物和/或粒化流体可包含固体填充剂(载体)、粒化 粘合剂和液体粒化剂。固体填充剂可包括硫酸钠、碳酸钙、石膏(硫酸钙)、其 他无机盐(水溶的或不可溶的)和/或淀粉。粘合剂可包括寡糖如糊精。液体粒化 剂可为水。转鼓粒化通常在高剪切下进行以产生低孔隙度(porosity)的颗粒。
未涂覆的颗粒的合适粒度为20-2000μm，更具体为50-1000μm或 250-1000μm。
惰性核心粒子(inert core particle)：
惰性核心粒子如安慰剂粒子、载体粒子、非活性的核(nuclei)、非活性粒 子、无比的粒子(non-pareil particles)、非活性的粒子或种子，是不包含木聚 糖酶或仅包含小量木聚糖酶的粒子，可将包含木聚糖酶的涂层混合物覆层 (layered)于所述粒子上。它们可用有机或无机材料(如无机盐、糖、糖醇、小 有机分子如有机酸或盐、淀粉、面粉、处理过的面粉、纤维素、多糖、矿物 如粘土或硅酸盐或这些的两种或以上的组合)来配制。
在一个具体的实施方案中，待涂覆的例子是非活性粒子。在一个更具体 的实施方案中，核心粒子的材料选自下组：无机盐、糖醇、小有机分子、淀 粉、面粉、纤维素和矿物。
惰性粒子可通过多种粒化技术来产生，包括：结晶、沉淀、锅涂覆 (pan-coating)、流化床涂覆、流化床团聚(fluid bed agglomeration)、旋转雾化、 挤出(extrusion)、颗粒化(prilling)、滚圆(spheronization)、尺寸减小法(size reduction methods)、转鼓粒化、和/或高剪切粒化。
附加粒化剂
颗粒可包含附加材料如粘合剂、填充剂、纤维材料、稳定剂、增溶剂、 悬浮剂、粘性调节剂、轻球体(light spheres)、增塑剂、盐、润滑剂和芳香剂。
粘合剂
粘合剂可为合成聚合物、蜡、脂肪、发酵液、碳水化合物、盐或多肽。
合适的合成聚合物包括特别是聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯醇 (PVA)，聚乙酸乙烯酯(polyvinyl acetate)，聚丙烯酸酯(polyacrylate)，聚甲基 丙烯酸酯(polymethacrylate)，聚丙烯酰胺(polyacrylamide)，聚磺酸酯 (polysulfonate)，聚羧酸酯(polycarboxylate)，以及它们的共聚物，特别是水溶 性的聚合物或共聚物。
在一个具体的实施方案中，合成聚合物是乙烯基聚合物。
在一个具体的实施方案中，粘合剂是多肽。所述多肽可选自明胶，胶原， 酪蛋白，壳聚糖，聚天冬氨酸和聚谷氨酸(poly glutamatic acid)。在另一个具 体实施方案中，粘合剂是纤维素衍生物如羟丙基纤维素，甲基纤维素或CMC。 合适的粘合剂是碳水化合物粘合剂如蔗糖或糊精，例如Glucidex 21D或 Avedex W80。
填充剂
合适的填充剂是水溶性和/或不可溶的无机盐，如细磨碱金属硫酸盐 (alkali sulfate)，碱金属碳酸盐(alkali carbonate)和/或碱金属氯化物(alkali  chloride)，粘土如高岭土(例如，英语中国粘土(China Clay))， 膨润土，滑石，沸石，白垩，碳酸钙和/或硅酸盐。典型的填充剂是硫酸钠和 木质素磺酸钙。其他填充剂是二氧化硅，石膏，高岭土，滑石和硅酸镁铝。
核心中的吸收
木聚糖酶颗粒可通过以高吸收能力吸收于核心中来产生，如WO 97/39116中所述。
本发明上下文中相关的核心优选地能吸收至少10％w/w(基于核心重量) 的水，更优选至少15％w/w，还更优选至少20％w/w。特别优选的核心是能吸 收至少30％w/w的水的核心，如能吸收至少33％w/w的核心。某些优选的核心 类型具有甚至更高的吸水能力(例如约40％w/w或更多的水)。
本发明上下文中优选的核心类型包括包含淀粉和/或改性淀粉的核心，尤 其是含有总量至少25％w/w(基于核心重量)，如至少50％w/w的淀粉和/或改 性淀粉的核心。
来自很多种植物来源的淀粉(天然存在的淀粉)显示出在本发明上下文中 是合适的(作为淀粉自身，或作为改性淀粉的起点)，而相关的淀粉包括来自 如下的淀粉：木薯[尤其是来自苦木薯(Manihot esculenta)或甜木薯(Manihot  dulcis)]；西米椰子(西米椰子属种(Metroxylon spp.)，如西米椰子(M.sagu))； 马铃薯(马铃薯(Solanum tuberosum))；稻(稻属种(Oryza spp))；玉米(玉蜀黍， 玉蜀黍(Zea mays))；小麦(小麦属种(Triticum spp.))；大麦(大麦属种(Hordeum  spp.)，如H.vulgare)；甘薯(甘薯(Ipomoea batatas))；高粱(高粱属种(Sorghum  spp.))；和山药(薯蓣属种(Dioscorea spp.))。
酶的含量(作为纯酶蛋白计算)典型地在约0.5％-20％的范围内，按含酶颗 粒的重量计。
涂层
颗粒可为未涂覆的/未施涂层的，或者它们可包含一个或多个涂层。
合适的涂层材料是疏水物质和盐。保护性的涂层可进一步包括粘合剂如 前文描述的那些。
涂层的量可构成核心(未涂覆的颗粒)按重量计至少10％、至少20％、至 少30％、或至少40％。所述涂层的量可构成核心(未涂覆的颗粒)按重量计少 于100％、少于80％、或少于60％。
疏水涂层
涂层可含有疏水物质，所述疏水物质具有35℃以上的熔点。所述熔点可 为40℃以上或45℃以上。所述熔点可低于100℃、低于95℃、低于90℃、低 于85℃、低于80℃或低于75℃。
疏水物质具有90°以上的水接触角。疏水物质在水中是不可溶的，但在 有机非极性溶剂中是可溶的。
疏水物质可为甘油三酯脂肪或蜡。甘油三酯脂肪的例子是氢化植物油或 动物油脂如氢化的牛肉(牛)油脂，氢化棕榈油，氢化棉籽油和/或氢化大豆油， 其中碳＝碳双键已完全或部分转化为碳碳单键。
蜡在接近环境温度是塑性的(可塑的)。它们可为天然存在的或合成的。 天然存在的蜡包括动物、植物和矿物蜡。
蜡或脂肪涂层可包含多达80％，优选为60-75％的填充剂，其是干粉或任 何材料，优选为无机材料，更优选为高岭土、硅酸镁或碳酸钙。将指示的填 充剂以指示的量并入涂覆剂，这会减少分开的颗粒相互粘附并粘附于粒化装 置上的趋势。
盐涂层
盐可为水溶性的，具体是在20℃具有100g水中至少0.1克，优选每100g 水至少0.5g，例如每100g水至少1g，例如每100g水至少5g的溶解度。
涂层中的盐在20℃具有81％以上，或85％以上或90％以上的恒定湿度， 或它可为这种盐(例如无水物(anhydrate))的另一种水合物形式。盐涂层可依据 WO 00/01793。
适合的盐的一个具体例子是Na₂SO₄(CH_20℃＝93％)，具体为无水硫酸钠。
涂层中盐的含量按重量计可为至少60％、至少70％、至少80％、至少90％ 或至少95％。
优选地，所述盐是作为盐溶液来施用，例如使用流化床。
饲料颗粒(pellet)的制造
在饲料颗粒的制造中，优选在造粒之前涉及蒸汽处理，一种称为调节 (conditioning)的工艺。在随后的造粒步骤中，将饲料强制通过模具并将所得 的缕(strands)切成不同长度的合适的小粒。在这个调节步骤过程中，加工温 度可升至60-100℃。
饲料混合物(糊状饲料(mash feed))通过将包含饲料木聚糖酶的颗粒与所 需的饲料组分混合而制备。将混合物导入调节器，例如有蒸汽注入的阶式混 合器(cascade mixer)。饲料在调节器中通过注入蒸汽加热到指定温度， 60-100℃，例如60℃、70℃、80℃、90℃或100℃，所述温度在调节器的出 口处测量。停留时间可从数秒变化到数分钟甚至数小时。如5秒、10秒、15 秒、30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。在一 个具体的实施方案中，温度是100℃且停留时间是60秒。
在一个具体的实施方案中，蒸汽处理过程中的加工温度是至少60℃。在 一个更具体的实施方案中，蒸汽处理过程中的加工温度是至少70℃。在一个 甚至更具体的实施方案中，蒸汽处理过程中的加工温度是至少80℃。在一个 最具体的实施方案中，蒸汽处理过程中的加工温度是至少90℃。
饲料从调节器导入压制机(press)，例如Simon Heesen压制机，并压制成 具有不同长度(例如15mm)的颗粒。压制后，将颗粒置于空气冷却器并冷却 一段特定的时间，例如15分钟。
一个具体的实施方案是用于制造饲料组合物的方法，包括以下步骤：
i.将饲料组分与颗粒混合，
ii.蒸汽处理所述组合物(i)，和
iii.任选地将所述组合物(ii)造粒。
动物饲料
颗粒的特征允许其用作动物饲料的组分，其经蒸汽处理和任选地造粒。 一个具体的实施方案是经过蒸汽处理和造粒的包含颗粒的饲料组合物，所述 颗粒包含木聚糖酶。术语“动物”包括所有动物。动物的例子是非反刍动物 和反刍动物。
实施例
实施例1：未涂覆的无纤维素的Ronozyme WX颗粒的制备
具有如下组成的粉末混合物
0.750kg碳酸钙
0.750kg糊精，Avedex W80
12.610kg研磨Na₂SO₄
在混合器FM 50F中与由如下组成的粒化流体进行粒化
0.750kg糊精，Avedex W80
1.400kg Ronozyme WX
1.373kg水
粒化是按美国专利4,106,991，实施例1中所述来实施的。
在流化床干燥器中将颗粒干燥至水含量低于1％，并过筛以获得粒度为 250-1000μm的产物。
实施例2：在涂层混合器中用氢化棕榈油、碳酸钙和高岭土涂覆无纤维 素的Ronozyme WX颗粒
将2,000kg实施例1的颗粒置于5L混合器。
将如下材料涂覆于核心上：
1. 10％熔化的氢化棕榈油
2. 11％碳酸钙
3. 11％高岭土
涂覆如下进行。首先将(未涂覆的T-颗粒的百分比)8％(w/w)的熔化的氢 化棕榈油喷到混合物上，然后添加22％(w/w)的碳酸钙和高岭土1:1混合物。 涂覆流程以用2％氢化棕榈油的最终涂覆结束。
涂覆后，温热的施有涂层的T-颗粒在流化床中用空气在环境温度进行冷 却。在这个工艺过程中，将细料去除。
冷却的含有木聚糖酶的施有涂层的T-颗粒最后通过筛分进行分级，以确 保粒度为300μm-1180μm。
实施例3：用40％盐涂覆的Ronozyme WX MG-颗粒的制备
将4kg筛分为250-500μm的硫酸钠核心加载入有底部喷雾系统的流化床。
在涂覆过程中使用如下床设置：
气流：200m³/小时
入口空气温度：100℃
产品温度：64℃
1.2mm喷嘴：2.8巴(bar)喷嘴压力
用如下的混合物来喷淋硫酸钠核心：
0.37kg Ronozyme WX
0.01kg糊精，Avedex W80
1.4kg水。
涂层后，将颗粒干燥5分钟。
将3kg的颗粒进一步用40％盐涂层进行涂覆(即涂层占到未涂覆核心的 40％)，如WO 2000/001793和WO 2006/034710中所述：
1.2kg研磨硫酸钠
2.8kg水
涂覆后，将颗粒干燥5分钟。
将颗粒过筛以去除任何粒度大于600微米的团块。
实施例4：被吸收到木薯核心并用氢化棕榈油、碳酸钙和高岭土涂覆的 Ronozyme WX。
将10kg的木薯淀粉核心(来自Agro Comercial,Brazil)导入50L混 合器。
用0.96kg的Ronozyme WX和0.637kg的水喷淋核心，如WO 1997/039116 中所述。
将核心转移至流化床并在80℃干燥30min，然后筛至250-1180μm以去除 较大的团块。
将2.000kg的该产物置于5L混合器。
将如下材料涂覆于核心上：
1. 10％熔化的氢化棕榈油
2. 11％碳酸钙
3. 11％高岭土
涂覆如下进行。首先将(未涂覆的T-颗粒的百分比)8％(w/w)的熔化的氢 化棕榈油喷到混合物上，然后添加22％(w/w)的碳酸钙和高岭土1:1混合物。 涂覆流程以用2％氢化棕榈油的最终涂覆结束。
涂覆后，温热的施有涂层的T-颗粒在流化床中用空气在环境温度进行冷 却。在这个工艺过程中，将细料去除。
冷却的含有木聚糖酶的施有涂层的T-颗粒最后通过筛分进行分级，以确 保粒度为250μm-1180μm。
实施例5：造粒稳定性的测量
对实施例1-4的颗粒如下所述进行造粒测试。包括Ronozyme WX(CT)的 商业样品作为基准(参考)。
测试设置：
在小的水平(horizontal)共混器中将约100g的木聚糖酶颗粒与10kg饲料 混合10min。在较大的水平共混器中将这种预混合物与90kg饲料混合10 min。将饲料从共混器以约300kg/小时的速率导入调节器(有蒸汽注入的阶式 混合器)。调节器使用蒸汽注入将饲料加热至95℃(在出口测量)。调节器的保 持时间为约30秒。将饲料从调节器引入装备有3,0x 35mm水平基质 (horizontal matrix)的Simon Hessen压制机，并压制为15毫米长颗粒。压制后， 将颗粒置于空气冷却器并冷却15分钟。
饲料组成
73.8％粉状玉蜀黍
21.7％烤过的豆渣(roasted course soya meal)
4.0％豆油
0.3％Farmix VLSVRK(来自Ke-miske Fabrik,Denmark的维生素 和矿物质的商业混合物)
含湿量：12.0％
通过用造粒的饲料样品活性除以其相应的非造粒的饲料样品活性来确 定相对残余活性。
结果：