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1、(10)申请公布号 CN 103571784 A (43)申请公布日 2014.02.12 CN 103571784 A (21)申请号 201310403064.1 (22)申请日 2013.09.08 CCTCC NO:M 2013229 2013.05.22 C12N 1/21(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 15/74(2006.01) C12N 9/20(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 华中科技大学 地址 430074 湖北省武汉市洪山区珞喻路 1037 号 (72)发明人 闫云君 贾彬 徐莉 张后今 (7。
2、4)专利代理机构 华中科技大学专利中心 42201 代理人 夏惠忠 (54) 发明名称 一种表达生物柴油专用脂肪酶的工程菌及其 发酵工艺 (57) 摘要 本发明提供了一种表达生物柴油专用脂肪 酶的工程菌及其发酵工艺。本发明采用洋葱伯 克霍尔德菌 GJ(B.cenocepacia) 为原始菌， 通 过荧光型启动子探针载体从其中筛选组成型强 启动子 Pcon， 将不含启动子的 T7RNA 聚合酶基 因克隆在启动子 Pcon， 经电转化将二者导入原始 菌中获得宿主菌， 再将脂肪酶基因克隆到通用 载体 pBBR22b 中得脂肪酶表达质粒， 经电转化 将脂肪酶表达质粒导入宿主菌中获得脂肪酶工 程菌Bur。
3、kholderiacenocepaciaMTPF） ， CCTCC NO:M2013229。本发明能大大提高脂肪酶的表达 量， 生产的脂肪酶有较好的催化活力， 低碳醇耐受 性以及耐高温性。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 序列表 3 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 序列表3页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103571784 A CN 103571784 A 1/2 页 2 1. 一种表达生物柴油专用脂肪酶的工程菌， 其特征在于， 它是洋葱伯克霍尔德菌 MTPF(B。
4、urkholderia cenocepacia MTPF)， CCTCC NO ： M2013229。 2. 一种洋葱伯克霍尔德菌 MTPF 组成型强启动子 Pcon， 具有下述之一的核酸序列 ： (1) 序列表中序列 1 所述的核酸序列 ； (2) 与序列为序列表之序列 1 中同源区域的同源性在 80以上的核酸序列 ； (3) 在中度严谨条件下能与序列表中序列 1 的序列杂交的核酸序列。 3. 一种载体， 含有权利要求 2 所述的洋葱伯克霍尔德菌 MTPF 组成型强启动子 Pcon。 4. 一种表达生物柴油专用脂肪酶的工程菌的构建方法， 包括以下步骤 ： (1)将经Bgl II酶切的原始菌(。
5、Burkholderia cenocepacia GJ)基因组DNA片段连入 启动子探针载体 pPScreen 的 BamHI 位点中， 构建启动子文库， 测定文库中所有克隆在激发 光 485nm， 吸收光 510nm 的相对荧光强度和波长 600nm 的光吸收值， 以相对荧光强度与 OD600 的比值作为判断标准， 筛选出组成型强动子 Pcon， 该组成型强动子 Pcon的核酸序列为序列表 中序列 1 所述的核酸序列 ； 或与序列为序列表之序列 1 中同源区域的同源性在 80以上的 核酸序列 ； 或在中度严谨条件下能与序列表中序列 1 的序列杂交的核酸序列 ； (2) 先分别用引物对 PRF。
6、/PRR 扩增启动子 Pcon， 用引物对 T7F/T7R 扩增无启动子的 T7RNA 聚合酶基因， 再用 T7F 和 PRR 作引物， 前两个 PCR 反应的产物做模板， 扩增出受 Pcon 调控的 T7RNA 聚合酶基因， 然后将它们克隆到载体 pUT/mini-Tn5Km 的 NotI 位点中， 最后再 把甲氧苄啶抗性基因克隆到 PstI 位点中， 构建出整合质粒 pTnTpT7 ； (3)通过电转化将整合质粒pTnTpT7导入原始菌， 转化子在20-200ug/ml的甲氧苄啶抗 生素梯度平板上进行初筛， 再将最高浓度平板上的转化子进行荧光定量 PCR 检测， 选取其 中 T7RNA 聚。
7、合酶基因拷贝数最高的转化子做宿主菌 ； (4) 用引物对 LipF/LipR 从原始菌中扩增脂肪酶操纵子， 经 XbaI 和 HindIII 酶切后连 入通用载体pBBR22b相对应的位点中， 获得脂肪酶表达质粒， 该质粒含T7启动子， 负责调控 脂肪酶及其伴侣基因， 脂肪酶表达质粒再经电转化导入步骤 (3) 所构建的宿主菌， 最后再 通过 PCR 验证和初步发酵实验从转化子中筛选出脂肪酶表达量最高的一株作为脂肪酶工 程菌 B.cenocepacia MTPF。 5. 一种表达生物柴油专用脂肪酶的工程菌， 其特征在于菌株 DNA 中有权利要求 2 所述 的组成型强启动子和受该组成型强启动子调控。
8、的 2 个以上拷贝的 T7RNA 聚合酶基因， 以及 脂肪酶表达质粒， 所述的脂肪酶表达质粒含受 T7 启动子调控的脂肪酶及其伴侣基因。 6. 一种脂肪酶发酵工艺， 包括以下步骤 ： 步骤一、 将权利要求1所述的脂肪酶工程菌， 或将按照权利要求4所述方法构建的脂肪 酶工程菌， 在含 50mg/L 氯霉素的 LB 培养基中 28活化培养 10-12 小时 ； 步骤二、 用氨水将生产培养基的 pH 调至 8.59， 再按照 1 ： 33 的比例转接工程菌， 在 28、 摇床转速 250 转 / 分钟的条件下培养 ； 步骤三、 工程菌培养4小时后， 或在发酵液OD600的吸光度值为0.8-1.2时，。
9、 按照2mmol/ L 的浓度添加 IPTG ； 步骤四、 添加 IPTG4 小时后再按照 250mg/L 的浓度加入利福平至发酵液中 ； 步骤五、 继续在28， 转速250转/分钟， pH8.59的条件下连续培养52小时， 再以6000 转 / 分钟离心 10 分钟， 收集含脂肪酶的发酵上清。 权 利 要 求 书 CN 103571784 A 2 2/2 页 3 7. 根据权利要求 5 所述的方法， 其特征在于， 在步骤三中， 添加 IPTG 结束后， IPTG 在发 酵液中的浓度为 2mmol/L。 8. 根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于， 所述的生产培养基的组成为 ： 尿素含氮。
10、量 为 0.15 (M ： V)、 豆饼水解液 4 (V ： V)、 0.5糊精 (M ： V)、 麦芽糖 0.5 (M ： V)、 橄榄油乳 化液 2 (V ： V)、 MgSO47H2O0.05 (M ： V)、 K2HPO40.2 (M ： V)。 权 利 要 求 书 CN 103571784 A 3 1/7 页 4 一种表达生物柴油专用脂肪酶的工程菌及其发酵工艺 技术领域 0001 本发明涉及基因工程技术和发酵优化领域， 特别是涉及脂肪酶工程菌的构建方 法， 以及针对该工程菌的脂肪酶发酵工艺。 背景技术 0002 在能源危机越演越烈的今天， 寻找高效、 清洁的可再生能源是一项极为重要和。
11、迫 切的任务， 而利用废弃动、 植物油脂转化生产生物柴油无疑是最有效、 最直接的办法。目前 生物柴油转化主要有化学法和酶法两种， 其中化学法能耗高、 污染大 ； 酶法则具有反应条件 温和、 无污染等优点， 是解决能源危机的有效途径。 0003 酶法制备生物柴油的工艺中， 脂肪酶成本最高、 容易失活等问题是制约工艺进一 步发展的主要瓶颈， 不同来源脂肪酶制备生物柴油的效率和得率也不同。Jaeger 等人证 明洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶在众多脂肪酶中能够催化的反应类型最多， 反应活性和稳定 性最高， 对酸、 碱、 短链醇等物质的耐受性最高 参见 ： Jaeger KE， Eggert T.Lipase。
12、s for biotechnology.Current Opinion in Biotechnology， 2002， 13(4) ： 390-397。 本实验室也 筛选到一株产脂肪酶的洋葱伯克霍尔德菌 (Burkholderia cenocepacia GJ)， 它产的脂肪 酶耐热、 耐低碳醇， 是生物柴油制备工艺中最理想的催化用酶， 但该菌产酶能力低， 需通过 构建基因工程菌的方法提高其脂肪酶表达量。 0004 构建 B.cenocepacia 脂肪酶工程菌比较困难。该菌脂肪酶的表达和分泌机制非 常复杂， 需在特异分子伴侣的帮助下才能正确折叠， 而正确折叠的脂肪酶还必须经 Sec 转 运系。
13、统和 Dsb 分泌系统等一系列复杂途径才能分泌到菌体外。此外， 该菌脂肪酶及其分子 伴侣基因的 G+C 含量高， 这些情况致使 B.cenocepacia 脂肪酶在现有商业化表达体系中表 达困难。大肠杆菌中由于缺乏 Dsb 分泌蛋白和二硫键异构酶等导致脂肪酶都表达成为包 涵体， 毕赤酵母等真菌表达系统则由于 G+C 含量、 密码子偏好性等问题导致脂肪酶表达往 往没有活性 参见 ： Quyen DT， Giang Le TT， Nguyen TT， et al.High-level heterologous expression and properties of a novel1ipase f。
14、rom Ralstonia sp.M1.Protein Expression and Purification， 2005， 39(1) ： 97-106。因此， 通过基因工程技术直接改造 葱伯克霍尔德菌， 构建脂肪酶工程菌成为该类脂肪酶的首选表达方式， 也即同源表达。当 前， 国内在 B.cenocepacia 脂肪酶同源表达上的研究比较少， 杨江科等曾在 Pseudomonase cepacia 中采用同源表达的方法构建了工程菌， 但该菌缺乏强启动子， 工程菌的脂肪酶活力 仅调高 3.6 倍 参见 ： 杨江科， 郭道义， 闫云君 . 洋葱假单胞菌 G63 脂肪酶基因及其伴侣基 因的克隆和同。
15、源高效表达 . 高技术通讯， 2007， 2 ： 175-179。贾彬等也曾在 B.cepacia G63 中构建了含T7RNA聚合酶的工程菌， 但该方法中由于T7RNA聚合酶基因缺乏强启动子， 且拷 贝数只有一个， 与脂肪酶基因的多拷贝不匹配， 导致该工程菌脂肪酶的表达效果仍然不理 想， 脂肪酶活力仅提高 2.8 倍， 参见 ： 贾彬， 杨江科， 闫云君 . 基于 T7 表达系统的洋葱伯克 霍尔德菌 G63 脂肪酶同源高效表达 . 生物工程学报， 2009， 25(2) ： 215-222。 说 明 书 CN 103571784 A 4 2/7 页 5 发明内容 0005 本发明的任务是提供。
16、一种表达生物柴油专用脂肪酶的工程菌。 0006 本发明的另一个任务是提供这种表达生物柴油专用脂肪酶的工程菌的构建方法。 0007 本发明的又一个任务是提供针对该表达生物柴油专用脂肪酶工程菌的脂肪酶发 酵工艺。 0008 实现本发明的技术方案是 ： 0009 本发明提供的表达生物柴油专用脂肪酶的工程菌， 是洋葱伯克霍尔德菌 MTPF(Burkholderia cenocepacia MTPF)， CCTCC NO ： M2013229。该工程菌于 2013 年 5 月 22 日交中国典型培养物保藏中心保藏。 0010 本发明还提供了一种洋葱伯克霍尔德菌 MTPF 组成型强启动子 Pcon， 该组。
17、成型强启 动子 Pcon具有下述之一的核酸序列 ： (1) 序列表中序列 1 所述的核酸序列 ； (2) 与序列为序 列表之序列 1 中同源区域的同源性在 80以上的核酸序列 ； (3) 在中度严谨条件下能与序 列表中序列 1 的序列杂交的核酸序列。本发明中使用的载体 ( 质粒 ) 含有该洋葱伯克霍尔 德菌 MTPF 组成型强启动子 Pcon。 0011 本发明提供的表达生物柴油专用脂肪酶的工程菌的构建方法是 ： (1) 将经 Bgl II 酶切的原始菌 (Burkholderia cenocepacia GJ) 基因组 DNA 片段连入启动子探针载体 pPScreen 的 BamHI 位点中。
18、， 构建启动子文库， 测定文库中所有克隆在激发光 485nm， 吸收光 510nm 的相对荧光强度和波长 600nm 的光吸收值， 以相对荧光强度与 OD600的比值作为判断 标准， 筛选出组成型强动子 Pcon， 该组成型强动子 Pcon的核酸序列为序列表中序列 1 所述的 核酸序列， 或与序列为序列表之序列 1 中同源区域的同源性在 80以上的核酸序列， 或在 中度严谨条件下能与序列表中序列1的序列杂交的核酸序列 ； (2)先分别用引物对PRF/PRR 扩增启动子 Pcon， 用引物对 T7F/T7R 扩增无启动子的 T7RNA 聚合酶基因， 再用 T7F 和 PRR 作 引物， 前两个 。
19、PCR 反应的产物做模板， 扩增出受 Pcon 调控的 T7RNA 聚合酶基因， 然后将它 们克隆到载体 pUT/mini-Tn5Km 的 NotI 位点中， 最后再把甲氧苄啶抗性基因克隆到 PstI 位点中， 构建出整合质粒 pTnTpT7 ； (3) 通过电转化将整合质粒 pTnTpT7 导入原始菌， 转化 子在 20-200ug/ml 的甲氧苄啶抗生素梯度平板上进行初筛， 再将最高浓度平板上的转化子 进行荧光定量 PCR 检测， 选取其中 T7RNA 聚合酶基因拷贝数最高的转化子做宿主菌 ； (4) 用引物对 LipF/LipR 从原始菌中扩增脂肪酶操纵子， 经 XbaI 和 HindI。
20、II 酶切后连入通用 载体 pBBR22b 相对应的位点中， 获得脂肪酶表达质粒， 该质粒含 T7 启动子， 负责调控脂肪 酶及其伴侣基因， 脂肪酶表达质粒再经电转化导入步骤 (3) 所构建的宿主菌， 最后再通过 PCR 验证和初步发酵实验从转化子中筛选出脂肪酶表达量最高的一株作为脂肪酶工程菌 B.cenocepacia MTPF。 0012 在本发明提供的这种表达生物柴油专用脂肪酶的工程菌的菌株 DNA 中， 有前述的 组成型强动子 Pcon和受该组成型强启动子 Pcon调控的 2 个以上拷贝的 T7RNA 聚合酶基因以 及脂肪酶表达质粒， 所述的脂肪酶表达质粒含受 T7 启动子调控的脂肪酶。
21、及其伴侣基因。 0013 针对本发明提供的表达生物柴油专用脂肪酶工程菌的脂肪酶发酵工艺， 包括以下 步骤 ： 0014 步骤一、 将权利要求1所述的脂肪酶工程菌， 或将按照权利要求4所述方法构建的 脂肪酶工程菌， 在含 50mg/L 氯霉素的 LB 培养基中 28活化培养 10-12 小时 ； 说 明 书 CN 103571784 A 5 3/7 页 6 0015 步骤二、 用氨水将生产培养基的 pH 调至 8.59， 再按照 1 ： 33 的比例转接工程菌， 在 28、 摇床转速 250 转 / 分钟的条件下培养， 所述的生产培养基的组成为 ： 尿素含氮量为 0.15 (M ： V)、 豆饼。
22、水解液 4 IV ： V)、 0.5糊精 (M ： V)、 麦芽糖 0.5 (M ： V)、 橄榄油乳化 液 2 (V ： V)、 MgSO47H2O0.05 (M ： V)、 K2HPO40.2 (M ： V) ； 0016 步骤三、 工程菌培养 4 小时后， 或在发酵液 OD600的吸光度值为 0.8-1.2 时， 按照 2mmol/L 的浓度添加 IPTG， 添加 IPTG 结束后， IPTG 在发酵液中的浓度为 2mmol/L ； 0017 步骤四、 添加 IPTG4 小时后再按照 250mg/L 的浓度加入利福平至发酵液中 ； 0018 步骤五、 继续在 28， 转速 250 转 /。
23、 分钟， pH8.59 的条件下连续培养 52 小时， 再以 6000 转 / 分钟离心 10 分钟， 收集含脂肪酶的发酵上清。 0019 本发明提供了一种脂肪酶工程菌的构建方法， 该方法直接改造产脂肪酶的原始 菌， 在菌体中导入了多拷贝的受组成型强启动子 Pcon调控的 T7RNA 聚合酶基因， 和多拷贝的 受 T7 启动子调控的脂肪酶及其伴侣基因。所构建的工程菌能高效生产耐热、 耐低碳醇的脂 肪酶。此外， 本发明还提供一套针对该工程菌的脂肪酶发酵工艺。采用本发明提供的脂肪 酶工程菌构建方法和发酵工艺能显著提高提高脂肪酶的表达量， 与原始菌相比脂肪酶的表 达量能提高 60 多倍。本发明采用组。
24、成型强启动子、 多拷贝 T7RNA 聚合酶基因和多拷贝脂肪 酶基因及伴侣基因的方法构建工程菌， 完美解决了 B.cenocepacia 脂肪酶工程菌构建困难 的问题。 此外， 针对工程菌开发一套与之相匹配的脂肪酶发酵工艺， 进一步提高了该工程菌 的产脂肪酶能力。 0020 本发明的创新之处在于 ： (1) 筛选出洋葱伯克霍尔德菌的组成型强启动子 Pcon。 (2) 直接对洋葱伯克霍尔德菌进行基因改造。将受组成型启动子 Pcon调控的 T7RNA 聚合酶 以多拷贝的方式整合插入菌体基因组中， 将受 T7 启动子调控的脂肪酶及其伴侣基因以多 拷贝质粒的方式导入菌体， 两者相互匹配。(3) 针对工程。
25、菌 B.cenocepacia MTPF 提供了一 套脂肪酶发酵工艺。(4) 本发明构建的工程 B.cenocepacia MTPF 菌具有较高的表达量， 其 表达的脂肪酶有较好的催化活力， 低碳醇耐受性以及耐高温性， 具有良好工业实用性。 附图说明 0021 图 1 启动子探针载体 pPScreen 的构建流程示意图 ； 0022 图 2 多拷贝整合质粒 pTnTpT7 的构建流程示意图 ； 0023 图 3 脂肪酶表达载体 pBB22PF 的构建流程示意图 ； 0024 图 4 工程菌的生长曲线图 ； 0025 图 5 工程菌的发酵稳定性图 ； 0026 图 6 工程菌发酵脂肪酶的蛋白质电。
26、泳图 ； 0027 图 7 工程菌脂肪酶的热稳定性曲线 ； 0028 图 8 工程菌脂肪酶低碳醇的耐受性。 具体实施方式 0029 实 施 例 1 表 达 生 物 柴 油 专 用 脂 肪 酶 的 工 程 菌 洋 葱 伯 克 霍 尔 德 菌 MTPF(Burkholderia cenocepacia MTPF或写为B.cenocepacia MTPF)的构建和其性能实验 0030 ( 一 ) 组成型强启动子的筛选 说 明 书 CN 103571784 A 6 4/7 页 7 0031 1. 启动子探针载体 pPScreen 的构建， 构建流程参照附图 1 ； 0032 (1) 用限制性内切酶 N。
27、co I 和 Sma I 同时酶切广泛宿主载体 pBBR1Tp， 凝胶纯化回 收大片段 ； 0033 (2) 用 DNA 聚合酶 I 补平回收片段 ； 0034 (3) 用 T4DNA 连接酶将上步补平的片段环化得到质粒 A ； 0035 (4) 用 Pvu I 和 Spe I 双酶切质粒 A 后， 纯化回收大片段 ； 0036 (5)以绿色荧光蛋白载体pEGFP-N为模板， 用引物GFPF和引物GFPR扩增荧光蛋白 基因 ； 0037 (6) 用 Pvu I 和 Spe I 酶切荧光蛋白 PCR 产物后与第 步回收的片段酶连后得 到启动子探针载体 pPScreen。 0038 2. 启动子文。
28、库构建 0039 (1) 用细菌基因组提取试剂盒提制备 B.cenocepacia GJ 基因组 DNA ； 0040 (2) 取 1g GJ 基因组 DNA， 加入 10U Bgl II37酶切 45min， 然后用凝胶回收 300bp-1500bp 部分的片段 ； 0041 (3) 用 BamH I 线性化载体 pPScreen， 再用热敏磷酸酶处理线性化载体， 获得去磷 酸化的载体 pPScreen ； 0042 (4) 用 T4 DNA 连接酶对第 步的回收片段和第 步的去磷酸化载体进行酶 连， 酶连体系中同时加入 2.5U Bgl II。16连接过夜后转化大肠杆菌 ； 0043 (5。
29、) 挑选 20000 个转化子， 将转化子混合接种后提取质粒 ； 0044 (6) 将质粒电转化至 B.cenocepacia GJ 中， 挑选 10000 个阳性转化子。 0045 3. 启动子的筛选 0046 (1) 将 B.cenocepacia GJ 的阳性转化子分别接种于含有 200L LB 培养基的 96 孔板中， 30培养过夜 ； 0047 (2) 先用荧光酶标仪测定每孔的 OD600值， 然后测定各孔的荧光强度。测定条件如 下 ： 激发光长 485nm， 吸收光长 510nm， 间隔 1s ； 0048 (3) 挑选荧光强度 /0D600比值最大的转化子进一步培养后提取质粒 D。
30、NA， 并命名为 pPromoter， 测定质粒中的插入序列 ； 0049 (4) 将上步质粒转入大肠杆菌中， 测定其荧光水平。发现大肠杆菌无任何荧光， 表 明该启动子仅在 B.cenocepacia 中起作用， 将该启动子命名为 Pcon。 0050 ( 二 ) 转座整合质粒的构建 0051 1. 相关基因的克隆 0052 采用 PCR 方法扩增 T7 RNA 聚合酶基因、 脂肪酶基因上游区段 ( 同源重组区段基因 1) 和脂肪酶基因下游区段 ( 同源重组区段基因 2)、 Tmp 抗性基因、 脂肪酶及其伴侣基因。 0053 T7RNA 聚合酶基因的引物 0054 T7F5 ： GGTGCGG。
31、GCAACTATTGCATGAACACGATTAACATCGCT 0055 T7R5 ： CTTGCGGCCGCTACGCGAACGCGAAGTCCGA 0056 TMP 抗性基因的引物 0057 TPF5 ： CTTCTGCAGCACGAACCCAGTTGACATAAG 0058 TPR5 ： CTTCTGCAGTTAGGCCACACGTTCAAG 说 明 书 CN 103571784 A 7 5/7 页 8 0059 启动子引物 0060 PRF5 ： CTTGCGGCCGCGGCGAGCAGTCTTGTATTAC 0061 PRR5 ： CTTGCGGCCGCAATCGTGTTCATGC。
32、AATAGTTGCCCGCACC 0062 以大肠杆菌 BL21(DE3) 基因组 DNA 为模版， 扩增 T7RNA 聚合酶基因。扩增条件 ： 94预变性 4 分钟， 94 1 分钟， 54 1 分钟， 72 3 分钟， 30 个循环， 最后 72延伸 10 分 钟。 以质粒pPromoter为模版， 扩增组成型强启动子。 扩增条件 ： 94预变性4分钟， 9430 秒， 53 30 秒， 72 30 秒， 28 个循环， 最后 72延伸 5 分钟。将两次 PCR 产物等比例混合 后做模板， T7F 和 PRR 做引物扩增出受组成型启动子调控的 T7RNA 聚合酶基因 Pr-T7。 0063。
33、 2. 基因整合载体的构建 0064 用Pst I酶切、 热敏磷酸酶处理转座子载体pUT/mini-Tn5Km， 然后将PCR扩增的甲 氧苄啶抗性基因插入该位点， 得到载体pTnTp。 同样， 用Not I、 热敏磷酸酶处理pTnTp， 再将 经 Not I 酶切的 Pr-T7 插入。最终得到基因整合载体 pTnTpT7。 0065 ( 三 ) 多拷贝 T7RNA 聚合酶基因宿主菌的构建 0066 采用电穿孔法， 将整合载体 pTnTpT7 导入 B.cenocepacia 原始菌。电穿孔的详细 步骤如下 ： 0067 1. 制备 B.cenocepacia 感受态细胞 ： 0068 (1) 。
34、取 7ml 过夜培养的原始菌液接种于 50ml LB 培养基， 30培养至 OD600 0.8 后离心收集菌体 ； 0069 (2) 用 1mM Mgcl2+1mM HEPES 溶液清洗菌体 2 次 ； 0070 (3) 把菌体重悬在 0.8ml 冰冷的 1mM Mgcl2+1mM HEPES 溶液， 放置于冰上。 0071 2. 电穿孔细胞 ： 0072 (1) 取 1g 载体 pTnTpT7 加到 100l 感受态细胞中， 用移液器轻轻地搅拌， 并将 混合物转移至 0.2mm 的电转化杯中 ； 0073 (2) 把电转杯上的水分擦掉后放入插槽， 然后将插槽转入电转化仪 ； 0074 (3)。
35、 选择模式原核生物， 设置参数电压 2400v， 时间 5s 后进行电击。电击后立即 添加 1ml 电转液温浴 2 小时 ； 0075 (4) 取 200-400l 细胞涂布于甲氧苄啶抗性 (25g/m1) 的平板上 28培养至有 菌落长出 ； 0076 (5) 将平板上长出的菌落挑出， 分别转移到甲氧苄啶浓度为 50、 75、 100、 125 和 150g/ml 的平板上， 平板于 28培养至有菌落长出 ； 0077 (6) 将甲氧苄啶浓度为 150g/ml 平板上长出的菌落挑出 ； 0078 (7)用荧光定量PCR法检测挑出菌落中T7RNA聚合酶基因的拷贝数， 选择拷贝数最 高的菌作为宿。
36、主菌。 0079 ( 四 ) 工程菌的构建 0080 1. 脂肪酶表达载体的构建 0081 以 B.cenocepacia 原始菌株 GJ 的基因组 DNA 为模板， 通过 PCR 扩增获得脂肪酶及 其伴侣基因基因。 0082 引物为 ： 0083 上游引物 LipF5 ： AAAGGATCCAGCCAAATCGATGCGTTCCAG 说 明 书 CN 103571784 A 8 6/7 页 9 0084 下游引物 LipR5 ： CTTAAGCTTACGCGGCGACACCCGGGTCA 0085 上游引物加入 Xba I 酶切位点， 下游引物加入 Hind III 酶切位点， PCR 扩增。
37、产物 用 Xba I、 Hind III 同时酶切后克隆到表达载体 pBBR22b 中， 得到 pBB22PF。 0086 2. 表达载体转化宿主菌 0087 取纯化的表达质粒 pBBR22PF1g， 用电穿孔法将质粒转入 ( 三 ) 构架构建的宿主 菌， 转化子用氯霉素抗性进行筛选， 然后用 PCR 验证阳性克隆。 0088 3. 初步发酵选定工程菌 0089 将 PCR 验证的阳性克隆， 分别接种在含 2 (V ： V) 的 LB 培养基中， 在 28， 250 转 / 分钟的条件下培养 48 小时， 再取发酵液直接进行脂肪酶活力测定， 选择活力最高的一株 作为脂肪酶工程菌洋葱伯克霍尔德菌。
38、 MTPF(Burkholderia cenocepacia MTPF)， 并交中国 典型培养物保藏中心保藏， 保藏号为 CCTCC N0 ： M2013229。 0090 4.脂肪酶工程菌洋葱伯克霍尔德菌MTPF(Burkholderia cenocepacia MTPF)稳定 0091 性检验 0092 图4为重组菌的生长曲线， 在30下重组菌在LB培养基中生物的代时(G)为30.3 分钟 ； 从延滞期到稳定期的时间约为 9 小时。图 5 为该工程菌的质粒稳定性曲线， 重组工程 菌在无选择性压力的条件下经过 10 次连续转接培养 ( 每次转接间隔 9 小时 ) 后， 质粒保持 率为 82.。
39、6。可见， 该工程菌能够耐受连续转接放大培养， 适于规模化生产。 0093 ( 五 ) 脂肪酶工程菌洋葱伯克霍尔德菌 MTPF(Burkholderia cenocepacia MTPF) 的发酵工艺优化 0094 将活化后的工程菌接种到培养基中摇瓶发酵， 测定工程菌的发酵酶活力。以水解 橄榄油每分钟产生1mol游离脂肪酸所需的酶定义为一个活力单位(U)。 测定采用碱式滴 定法测定发酵酶活力。 0095 1. 产酶培养基碳源优化 0096 改变初始产酶培养基中碳源的种类， 分别以 0.5 (M ： V) 和 1 (M ： V) 的葡萄糖、 可溶性淀粉、 蔗糖、 麦芽糖和糊精作为碳源进行最适碳源。
40、的筛选。结果显示 5 种碳源中， 0.5 (M ： V) 糊精的酶活最高， 故选糊精为发酵最适碳源。 0097 2. 产酶培养基氮源优化 0098 以0.5(M ： V)的糊精作为碳源， 分别以3的蛋白胨、 牛肉膏、 豆饼粉、 玉米浆、 酵 母膏和含氮量为 0.3 (M ： V) 的 NH4Cl、 NH4NO3、 (NH4)2HPO4、 尿素、 NaNO3、 草酸铵作为氮源进 行最适氮源的筛选。 结果说明豆饼粉和尿素的效果较好， 故选豆饼粉和尿素作为复合氮源。 0099 3.Plackett-Burman 设计筛选影响产酶的主效因子 0100 根据已选择的碳源和氮源并结合发酵温度、 摇床转速和。
41、装液量， 对洋葱伯克霍尔 德菌摇瓶发酵产脂肪酶的培养基、 起始 pH 和接种量等 8 个因子进行全面考察。每个因子取 高 (+1) 低 (-1) 两个水平， 选用 N 8 的 Plackett-Burman 试验设计， 响应值为发酵液中脂 肪酶的活性。最终证实尿素浓度、 初始 pH 值和接种量为影响工程菌产酶量的主要因素。 0101 4. 响应面分析优化产酶主效因子 0102 采用 Box-Behnken 试验设计确定显著因子的最优水平， 设计试验。由 SAS9.0 软件 拟合得到多元回归模型为 ： 0103 Y2 47.39439-1.550085X4-1.895614X6-4.103274。
42、X3-8.809449X4X4-0 说 明 书 CN 103571784 A 9 7/7 页 10 .034107X4X6-2.517549X4X8-6.260359X6X6-0.678724X6X8-2.293715X8 X8 0104 该方程的决定系数 R2 值为 98.39， 说明该模型与实际拟合良好， 可以用于脂肪 酶发酵的分析和预测。 方程Y2的最大估计值为69.310030.833873U/ml， 此时三个因子最 优实验点为尿素含氮量为 0.15 (M ： V)， 初始 pH 值为 8.59， 接种量为 3.05时， 该模型预 测的酶活最高。 0105 最后， 经优化后的生产培养基。
43、组成为 ： 尿素含氮量为 0.15 (M ： V)， 豆饼水 解液 4 (V ： V)， 0.5糊精 (M ： V)， 麦芽糖 0.5 (M ： V)， 橄榄油乳化液 2 (V ： V)、 MgSO47H2O0.05 (M ： V)、 K2HPO40.2 (M ： V)， 初始 pH 值为 8.59， 实际发酵酶活为 70.88U/ ml。 0106 ( 六 ) 脂肪酶工程菌洋葱伯克霍尔德菌 MTPF(Burkholderia cenocepacia MTPF) 脂肪酶的低碳醇耐受性以及耐高温性 0107 1. 该工程菌脂肪酶的耐高温性实验 0108 将工程菌发酵的脂肪酶 30 -80范围内，。
44、 分别温浴 4 小时， 再测定其水解活力。 如附图 7 所示， 工程菌脂肪酶在 65以下均十分稳定， 保温 4 小时后基本保留 80以上的 酶活力， 但超过70酶失活速度加快， 80保温4小时酶活力基本丧失。 表明工程菌脂肪酶 有较好的耐高温性。 0109 2. 该工程菌脂肪酶的低碳醇耐受性实验 0110 将该工程菌发酵的脂肪酶与等体积的低碳醇混合， 室温放置 24 小时后测定酶活 力， 将脂肪酶残留酶活力与原始酶活力的比值作为醇耐受性的标准。 测定结果见附图8。 工 程菌经乙醇、 丙醇和异丙醇处理 24 小时后脂肪酶活力完全没有影响， 而甲醇和叔丁醇处理 后仍保留 96左右的酶活力， 表明该。
45、工程菌脂肪酶具有良好的低碳醇耐受性。 说 明 书 CN 103571784 A 10 1/3 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 103571784 A 11 2/3 页 12 0003 序 列 表 CN 103571784 A 12 3/3 页 13 序 列 表 CN 103571784 A 13 1/5 页 14 图 1 说 明 书 附 图 CN 103571784 A 14 2/5 页 15 图 2 说 明 书 附 图 CN 103571784 A 15 3/5 页 16 图 3 说 明 书 附 图 CN 103571784 A 16 4/5 页 17 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103571784 A 17 5/5 页 18 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103571784 A 18 。