化学制剂和生防微生物联合防控连作番茄青枯病.pdf

摘要
申请专利号：	CN201710568541.8	申请日：	20170713
公开号：	CN107365723A	公开日：	20171121
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	C12N1/20,C05F11/08,C05G3/00,C12R1/07	主分类号：	C12N1/20,C05F11/08,C05G3/00,C12R1/07
申请人：	南京农业大学
发明人：	沈标,苏律,杨兴明,邱鹏飞,沈其荣
地址：	211225 江苏省南京市溧水区白马镇国家农业科技园南京农业大学基地
优先权：	CN201710568541A
专利代理机构：	南京天华专利代理有限责任公司	代理人：	徐冬涛;李晓峰
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内容摘要

本发明公开了化学制剂和生防微生物联合防控连作番茄青枯病，本发明分离到了对番茄青枯病病原菌有显著拮抗作用的一株拮抗菌(芽孢杆菌B8)，该菌株B8属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliqueBaciens)，于2017年4月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.14042。利用该拮抗菌生产液体菌剂及微生物有机肥料，液体菌剂中拮抗菌数量大于109/ml，微生物肥料中拮抗菌数量大于5.0×107个/g。连作番茄土壤中联合使用拮抗菌液体菌剂、含有拮抗菌的微生物有机肥和0.3％(W/V)亚磷酸钾溶液处理，对番茄青枯病的防治率高达70％以上。

权利要求书

1.一株用于防控番茄青枯病的拮抗菌B8，该菌株B8属于解淀粉芽孢杆菌(BacillusamyloliqueBaciens)，于2017年4月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.14042。 2.权利要求1所述的拮抗菌B8在制备用于防控番茄青枯病的生防制剂中的应用。 3.采用权利要求1所述的拮抗菌B8生产的用于防控番茄青枯病的生防制剂。 4.权利要求1所述的拮抗菌B8在防控番茄青枯病中的应用。 5.权利要求1所述的拮抗菌B8在联合化学制剂亚磷酸钾防控番茄青枯病中的应用。 6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：(1)采用权利要求1所述的拮抗菌B8分别制备B8液体菌剂和B8微生物有机肥；(2)将步骤(1)制备的B8液体菌剂和浓度为10％～30％的淀粉溶液按照1:1的体积比混合制成混合液；(3)将番茄苗用步骤(2)制备的混合液蘸根，使拮抗菌B8细胞粘附在番茄苗根部；(4)根部粘附有拮抗菌B8细胞的番茄苗移栽时，将步骤(1)制备的B8微生物有机肥施用在番茄苗根部，最后在每株番茄苗的根部灌浇浓度为0.2％～0.4％的亚磷酸钾溶液。 7.一种高效防控连作番茄青枯病的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)采用权利要求1所述的拮抗菌B8分别制备B8液体菌剂和B8微生物有机肥；(2)将步骤(1)制备的B8液体菌剂和浓度为10％～30％的淀粉溶液按照1:1的体积比混合制成混合液；(3)将番茄苗用步骤(2)制备的混合液蘸根，使拮抗菌B8细胞粘附在番茄苗根部；(4)根部粘附有拮抗菌B8细胞的番茄苗移栽时，将步骤(1)制备的B8微生物有机肥施用在番茄苗根部，最后在每株番茄苗的根部灌浇浓度为0.2％～0.4％的亚磷酸钾溶液。 8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述淀粉溶液的浓度为20％；步骤(4)中所述亚磷酸钾溶液的浓度为0.3％。 9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述B8微生物有机肥的施用量为40～60g/棵；所述亚磷酸钾溶液的灌浇量为40～60ml/棵。 10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(1)中采用权利要求1所述的拮抗菌B8制备的B8液体菌剂中孢子和细胞的数量达到10/ml数量级；步骤(1)中采用权利要求1所述的拮抗菌B8制备的B8微生物有机肥中含有5×10个/g以上的拮抗菌B8的孢子。

说明书

技术领域

本发明涉及使用化学药剂、拮抗菌菌剂及微生物有机肥联合防控番茄青枯病，属于植物土传病害的综合防治领域。

背景技术

番茄青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种土传病害，发病率通常在20％-30％，连作时尤为严重，有时发病率高达70-80％，甚至绝收。目前，还没有有效的化学农药防治番茄青枯病，迫切需要开发防控番茄青枯病的新技术。我们发现亚磷酸钾(KH2PO3),既可作为磷钾肥，一定浓度下又具有抑制病原菌-青枯劳尔氏菌生长的能力，亚磷酸钾和拮抗菌株F8对青枯病的抑制具有协同作用，亚磷酸钾和拮抗菌株F8液体菌剂及微生物有机肥联合使用，可以显著提高防控番茄青枯病的效果，也符合绿色农业的需求。

发明内容

本发明的目的在于研制一种利用化学抑菌剂亚磷酸钾、拮抗菌液体菌剂及微生物有机肥料防控番茄青枯病的综合技术，其综合防治效率达到60-80％，为集约化番茄种植业的持续发展提供技术。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一株用于防治番茄青枯病的拮抗菌B8，属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，于2017年4月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.14042。主要生物学特性为：B8在LB培养基上生长时，菌落呈灰色，圆形，开始时菌落表明光滑，后期菌落表面有皱褶。B8的细胞为杆状，生长后期细胞内形成球形的芽孢。拮抗菌B8菌株具有发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖产酸的能力，能水解淀粉和液化明胶。

上述的拮抗菌B8在制备用于防控番茄青枯病的生防制剂中的应用。

采用上述的拮抗菌B8生产的用于防控番茄青枯病的生防制剂。

上述的拮抗菌B8在防控番茄青枯病中的应用。

上述的拮抗菌B8在联合化学制剂亚磷酸钾防控番茄青枯病中的应用。

上述的应用，包括以下步骤：(1)采用上述的拮抗菌B8分别制备B8液体菌剂和B8微生物有机肥；(2)将步骤(1)制备的B8液体菌剂和浓度为10％～30％(W/V,10～30g/100ml)的淀粉溶液按照1:1的体积比混合制成混合液；(3)将番茄苗用步骤(2)制备的混合液蘸根，使拮抗菌B8细胞粘附在番茄苗根部；(4)根部粘附有拮抗菌B8细胞的番茄苗移栽时，将步骤(1)制备的B8微生物有机肥施用在番茄苗根部，最后在每株番茄苗的根部灌浇浓度为0.2％～0.4％(W/V,0.2～0.4g/100ml)的亚磷酸钾溶液。

一种高效防控连作番茄青枯病的方法，包括以下步骤：

(1)采用上述的拮抗菌B8分别制备B8液体菌剂和B8微生物有机肥；

(2)将步骤(1)制备的B8液体菌剂和浓度为10％～30％(W/V,10～30g/100ml)的淀粉溶液按照1:1的体积比混合制成混合液；

(3)将番茄苗用步骤(2)制备的混合液蘸根，使拮抗菌B8细胞粘附在番茄苗根部；

(4)根部粘附有拮抗菌B8细胞的番茄苗移栽时，将步骤(1)制备的B8微生物有机肥施用在番茄苗根部，最后在每株番茄苗的根部灌浇浓度为0.2％～0.4％(W/V,0.2～0.4g/100ml)的亚磷酸钾溶液。

上述的方法，其步骤(2)中所述淀粉溶液的浓度为20％；步骤(4)中所述亚磷酸钾溶液的浓度为0.3％。

上述的方法，其步骤(4)中所述B8微生物有机肥的施用量为40～60g/棵；所述亚磷酸钾溶液的灌浇量为40～60ml/棵。

上述的方法，其步骤(1)中采用上述的拮抗菌B8制备的B8液体菌剂中孢子和细胞的数量达到109/ml数量级；步骤(1)中采用上述的拮抗菌B8制备的B8微生物有机肥中含有5×107个/g以上的拮抗菌F8的孢子。

本发明步骤(1)中用拮抗菌菌株B8生产B8液体菌剂和B8微生物有机肥料的具体生产方法可以参见专利ZL2012 1 0326641.7，但不限于此，也可以采用本领域技术人员公知的其他方法生产。

上述方法中所用的亚磷酸钾为工业级，使用浓度为0.2％～0.4％,优选为0.3％(W/V)。本发明实验显示0.3％的亚磷酸钾(KH2PO3)显著抑制病原菌-青枯劳尔氏菌的生长(见图2)，而对生防菌株B8没有影响。

生防菌株B8的液体菌剂、微生物有机肥料和亚磷酸钾的联合使用的最优选方法：将B8液体菌剂和20％(W/V)的淀粉溶液按照1:1(V/V)的比例混合，用于番茄苗蘸根，使B8细胞粘附在番茄苗根部。B8微生物有机肥采用穴施，按照每棵苗50g的使用量将微生物有机肥撒在番茄苗根部，再覆土，最后在每株番茄苗根部灌浇0.3％(W/V)亚磷酸钾溶液50ml。

本发明的有益效果：

本发明筛选的拮抗菌菌株B8对番茄青枯病具有显著的防控效果，采用该菌株B8制备的生防制剂对番茄青枯病的生物防治显著，盆栽试验和田间试验的结果表明，连作番茄青枯病的土壤中综合施用B8液体菌剂、B8微生物有机肥料和亚磷酸钾后，番茄青枯病的生物防治率高达70％以上，表明联合处理具有显著的协同增效作用，可显著提高对番茄青枯病的防治效果。

附图说明

图1为拮抗菌菌株B8对番茄青枯病病原菌(R.solanacearum)的抑制作用(显示抑菌圈)

图2为0.3％亚磷酸钾对番茄青枯病病原菌(R.solanacearum)的抑制作用(显示抑菌圈)

图3为联合处理对防治番茄青枯病的效果

具体实施方式

(一)菌株的分离和鉴定

从番茄植株根际土壤中采用平板稀释法分离细菌，然后以番茄青枯病病原菌-青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)为指示菌采用对峙法筛选拮抗放线菌，根据生长速度、拮抗能力最终筛选出高效拮抗菌株B8，经过形态特征、生理生化特性以及16S rRNA基因序列将菌株B8鉴定为解淀粉芽孢杆菌。

该菌株B8于2017年4月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.14042。主要生物学特性为：F8在LB培养基上生长时，菌落呈灰色，圆形，开始时菌落表明光滑，后期菌落表面有皱褶。B8的细胞为杆状，生长后期细胞内形成球形的芽孢。拮抗菌B8菌株具有发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖产酸的能力，能水解淀粉和液化明胶。

该拮抗菌菌株B8对番茄青枯病病原菌(R.solanacearum)的抑制作用如图1所示。

(二)菌株B8液体菌剂及微生物有机肥的生产

生产方法参见专利ZL2012 1 0326641.7。

1)B8液体菌剂的制备：将菌株B8接种到PDA培养液中进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH范围为7.0-7.2，培养温度30℃，170转/分钟，发酵48h后形成芽孢，获得B8液体菌剂，其中的含菌或芽孢量≥5×109个/ml；

所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。

2)B8微生物有机肥的制备：以腐熟的猪粪堆肥和氨基酸有机肥(江苏新天地氨基酸肥料有限公司产品，登记证号：苏农肥(2008)准字0180号，肥料规格：N+P2O5+K2O≥6％，有机质≥30％，氨基酸≥5％)以体积比6：4混合制成。所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98％以上，有机质质量比含量≥35％，有机氮质量比含量为1.2-2％，含水量25-30％。

将步骤1)制备的B8液体菌剂按20％(V/W，20ml/100g)的比例接种到步骤2)所述的有机肥中进行二次固体发酵，发酵温度为30-50℃，发酵过程中每天翻堆1次，发酵发酵周期5-7天，使拮抗菌含量达到2.0×109个/g以上，获得拮抗菌B8的固体菌剂。最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，获得防治番茄青枯病的F8微生物有机肥，该肥料中含有≥2.0×109个/g的拮抗菌B8、全氮含量为30.9g.kg-1，全磷含量为12.0g.kg-1、全钾含量为20.9g.kg-1。

(三)温室盆栽试验

供试番茄品种为“合作918”,由上海长种番茄种业有限公司出品。育苗4～5片真叶后移栽到装有5kg土壤的盆钵中。设置4个处理：

1)CK；

2)B8液体菌剂+B8微生物有机肥+0.3％亚磷酸钾处理

3)B8液体菌剂+F8微生物有机肥：将B8液体菌剂和20％(W/V)的淀粉溶液按照1:1(V/V)的比例混合，用于番茄苗蘸根，使菌株B8细胞粘附在番茄苗根部。微生物有机肥采用穴施，按照每棵苗50g的使用量将微生物有机肥撒在番茄苗根部，再覆土。

4)0.3％亚磷酸钾处理：CK处理用氮、磷、钾肥补齐养分，在每株番茄苗根部灌浇0.3％(W/V)亚磷酸钾溶液50ml。

每种处理设三个区组，每个区组十五个重复。土壤中接种病原菌，含量为8.5×106个/g土。B8液体菌剂+B8微生物有机肥+0.3％亚磷酸钾综合处理的过程为：将B8液体菌剂和20％(W/V)的淀粉溶液按照1:1(V/V)的比例混合，用于番茄苗蘸根，使菌株B8细胞粘附在番茄苗根部。微生物有机肥采用穴施，按照每棵苗50g的使用量将微生物有机肥撒在番茄苗根部，再覆土，最后在每株番茄苗根部灌浇0.3％(W/V)亚磷酸钾溶液50ml(0.3％亚磷酸钾对番茄青枯病病原菌(R.solanacearum)的抑制作用见图2)。CK处理用氮、磷、钾肥补齐养分。

番茄生长20天后每天调查青枯病发生情况，计算病情指数和防治效果：

病情指数＝∑(各级病株数×相应级数)/调查总植株数×100；

防治效果＝(对照区病情指数—处理区病情指数)/对照区病情指数×100；

病害严重度分级标准：0级：无病状；Ⅰ级：1/4叶片发病；Ⅱ级：1/2叶片发病；Ⅲ级：整株死亡。

结果显示，单独使用0.3％亚磷酸钾对番茄青枯病的防治效果为40.6％，使用B8液体菌剂和B8微生物有机肥对番茄青枯病的防治效果为51.1％，而联合施用B8液体菌剂、B8微生物有机肥和亚磷酸钾的综合处理对番茄青枯病的防治效果达到76.2％(表1),表明联合处理具有协同作用，可显著提高对番茄青枯病的防治效果(图3)。

表1 联合处理对防治番茄青枯病的效果

处理病情指数(％) 防治效果(％) CK 90.6 — 综合处理 21.5 76.2 比较例1(B8液体菌剂+B8微生物有机肥) 44.3 51.1 比较例2(0.3％亚磷酸钾处理) 53.8 40.6

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710568541.8 (22)申请日 2017.07.13 (83)生物保藏信息 CGMCC NO.14042 2017.04.17 (71)申请人南京农业大学地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇国家农业科技园南京农业大学基地 (72)发明人沈标苏律杨兴明邱鹏飞沈其荣 (74)专利代理机构南京天华专利代理有限责任公司 32218 代理人徐冬涛李晓峰 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C05F 11/08(2006.01)。

2、 C05G 3/00(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称化学制剂和生防微生物联合防控连作番茄青枯病 (57)摘要本发明公开了化学制剂和生防微生物联合防控连作番茄青枯病，本发明分离到了对番茄青枯病病原菌有显著拮抗作用的一株拮抗菌(芽孢杆菌B8 )，该菌株B8 属于解淀粉芽孢杆菌 (BacillusamyloliqueBaciens)，于2017年4月 17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.14042。利用该拮抗菌生产液体菌剂及微生物有机肥料，液体菌剂中拮抗菌数量大于109/ml，微生物。

3、肥料中拮抗菌数量大于5.0107个/g。连作番茄土壤中联合使用拮抗菌液体菌剂、含有拮抗菌的微生物有机肥和0.3(W/V)亚磷酸钾溶液处理，对番茄青枯病的防治率高达70以上。权利要求书1页说明书4页附图2页 CN 107365723 A 2017.11.21 CN 107365723 A 1.一株用于防控番茄青枯病的拮抗菌B8，该菌株B8属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliqueBaciens)，于2017年4月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.14042。 2.权利要求1所述的拮抗菌B8在制备用于防。

4、控番茄青枯病的生防制剂中的应用。 3.采用权利要求1所述的拮抗菌B8生产的用于防控番茄青枯病的生防制剂。 4.权利要求1所述的拮抗菌B8在防控番茄青枯病中的应用。 5.权利要求1所述的拮抗菌B8在联合化学制剂亚磷酸钾防控番茄青枯病中的应用。 6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：包括以下步骤： (1)采用权利要求1所述的拮抗菌B8分别制备B8液体菌剂和B8微生物有机肥； (2)将步骤(1)制备的B8液体菌剂和浓度为1030的淀粉溶液按照1:1的体积比混合制成混合液； (3)将番茄苗用步骤(2)制备的混合液蘸根，使拮抗菌B8细胞粘附在番茄苗根部； (4)根部粘附有拮抗菌B8细胞的番茄。

5、苗移栽时，将步骤(1)制备的B8微生物有机肥施用在番茄苗根部，最后在每株番茄苗的根部灌浇浓度为0.20.4的亚磷酸钾溶液。 7.一种高效防控连作番茄青枯病的方法，其特征在于：包括以下步骤： (1)采用权利要求1所述的拮抗菌B8分别制备B8液体菌剂和B8微生物有机肥； (2)将步骤(1)制备的B8液体菌剂和浓度为1030的淀粉溶液按照1:1的体积比混合制成混合液； (3)将番茄苗用步骤(2)制备的混合液蘸根，使拮抗菌B8细胞粘附在番茄苗根部； (4)根部粘附有拮抗菌B8细胞的番茄苗移栽时，将步骤(1)制备的B8微生物有机肥施用在番茄苗根部，最后在每株番茄苗的根部灌浇浓度为0.。

6、20.4的亚磷酸钾溶液。 8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述淀粉溶液的浓度为20；步骤(4)中所述亚磷酸钾溶液的浓度为0.3。 9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述B8微生物有机肥的施用量为4060g/棵；所述亚磷酸钾溶液的灌浇量为4060ml/棵。 10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(1)中采用权利要求1所述的拮抗菌 B8制备的B8液体菌剂中孢子和细胞的数量达到109/ml数量级；步骤(1)中采用权利要求1所述的拮抗菌B8制备的B8微生物有机肥中含有5107个/g以上的拮抗菌B8的孢子。权利要求书 1/。

7、1 页 2 CN 107365723 A 2 化学制剂和生防微生物联合防控连作番茄青枯病技术领域 0001 本发明涉及使用化学药剂、拮抗菌菌剂及微生物有机肥联合防控番茄青枯病，属于植物土传病害的综合防治领域。背景技术 0002 番茄青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种土传病害，发病率通常在20-30，连作时尤为严重，有时发病率高达70-80，甚至绝收。目前，还没有有效的化学农药防治番茄青枯病，迫切需要开发防控番茄青枯病的新技术。我们发现亚磷酸钾(KH2PO3),既可作为磷钾肥，一定浓度下又具有抑制病原菌-青枯劳尔氏菌生。

8、长的能力，亚磷酸钾和拮抗菌株F8对青枯病的抑制具有协同作用，亚磷酸钾和拮抗菌株F8液体菌剂及微生物有机肥联合使用，可以显著提高防控番茄青枯病的效果，也符合绿色农业的需求。发明内容 0003 本发明的目的在于研制一种利用化学抑菌剂亚磷酸钾、拮抗菌液体菌剂及微生物有机肥料防控番茄青枯病的综合技术，其综合防治效率达到60-80，为集约化番茄种植业的持续发展提供技术。 0004 本发明的目的可以通过以下技术方案实现： 0005 一株用于防治番茄青枯病的拮抗菌B8，属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，于2017年4月17日保藏于中国微。

9、生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.14042。主要生物学特性为： B8在LB培养基上生长时，菌落呈灰色，圆形，开始时菌落表明光滑，后期菌落表面有皱褶。 B8的细胞为杆状，生长后期细胞内形成球形的芽孢。拮抗菌B8菌株具有发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖产酸的能力，能水解淀粉和液化明胶。 0006 上述的拮抗菌B8在制备用于防控番茄青枯病的生防制剂中的应用。 0007 采用上述的拮抗菌B8生产的用于防控番茄青枯病的生防制剂。 0008 上述的拮抗菌B8在防控番茄青枯病中的应用。 0009 上述的拮抗菌B8在联合化学制剂亚磷酸钾防控番茄。

10、青枯病中的应用。 0010 上述的应用，包括以下步骤： (1)采用上述的拮抗菌B8分别制备B8液体菌剂和B8微生物有机肥； (2)将步骤(1)制备的B8液体菌剂和浓度为1030(W/V,1030g/100ml) 的淀粉溶液按照1:1的体积比混合制成混合液； (3)将番茄苗用步骤(2)制备的混合液蘸根，使拮抗菌B8细胞粘附在番茄苗根部； (4)根部粘附有拮抗菌B8细胞的番茄苗移栽时，将步骤 (1)制备的B8微生物有机肥施用在番茄苗根部，最后在每株番茄苗的根部灌浇浓度为0.2 0.4(W/V,0.20.4g/100ml)的亚磷酸钾溶液。 0011 一种高效防控连作番茄青枯病的方法，包括。

11、以下步骤： 0012 (1)采用上述的拮抗菌B8分别制备B8液体菌剂和B8微生物有机肥；说明书 1/4 页 3 CN 107365723 A 3 0013 (2)将步骤(1)制备的B8液体菌剂和浓度为1030(W/V,1030g/100ml)的淀粉溶液按照1:1的体积比混合制成混合液； 0014 (3)将番茄苗用步骤(2)制备的混合液蘸根，使拮抗菌B8细胞粘附在番茄苗根部； 0015 (4)根部粘附有拮抗菌B8细胞的番茄苗移栽时，将步骤(1)制备的B8微生物有机肥施用在番茄苗根部，最后在每株番茄苗的根部灌浇浓度为0.20.4(W/V,0.20.4g/ 100ml)的亚磷酸钾溶液。。

12、0016 上述的方法，其步骤(2)中所述淀粉溶液的浓度为20；步骤(4)中所述亚磷酸钾溶液的浓度为0.3。 0017 上述的方法，其步骤(4)中所述B8微生物有机肥的施用量为4060g/棵；所述亚磷酸钾溶液的灌浇量为4060ml/棵。 0018 上述的方法，其步骤(1)中采用上述的拮抗菌B8制备的B8液体菌剂中孢子和细胞的数量达到109/ml数量级；步骤(1)中采用上述的拮抗菌B8制备的B8微生物有机肥中含有5 107个/g以上的拮抗菌F8的孢子。 0019 本发明步骤(1)中用拮抗菌菌株B8生产B8液体菌剂和B8微生物有机肥料的具体生产方法可以参见专利ZL2012 1 0。

13、326641.7，但不限于此，也可以采用本领域技术人员公知的其他方法生产。 0020 上述方法中所用的亚磷酸钾为工业级，使用浓度为0.20.4,优选为0.3 (W/V)。本发明实验显示0.3的亚磷酸钾(KH2PO3)显著抑制病原菌-青枯劳尔氏菌的生长 (见图2)，而对生防菌株B8没有影响。 0021 生防菌株B8的液体菌剂、微生物有机肥料和亚磷酸钾的联合使用的最优选方法：将B8液体菌剂和20(W/V)的淀粉溶液按照1:1(V/V)的比例混合，用于番茄苗蘸根，使B8细胞粘附在番茄苗根部。 B8微生物有机肥采用穴施，按照每棵苗50g的使用量将微生物有机肥撒在番茄苗根部，。

14、再覆土，最后在每株番茄苗根部灌浇0.3(W/V)亚磷酸钾溶液50ml。 0022 本发明的有益效果： 0023 本发明筛选的拮抗菌菌株B8对番茄青枯病具有显著的防控效果，采用该菌株B8制备的生防制剂对番茄青枯病的生物防治显著，盆栽试验和田间试验的结果表明，连作番茄青枯病的土壤中综合施用B8液体菌剂、 B8微生物有机肥料和亚磷酸钾后，番茄青枯病的生物防治率高达70以上，表明联合处理具有显著的协同增效作用，可显著提高对番茄青枯病的防治效果。附图说明 0024 图1为拮抗菌菌株B8对番茄青枯病病原菌(R.solanacearum)的抑制作用(显示抑菌圈) 0025 图2为0。

15、.3亚磷酸钾对番茄青枯病病原菌(R.solanacearum)的抑制作用(显示抑菌圈) 0026 图3为联合处理对防治番茄青枯病的效果具体实施方式 0027 (一)菌株的分离和鉴定说明书 2/4 页 4 CN 107365723 A 4 0028 从番茄植株根际土壤中采用平板稀释法分离细菌，然后以番茄青枯病病原菌-青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)为指示菌采用对峙法筛选拮抗放线菌，根据生长速度、拮抗能力最终筛选出高效拮抗菌株B8，经过形态特征、生理生化特性以及16S rRNA基因序列将菌株B8鉴定为解淀粉芽孢杆菌。 0029 该菌株B8于2017。

16、年4月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.14042。主要生物学特性为： F8在LB培养基上生长时，菌落呈灰色，圆形，开始时菌落表明光滑，后期菌落表面有皱褶。 B8的细胞为杆状，生长后期细胞内形成球形的芽孢。拮抗菌B8菌株具有发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖产酸的能力，能水解淀粉和液化明胶。 0030 该拮抗菌菌株B8对番茄青枯病病原菌(R.solanacearum)的抑制作用如图1所示。 0031 (二)菌株B8液体菌剂及微生物有机肥的生产 0032 生产方法参见专利ZL2012 1 0326641.7。 003。

17、3 1)B8液体菌剂的制备：将菌株B8接种到PDA培养液中进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH范围为7.0-7.2，培养温度30， 170转/分钟，发酵48h后形成芽孢，获得 B8液体菌剂，其中的含菌或芽孢量5109个/ml； 0034 所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml， pH值调至7.2- 7.4， 121灭菌20min。 0035 2)B8微生物有机肥的制备：以腐熟的猪粪堆肥和氨基酸有机肥(江苏新天地氨基酸肥料有限公司产品。

18、，登记证号：苏农肥(2008)准字0180号，肥料规格： N+P2O5+K2O6，有机质30，氨基酸5)以体积比6： 4混合制成。所用腐熟的猪粪堆肥发芽指数为98以上，有机质质量比含量35，有机氮质量比含量为1.2-2，含水量25-30。 0036 将步骤1)制备的B8液体菌剂按20(V/W， 20ml/100g)的比例接种到步骤2)所述的有机肥中进行二次固体发酵，发酵温度为30-50，发酵过程中每天翻堆1次，发酵发酵周期 5-7天，使拮抗菌含量达到2.0109个/g以上，获得拮抗菌B8的固体菌剂。最后在温度不超过60的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至3。

19、0以下，获得防治番茄青枯病的F8微生物有机肥，该肥料中含有2.0109个/g的拮抗菌B8、全氮含量为30.9g.kg-1，全磷含量为 12.0g.kg-1、全钾含量为20.9g.kg-1。 0037 (三)温室盆栽试验 0038 供试番茄品种为 “合作918” ,由上海长种番茄种业有限公司出品。育苗45片真叶后移栽到装有5kg土壤的盆钵中。设置4个处理： 0039 1)CK； 0040 2)B8液体菌剂+B8微生物有机肥+0.3亚磷酸钾处理 0041 3)B8液体菌剂+F8微生物有机肥：将B8液体菌剂和20(W/V)的淀粉溶液按照1:1 (V/V)的比例混合，用于番茄苗蘸。

20、根，使菌株B8细胞粘附在番茄苗根部。微生物有机肥采用穴施，按照每棵苗50g的使用量将微生物有机肥撒在番茄苗根部，再覆土。 0042 4)0.3亚磷酸钾处理： CK处理用氮、磷、钾肥补齐养分，在每株番茄苗根部灌浇 0.3(W/V)亚磷酸钾溶液50ml。 0043 每种处理设三个区组，每个区组十五个重复。土壤中接种病原菌，含量为8.5106 说明书 3/4 页 5 CN 107365723 A 5 个/g土。 B8液体菌剂+B8微生物有机肥+0.3亚磷酸钾综合处理的过程为：将B8液体菌剂和 20(W/V)的淀粉溶液按照1:1(V/V)的比例混合，用于番茄苗蘸根，使菌株B。

21、8细胞粘附在番茄苗根部。微生物有机肥采用穴施，按照每棵苗50g的使用量将微生物有机肥撒在番茄苗根部，再覆土，最后在每株番茄苗根部灌浇0.3(W/V)亚磷酸钾溶液50ml(0.3亚磷酸钾对番茄青枯病病原菌(R.solanacearum)的抑制作用见图2)。 CK处理用氮、磷、钾肥补齐养分。 0044 番茄生长20天后每天调查青枯病发生情况，计算病情指数和防治效果： 0045 病情指数(各级病株数相应级数)/调查总植株数100； 0046 防治效果(对照区病情指数处理区病情指数)/对照区病情指数100； 0047 病害严重度分级标准： 0级：无病状；级： 1/4叶片发病；。

22、级： 1/2叶片发病；级：整株死亡。 0048 结果显示，单独使用0.3亚磷酸钾对番茄青枯病的防治效果为40.6，使用B8液体菌剂和B8微生物有机肥对番茄青枯病的防治效果为51.1，而联合施用B8液体菌剂、 B8 微生物有机肥和亚磷酸钾的综合处理对番茄青枯病的防治效果达到76.2(表1),表明联合处理具有协同作用，可显著提高对番茄青枯病的防治效果(图3)。 0049 表1 联合处理对防治番茄青枯病的效果 0050 处理病情指数()防治效果() CK90.6 综合处理21.576.2 比较例1(B8液体菌剂+B8微生物有机肥)44.351.1 比较例2(0.3亚磷酸钾处理)53.840.6 说明书 4/4 页 6 CN 107365723 A 6 图1 图2 说明书附图 1/2 页 7 CN 107365723 A 7 图3 说明书附图 2/2 页 8 CN 107365723 A 8 。

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