技术领域
本发明涉及鱼类检测领域，具体涉及一种检测鲱鱼种类的方法及其检测试 剂盒和引物。
背景技术
鲱鱼是全球性鱼类，广泛分布于整个北大西洋和北太平洋水域。从缅因至 北卡罗来纳的美国东海岸水域出产大西洋鲱鱼(Clupea harengus)。从中加洲 至阿拉斯加白令海的美国西海岸水域出产太平洋鲱鱼(Clupea pallasi)。大西 洋鲱鱼和太平洋鲱鱼的资源都十分丰富。鲱鱼具有很高的药用价值，其精巢含 有丰富的鱼精蛋白，脱氧核苷酸和精氨酸，是提取制作鱼精蛋白注射液和精蛋 白锌胰岛素的重要原料。
鲱鱼是鱼精蛋白制备的原材料来源。目前，用于鱼类鉴别的方法主要是采 用传统的形态学鉴别法，即对完整鱼体进行形态特征比对，但是该鉴定方法最 大缺陷在于需要结构完整的鱼体，不能有损坏，而且操作复杂，专业性强。如 果仅以鱼组织样品为材料，采用传统的整体形态学手段，则无法进行鱼类鉴别。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服传统的鲱鱼传统形态学鉴别法需要完 整的鱼体进行形态特征比对，需要结构完整、不能有损坏的鱼体，使传统鲱鱼 形态学鉴别法具有操作复杂，专业性强的缺陷。采用本发明的检测方法检测鲱 鱼的种类，所需检测时间短，成本低，检测结果特异性高，检测结果判定方法 简单。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一是：一种检测鲱鱼种类的方 法，所述方法包括以下步骤：(1)扩增待检测样本的基因组DNA，所述特异 性扩增引物对的序列分别如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，或SEQ ID NO:7和 SEQ ID NO:8，或SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，或SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示，
(2)将步骤(1)所得PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，有特异性条带 的待测样本为太平洋鲱鱼(Clupea pallasii)或大西洋鲱鱼(Clupea harengus)。
根据本发明，步骤(1)中所述待测样本为本领域常规的待测样本，较佳 地为待测鱼体的一部分，优选地是鱼肉，内脏，鱼头，鱼白，鱼籽和鱼鳞中的 一种或多种。
步骤(1)中所述提取待检测样本的基因组DNA的方法为本领域常规方 法，所述方法较佳地包括以下步骤：
取鱼组织样品加液氮碾磨10min，或者100℃烘5-8小时，待烘干后碾磨 10min。
取碾碎后的样品加入EP管，加入细胞裂解液1ml，加入蛋白酶K20μl， 混匀。
在60-70℃的恒温水浴箱水浴10-40min，也可在30-40℃水浴12-24h，间 歇震荡EP管数次。
裂解好后，台式离心机以12000-13000rpm离心5-10min，取上清液小心吸 入另一离心管中。
加入2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用吸头挑出，晾干。
加入200μlTE重洗溶解，加入等量的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)震荡混 匀，转速12000-13000rpm离心5-10min。
取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，震荡混匀， 转速12000-13000rpm离心5-10min。
取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L的乙酸铵，然后加入2倍 体积的无水乙醇，混匀后，转速12000-13000rpm离心5-10min。
小心倒出上清液，吸水纸将管壁残余液滴除掉。
用1ml70％的乙醇洗涤沉淀物2-3次，转速12000-13000rpm离心5-10min。
小心倒掉上清液，EP管置烘箱37℃烘3-5h。
步骤(1)中所述PCR反应的体系较佳地为1×PCR反应缓冲液，10～ 15mmol/L Mg2+，0.2～0.3mmol/L dNTP，0.1～0.3μM特异性扩增引物对，0.01～ 0.1U/μLTaq酶，10～100ng/μLDNA模板。更佳地为：1×PCR反应缓冲液， 12.5mmol/LMg2+，0.25mmol/LdNTP，0.2μM特异性扩增引物对，0.04U/μLTaq 酶和50ng/μL DNA模板。
步骤(1)中所述PCR反应的扩增程序较佳的为：(1)93～95℃预变性 2～4min，(2)93～95℃变性28～32s，(3)56～60℃退火28～32s，(4) 72℃延伸1～2min，其中步骤(2)～(4)循环次数30～35次，(5)72℃延 伸3～5min，(6)4℃终止反应。更佳地为：(1)94℃预变性3min，(2)94℃ 变性30s，(3)58℃退火30s，(4)72℃延伸1min，其中步骤(2)～(4) 循环次数30次，(5)72℃延伸4min，(6)4℃终止反应。
本发明所述的方法更佳地还包括步骤(3)：将步骤(1)所得PCR扩增产 物进行测序，将测序结果与鲱鱼属的COI基因进行序列比对，若样品序列与 太平洋鲱鱼(Clupea pallasii)或大西洋鲱鱼(Clupea harengus)的COI基因匹 配度≥99％为太平洋鲱鱼(Clupea pallasii)或大西洋鲱鱼(Clupea harengus)。
基因之间的匹配度由Ident值表示，Ident值是指两段核酸序列的匹配度， 该值越接近100％，说明两个核酸序列的相似度越高。考虑到基因扩增和测序 的准确度影响，当Ident值≥99％时，就可以判断待测物种的基因与目的基因 来自同一物种。因此当测序结果与鲱鱼属的COI基因进行序列比对时，若样 品序列与太平洋鲱鱼(Clupea pallasii)或大西洋鲱鱼(Clupea harengus)COI 基因的Ident值≥99％，则确定待测样本为太平洋鲱鱼或大西洋鲱鱼。
步骤(3)所述的测序和序列比对方法均为本领域常规方法，其中所述的 测序的方法较佳地为利用核酸测序仪进行测序，所述序列比对的方法较佳地为 利用Blast方法进行序列比对。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之二是：一种检测鲱鱼种类的试 剂盒，其包括特异性扩增引物对，所述特异性扩增引物对的序列分别如序列表 中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，或SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，或SEQ ID NO:9和 SEQ ID NO:10，或SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。
本发明所述试剂盒较佳地还包括10×PCR缓冲液，Taq酶，dNTP溶液和 MgCl2。所述的10×PCR缓冲液，Taq酶，dNTP溶液和MgCl2都如本领域常 规所述。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之三是：一种检测鲱鱼种类的引 物，其序列如SEQ ID NO:1所示或者如SEQ ID NO:2所示。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之四是：一种检测鲱鱼种类的引 物，其序列如SEQ ID NO:3所示或者如SEQ ID NO:4所示。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之五是：一种检测鲱鱼种类的引 物，其序列如SEQ ID NO:5所示或者如SEQ ID NO:6所示。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之六是：一种检测鲱鱼种类的引 物，其序列如SEQ ID NO:7所示或者如SEQ ID NO:8所示。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之七是：一种检测鲱鱼种类的引 物，其序列如SEQ ID NO:9所示或者如SEQ ID NO:10所示。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之八是：一种检测鲱鱼种类的引 物，其序列如SEQ ID NO:11所示或者如SEQ ID NO:12所示。
本发明所述检测鲱鱼种类的引物的制备方法为本领域常规制备方法，较佳 地为人工合成全序列，或通过商业合成本发明所述引物。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明 各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明设计的引物依据为鱼类线粒体DNA 的COI基因，该基因在不同属的鱼类之间既有特异性，又有保守序列。因此， 采用该基因的保守序列设计PCR引物，保证不同的鱼种提取的DNA具有特异 性，保证能被测序和鉴定。该方法鉴别鱼种准确度高，可重复性强，误差小， 操作人员不需要深厚的物种鉴定背景即可操作。
同时，1)本检测方法所需样品为鱼的一小块组织，不需要完整的鱼体。2) 采用具有特异性的引物扩增cytochrome oxidase subunit I(COI)基因，确保鉴 定方法的准确性及唯一性。3)和传统方法相比，本发明的操作人员不需要大 量的从业经验，只需按照操作步骤实验即可。4)本发明所述试剂盒具有所需 检测时间短，成本低，检测结果特异性高，检测结果判定方法简单的优点。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所 述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方 法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1检测鲱鱼引物的设计与合成
1、根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)官方网站，查找鲱鱼的 cytochrome oxidase subunit I(COI)基因，得到太平洋鲱(clupea pallasii)和大 西洋鲱(clupea harengus)的COI基因共计50种，所述COI基因片段的名称 如下所示：
2、根据上述所得到的基因，利用DNAMAN5.0软件，通过多基因序列 比对，查找这些基因的保守区域，得到的保守区域的DNA序列如序列表中 SEQ ID NO:13所示。
3、制备引物
根据以上得到的cytochrome oxidase subunit I(COI)基因保守区域序列， 采用DNAMAN5.0设计引物，引物设计参数设置为：产物长度400～500bp， 引物长度18～22bp，Tm值为56～62℃，GC含量为45～55％。
得到初始引物对26对，根据多基因序列比对结果，剔除在保守区域之 外的引物对，同时根据PCR扩增反应的结果，剔除无法得到特异性条带的 引物对，最终选择制备了6对引物(上海美吉生物医药科技有限公司)，所 得6对引物分别命名为引物1，引物2，引物3，引物4，引物5和引物6。
所述6对引物的12条核酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:12所示。
实施例2检测鲱鱼种类
1、提取样品基因组DNA
取市售鲱鱼肉样品1g，加液氮碾磨10min，取碾碎后样品0.1g加入到 2ml的EP管，加入细胞裂解液1ml、蛋白酶K20μl，混匀；
在62℃恒温水浴箱水浴20min，台式离心机12000rpm离心5min，取上 清液小心移入另一离心管中，加入2倍体积异丙醇，倒转混匀后可以看见丝 状物，用100μl吸头挑出，晾干；
加入200μlTE重洗溶解，加入等量的酚︰氯仿︰异戊醇(25︰24︰1) 震荡混匀，12000rpm离心5min；
取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿︰异戊醇(24︰1)震荡混匀， 12000rpm离心5min；
取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸铵，然后加入2倍 体积的无水乙醇，混匀后，12000rpm离心10min；
小心倒出上清液，吸水纸将管壁残余液滴除掉，用1ml70％乙醇洗涤沉 淀物3次，12000rpm离心10min，小心倒掉上清液，EP管置烘箱37℃烘3h， 得到DNA约0.2μg。
2、PCR方法扩增目的基因
(1)PCR反应
a、引物：取实施例1所得引物1，所述引物1中的正反向引物序列分别 如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。按照合成引物给定的浓度， 配制成浓度为10μmol/L的溶液备用。
b、PCR反应体系为：将步骤1制备所得基因组DNA加入200μlTE，重 新溶解作为模板；取DNA样品(模板)30μl，加入10×缓冲液10μl、dNTPMix 8μl、Taq DNA Polymerase0.5μl、正反向游引物各5μl，补充ddH2O至100μl。
c、PCR扩增程序：
PCR扩增程序包括以下步骤：(1)94℃预变性3min，(2)94℃变性30s， (3)58℃退火30s，(4)72℃延伸1min，其中步骤(2)～(4)循环次数 30次，(5)72℃延伸4min，(6)4℃终止反应。得到DNA溶液50μl，其浓 度约为100ng/μl。
3、目的基因的测序和比对
将扩增后所得目的基因样品经凝胶电泳分析，回收目的片段送至测序公 司测序(上海美吉生物医药科技有限公司)，测得基因序列如序列表中SEQ ID NO：14所示。
将所得目的基因测序结果的5’->3’序列，在NCBI数据库中进行Blast 运行比对，与所得PCR扩增产物的序列相似度最高的序列为KC015290(Max ident＝100％)，在NCBI数据库中查询序列KC015290，得到该基因序列的种 属信息为：Clupea harengus，确定该鱼组织样品属于大西洋鲱鱼种(Clupea harengus)。
实施例3检测鲱鱼种类
1、提取样品基因组DNA
取鲱鱼组织样品，依据实施例2所述样品基因DNA组提取方法抽提组 织样品DNA。
2、PCR方法扩增目的基因
(1)PCR反应
a、引物：取实施例1所得引物2，所述引物2中的正反向引物序列分别 如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。按照合成引物给定的浓度， 配制成浓度为10μmol/L的溶液备用。
b、PCR反应体系中Mg2+浓度为15mmol/L，dNTP浓度为0.3mmol/L， 扩增引物浓度为0.3μM，Taq酶浓度为0.1U/μL，DNA模板浓度为100ng/μL。
c、PCR扩增程序为(1)93℃预变性2min，(2)93℃变性28s，(3) 56℃退火28s，(4)72℃延伸1min，其中步骤(2)～(4)循环次数30次， (5)72℃延伸3min，(6)4℃终止反应。
3、目的基因的测序和比对
将扩增后所得目的基因样品经凝胶电泳分析，回收目的片段送至测序公 司测序(上海美吉生物医药科技有限公司)，测得基因序列如序列表中SEQ ID NO：14所示。
将所得目的基因测序结果的5’->3’序列，在NCBI数据库，Blast运行， 与所得PCR扩增产物的序列相似度最高的序列为KC015290(Max ident＝99％)，在NCBI数据库查询序列KC015290，得到其种属信息为：Clupea harengus，从而判断该鱼组织样品属于大西洋鲱鱼种(Clupea harengus)。
实施例4检测鲱鱼种类
1、提取样品基因组DNA
取鲱鱼组织样品，依据实施例2所述样品基因组DNA提取方法抽提组 织样品DNA。
2、PCR方法扩增目的基因
(1)PCR反应
a、引物：取实施例1所得引物3，所述引物3中的正反向引物序列分别 如序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。按照合成引物给定的浓度， 配制成浓度为10μmol/L的溶液备用。
b、PCR反应体系中Mg2+浓度为10mmol/L，dNTP浓度为0.2mmol/L， 扩增引物浓度为0.1μM，Taq酶浓度为0.01U/μL，DNA模板浓度为10ng/μL。
c、PCR扩增程序为(1)95℃预变性4min，(2)95℃变性32s，(3) 60℃退火32s，(4)72℃延伸2min，其中步骤(2)～(4)循环次数35次， (5)72℃延伸5min，(6)4℃终止反应。
3、目的基因的测序和比对
将扩增后所得目的基因样品经凝胶电泳分析，回收目的片段送至测序公 司测序(上海美吉生物医药科技有限公司)，测得基因序列如序列表中SEQ ID NO：15所示。
将所得目的基因测序结果的5’->3’序列，在NCBI数据库，运行Blast 进行序列比对，与所得PCR扩增产物的序列相似度最高的序列为的序列为 KF558314(Max ident＝99％)，在NCBI数据库查询序列KF558314，得到其种 属信息为：Clupea pallasii，从而判断该鱼组织样品属于太平洋鲱鱼(Clupea pallasii)。
实施例5检测鲱鱼种类
1、提取样品基因组DNA
取鲱鱼组织样品，依据实施例2所述样品基因组DNA提取方法抽提组 织样品DNA。
2、PCR方法扩增目的基因
(1)PCR反应
a、引物：取实施例1所得引物4，所述引物4中的正反向引物序列分别 如序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。按照合成引物给定的浓度， 配制成浓度为10μmol/L的溶液备用。
b、PCR反应体系如实施例2所述。
c、PCR扩增程序如实施例2所述。
3、目的基因的测序和比对
将扩增后所得目的基因样品送至测序公司测序(上海美吉生物医药科技 有限公司)，测得基因序列如序列表中SEQ ID NO：16所示。
将所得目的基因测序结果的5’->3’序列，在NCBI数据库，Blast运行， 与所得PCR扩增产物的序列相似度最高的序列为JF693642(Max ident＝99％)， 在NCBI查询序列JF693642，得到其种属信息为：Clupea pallasii，从而判断 该鱼组织样品属于太平洋鲱鱼(Clupea pallasii)。
实施例6检测鲱鱼种类
1、提取样品基因组DNA
取鲱鱼组织样品，依据实施例2所述样品基因组DNA提取方法抽提组 织样品DNA。
2、PCR方法扩增目的基因
(1)PCR反应
a、引物：取实施例1所得引物5，所述引物5中的正反向引物序列分别 如序列表中SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。按照合成引物给定的浓度， 配制成浓度为10μmol/L的溶液备用。
b、PCR反应体系如实施例2所述。
c、PCR扩增程序如实施例2所述。
3、目的基因的测序和比对
将扩增后所得目的基因样品经凝胶电泳分析，回收目的片段送至测序公 司测序(上海美吉生物医药科技有限公司)，测得基因序列如序列表中SEQ ID NO：17所示。
将所得目的基因测序结果的5’->3’序列，在NCBI数据库运行Blast，与 所得PCR扩增产物的序列相似度最高的序列为KC015284(Max ident＝99％)， 在NCBI查询序列KC015284,得到其种属信息为：Clupea harengus，从而判 断该鱼组织样品属于大西洋鲱鱼(Clupea harengus)。
实施例7检测鲱鱼种类
1、提取样品基因组DNA
取鲱鱼组织样品，依据实施例2所述样品基因组DNA提取方法抽提组 织样品DNA。
2、PCR方法扩增目的基因
(1)PCR反应
a、引物：取实施例1所得引物5，所述引物5中的正反向引物序列分别 如序列表中SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。按照合成引物给定的浓度， 配制成浓度为10μmol/L的溶液备用。
b、PCR反应体系如实施例2所述。
c、PCR扩增程序如实施例2所述。
3、目的基因的测序和比对
将扩增后所得目的基因样品经凝胶电泳分析，回收目的片段送至测序公 司测序(上海美吉生物医药科技有限公司)，测得基因序列如序列表中SEQ ID NO：18所示。
将所得目的基因测序结果的5’->3’序列，在NCBI数据库，Blast运行， 与所得PCR扩增产物的序列相似度最高的序列为：JF693642(Max ident＝99％)， 在NCBI查询序列JF693642，得到其种属信息为：Clupea pallasii，从而判断 该鱼组织样品属于太平洋鲱鱼(Clupea pallasii)。
对比实施例1
1、提取样品基因组DNA
取市售草鱼鱼肉组织，提取方法同实施例2，得到基因组DNA约0.2μg。
2、PCR方法扩增目的基因
(1)PCR反应
a、引物：取实施例1所得引物1，所述引物1中的正反向引物序列分别 如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。按照合成引物给定的浓度， 配制成浓度为10μmol/L的溶液备用。
b、PCR反应体系如实施例2所述。
c、PCR扩增程序如实施例2所述，所述PCR扩增程序中的阴性对照为 以蒸馏水为模板进行PCR扩增，其中的阳性对照组为以实施例2所述大西 洋鲱鱼的基因组DNA为模板进行PCR扩增实验。
3、扩增结果
利用实施例2所述PCR方法，无法从阴性对照组和草鱼的鱼肉组织中 扩增出特异性条带，在阳性对照组中能够扩增出特异性条带，说明样品中完 全不含与引物1匹配的DNA模板，因此所检测样品不是来自鲱鱼。
对比实施例2
1、提取样品基因组DNA
取市售鲫鱼鱼肉组织，基因组DNA的提取方法同实施例2，得到基因 组DNA约0.2μg。
2、PCR方法扩增目的基因
(1)PCR反应
a、引物：取实施例1所得引物2，所述引物2中的正反向引物序列分别 如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。按照合成引物给定的浓度， 配制成浓度为10μmol/L的溶液备用。
b、PCR反应体系如实施例2所述。
c、PCR扩增程序如实施例2所述，该PCR扩增程序中的阴性对照为以 蒸馏水为模板进行PCR扩增，其中的阳性对照组为以实施例3所述大西洋 鲱鱼的基因组DNA为模板进行PCR扩增实验。
3、目的基因的测序和比对
利用实施例2所述PCR方法，无法从阴性对照组和鲫鱼的鱼肉组织中 扩增出特异性的目的基因条带，在阳性对照组中能够扩增出特异性条带，说 明样品中完全不含与引物2匹配的DNA模板，因此所检测样品不是来自鲱 鱼。
对比实施例3
1、提取样品基因组DNA
取不同来源的鱼肉组织，其基因组DNA的提取方法同实施例2，得到 基因组DNA约0.2μg。
2、PCR方法扩增目的基因
(1)PCR反应
a、引物：取实施例1中所有引物1-6。按照合成引物给定的浓度，配制 成浓度为10μmol/L的溶液备用。
b、PCR反应体系如实施例2所述。
c、PCR扩增程序如实施例2所述，该PCR扩增程序中的阴性对照为以 蒸馏水为模板进行PCR扩增，其中的阳性对照组为以实施例3所述大西洋 鲱鱼的基因组DNA为模板进行PCR扩增实验。
3、目的基因的测序和比对
目的基因的分析、测序和比对方法如实施例2所述。在阴性对照组中无 法扩增出特异性条带，在阳性对照组中能够扩增出特异性条带。
所得结果如表1-6所示：
表1引物1的扩增结果和测序结果
表2引物2的扩增结果和测序结果
表3引物3的扩增结果和测序结果
表4引物4的扩增结果和测序结果
表5引物5的扩增结果和测序结果
表6引物6的扩增结果和测序结果
从表1-表6所示的内容中可以看出，本发明所述引物既无法从太平洋鲱 鱼(Clupea pallasii)或大西洋鲱鱼(Clupea harengus)的近缘鱼类中扩增出特 异性条带，也无法从与太平洋鲱鱼(Clupea pallasii)或大西洋鲱鱼(Clupea harengus)的亲缘关系较远的鱼类中扩增中特异性条带，因此本发明所述的 特异性引物对太平洋鲱鱼(Clupea pallasii)或大西洋鲱鱼(Clupea harengus) 具有属特异性，将本发明所述引物对扩增得到的PCR产物进行测序，就能 检测待测样品的种类。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发 明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。