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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410244164.9 (22)申请日 2014.05.30 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 103992948 A (43)申请公布日 2014.08.20 (73)专利权人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号 (72)发明人 葛艳艳安秋康敏杨和梅 秦磊 (51)Int.Cl. C12M 3/00(2006.01) (56)对比文件 US 2013171682 A1,2013.07.04, CN 101165161 A,2008.。
2、04.23, CN 103627635 A,2014.03.12, 审查员 陈云华 (54)发明名称 一种用于细胞迁移研究的微纳流控器件 (57)摘要 一种用于细胞迁移研究的微纳流控器件， 主 要包括： 最底一层为玻璃基底， 中间一层为底部 有微流体通道的PDMS层， 最上层为两个玻璃圆柱 体蓄液池。 PDMS成型的微流体室被两条水凝胶成 型的纳米多孔隔离栅分成三个独立的区域 两侧边的流体通道和中央细胞培养区。 在两侧通 道的入口处加入不同浓度的溶液， 通过扩散可在 中央细胞培养区形成一稳定的浓度梯度。 器件还 设计了两条弯曲细长的通道和一个平衡区来平 衡两个侧流体通道的压力， 以确保细胞培养。
3、区的 浓度梯度的可重复性和稳定性。 该器件结构简单 且可很容易地实现重新配置， 通过调整水凝胶隔 离栅的厚度， 可以实现浓度梯度和其他一些影响 细胞迁移的参数的控制以适应不同研究的需要。 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 CN 103992948 B 2016.11.02 CN 103992948 B 1.一种用于细胞迁移研究的微纳流控器件， 其特征在于： 所述微纳流控器件由三部分 组成： 最底一层为玻璃基底(1)， 中间一层为底部有微流体通道的PDMS层(2)， 最上层为两个 玻璃圆柱体(3)， 用来作为培养液的蓄液池； 其中PDMS室(4)被两条凝胶隔离栅(5)间隔开来 形成三个独立的。
4、通道， 为两边的流体通道(6)和中央细胞培养通道(7)； 当在两边的流体通 道的入口处加入不同浓度的溶液时， 溶液在重力驱动下会流进两边的流体通道； 通过扩散 的作用， 在中央细胞培养区域形成一浓度梯度； 为了确保浓度梯度的可重复性和稳定性， 设 计了两条弯曲的细长的通道(8)和一个平衡区(9)来平衡两边的流动通道的压力， 所述两条 弯曲的细长的通道在接入细胞培养区前， 先经由两条细的横向通道连接到同一个流体缓冲 区； 通过调整水凝胶隔离栅(5)的厚度， 可以实现浓度梯度和影响细胞迁移的至关重要的参 数的控制； 所述蓄液池和PDMS室(4)通过弯曲细长通道(8)和平衡区(9)连通。 2.根据权。
5、利要求1所述的微纳流控器件， 其特征在于： PDMS室(4)被两条宽度可调的水 凝胶隔离栅(5)隔离成三个区域。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103992948 B 2 一种用于细胞迁移研究的微纳流控器件 技术领域 0001 本发明属于微流体领域， 涉及一种用于细胞迁移研究的微纳流控器件和形成所述 流体器件的制造方法。 背景技术 0002 细胞迁移是目前细胞生物学研究的一个重要课题， 科学家们试图通过对细胞迁移 的研究， 在阻止癌症转移、 异体植皮等医学应用方面取得更大的成果。 同时也因为细胞迁移 独有的运动特性， 已成为当前生物学研究的热门方向。 有较多的试验对细胞的迁移进行了 研究，。
6、 早期的研究器件可以分为Boyden小室， Zigmond室， 唐恩室， 和微量计等几种结构。 0003 但是， 在这些器件中， 细胞除了处于浓度梯度中， 还暴露在因流动产生的剪应力 中， 这些剪切力会直接影响细胞的迁移。 此外， 由细胞分泌的大多数信号因素(自分泌/旁分 泌)也会被冲走， 这会对研究细胞迁移产生十分不利的影响。 基于扩散的浓度梯度形成器 件， 他们的工作原理是利用隔离栅或者膜通过扩散形成并保持浓度梯度。 因此它们能够克 服一些基于流动的梯度形成器件的局限， 但它们也有自己的局限性： 如他们仅能对非贴壁 细胞(例如， 胚胎， 昆虫细胞)或二维(2D)贴壁细胞培养而不能支持细胞外。
7、基质。 在体内组织 的功能中， 细胞外基质的影响是至关重要的。 针对这一问题， 一些研究小组将三维(3D)材料 整合到微流体器件中作为细胞基质的支撑结构， 但这些设备往往是： 1)由于其复杂的设计 很难制造； 2)无法提供可控的化学浓度梯度； 或3)无法较长时间的保持浓度梯度。 发明内容 0004 本发明的技术解决的问题是： 为了克服上述限制， 设计加工了一微流体器件， 该器 件将PEGDA凝胶嵌入作为半透隔离栅辅助浓度梯度的形成， 可应用于细胞迁移的研究。 该器 件可提供可重复的， 可控的， 稳定的且可以较长时间稳定的浓度梯度。 0005 本发明的解决方案： 该微流体器件由三部分组成： 最底。
8、一层为玻璃基底， 中间一层 为底部有微流体通道的PDMS层， 最上层为两个玻璃圆柱体， 用来作为培养液的蓄液池。 器件 的主要结构为一PDMS室， 该室被两条凝胶隔离栅间隔开来形成三个独立的通道两边的 流体通道和中央细胞培养通道。 当在两侧通道的入口处加入不同浓度的溶液时， 溶液在重 力驱动下会流进侧通道。 同过扩散的作用， 在中央细胞培养区域形成一浓度梯度， 可在该区 域装载和培养细胞。 为了确保浓度梯度的可重复性和稳定性， 设计了两条弯曲的细长的通 道和一个平衡区来平衡两个侧流动通道的压力。 通过调整水凝胶隔离栅的厚度， 可以实现 浓度梯度和其他一些影响细胞迁移的至关重要的参数的控制。 0。
9、006 本发明原理： 该器件的设计是基于PEGDA凝胶既是生物相容的， 同时在复杂的环境 中又不会被污染。 在该器件中PEGDA凝胶被用作为高流阻的多孔膜， 它既可以帮助浓度梯度 的快速形成， 同时又可以限制因两入口通道之间的压力不平衡造成的流体的横向流动。 对 于小分子， 膜的阻力不影响其扩散输运。 在两入口液池中加入不同浓度的溶液， 在重力的驱 动下， 浓度不同的两股流体会流入侧通道。 在扩散的作用下， 在中央细胞培养区会形成一个 说明书 1/3 页 3 CN 103992948 B 3 浓度梯度。 为了维持细胞培养区域的浓度梯度的稳定， 则需要维持两侧通道S1和S2的压力 平衡。 从理论。
10、上说， 可以通过在两入口的流体池中加入相同体积的溶液来解决， 但实际上， 这种方法在在微流体系统中是有问题的， 液面的水平高度很难精确控制。 表面张力的影响， 也可能导致流体的流动。 因此， 在系统中加入了两条细长的弯曲的侧通道和一平衡区。 我们 知道两侧通道在接触区的通流量是与两流路间的压力差成正比与流路的阻力成反比的(Q P/R)。 弯曲的细长侧通道， 有助于增加系统的流体阻力(即随着R的增加， 则Q减小)从而 控制因两侧通道压力不平衡引起的流体的横向流动。 两弯曲的侧通道在接入细胞培养区 前， 先经由两条细的横向通道连接到同一个流体缓冲区。 该细的横向通道， 可以允许流体的 流通， 在两。
11、侧通道压力达到平衡时可以减少两侧通道间的扩散。 当两流体流经细长侧通道 区在平衡区相遇后， 基本上以相同的压力流经细胞培养区。 在器件的制造过程中， 因为表面 效应， 水凝胶与PDMS的壁面间总有空隙存在， 不能够贴合的非常好。 为了解决这个问题， 在 结构设计的时候， 在水凝胶与PDMS侧壁接触区设计了凹槽结构， 这样可以彻底解决端缝隙 存在的问题。 0007 本发明的优点： 该微流体器件中流体的驱动采用重力来驱动， 这样可以实现器件 操作简单， 且结构足够紧凑可以放在培养皿中， 这对细胞的研究是十分方便的。 此外， 该器 件的结构设计可以很容易地实现重新配置， 以适应不同的应用研究的需要。。
12、 如浓度梯度可 以通过改变中央细胞培养区宽度或隔离栅的厚度很容易地就可以实现： 减少中央培养通道 宽度或隔离栅的厚度， 可以快速建立一陡峭的浓度梯度。 利用此设备的灵活性， 可以很简单 的实现不同的细胞迁移的检测研究。 附图说明 0008 图1为器件的实物图。 0009 图2为微流体装置示意图。 0010 图3为水凝胶隔离栅制造过程的示意图。 0011 具体实施方法 0012 为了在玻璃基底表面上形成水凝胶的微观结构， 对表面进行了处理来提高水凝胶 的附着力。 简单来说就是表面用有机硅烷(organosilane)进行出理来产生拴系甲基丙烯酸 甲酯组(tetheredmethacrylateg。
13、roups)以在聚合过程中通过共价键与水凝胶键合。 基底 首先浸泡在浓度为30w/v的双氧水和浓硫酸， 按照1 4的比例混合的 “piranha” 溶液中来 进行表面的清洁和羟基化(hydroxylate)基底表面。 经过羟基化的表面， 再浸泡在浓度为 1mM的3-(trichlorosilyl)propylmethacrylate(TPM， Sigma-Aldrich， St.Louis， MO)在庚 烷(heptane)/碳四氯化碳(carbontetrachloride)比例为80/20(V/V)的混合溶液中5 分钟， 这样可以在基底表面形成一致密的Si-O-Si键的网络表面结构和悬吊甲。
14、基丙烯酸甲 酯(pendantmethacrylate)。 0013 微流体室是利用MEMS工艺制作而成。 主要包括SU-8模具工艺和PDMS成型工艺。 简 单来说就是获取SU-8模具后， 通过在模具上成型PDMS(固化体和预聚体的重量比为1 10， EllsworthAdhesives， Germantown， WI)获得。 脱气后的PDMS层在65的条件下在模具上继 续固化2小时。 固化后的PDMS层从它的模具上取下， 并用不锈钢管打孔来作为流体池或者用 来进行流体互联。 PDMS层通过空气等离子体(PlasmacleanerModelPDC-32G， Harrick 说明书 2/3 页 。
15、4 CN 103992948 B 4 Plasma， Ithaca， NY)处理后与处理过的玻璃盖玻片(VWRVistaVision， Suwanee， GA)键合 固定在一起， 形成微流体室。 最后把玻璃圆柱体(FisherScientific， Pittsburg， PA)粘固 在进液口处形成蓄液池从而完成微流体器件的制作。 器件的最终组装图如附图1所示。 0014 水凝胶隔离栅的制备根据可溶性因子的需要， 水凝胶隔离栅的加工厚度可以在 30-500 m之间变化。 水凝胶隔离栅的最小厚度受水凝胶强度的限制而最大厚度受水凝胶中 有效扩散度的限制。 Michael等研究表明， 细胞在水凝胶中在。
16、距离营养物质输送通道为0到 600 m的范围内， 能在72小时内保持较强的的生存力。 水凝胶的制作过程简单来说就是， 首 先对PDMS室的表面用光引发剂苯乙酮(photoinitiatoracetophenone(2， 2-dimethoxy-2- phenylacetophenoneinn-vinylpyrrolidone， 300mg/mL， Sigma)进行处理， 以提高表面 自由基诱导的PEGDA预聚合物溶液在界面的聚合。 过多的光引发剂先用纯度为100乙醇充 分冲洗后再用和去离子水充分冲洗， 最后用氮气吹干。 然后将聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG- diacrylate)(PEG-DA，。
17、 MW575， Sigma-Aldrich， Polysciences， Warrington， PA)和浓度为 0.25(W/W)Darocur1173(1-phenyl-2-hydroxy-2-methyl-1-propanone， Ciba SpecialtyChemicals， Tarrytown， NY)混合形成凝胶预聚合物溶液注入到微流体室中， 在 注入的过程中， 为了避免气泡的产生， 注入速度要十分缓慢。 注入后， 在曝光前为了避免预 聚合溶液溢出， 进出液口的流体池都用透明胶带密封。 然后用掩模将流体室从底部盖住， 用 较长波长的UV灯(365nm， 20mW/cm2)照射20秒钟进行聚合， 如附图3(f)所示。 仅曝光区发生 了自由基诱导凝胶化， 形成不溶于PEG溶剂的结构。 没有凝胶化的预聚物溶液利用去离子水 冲洗掉。 在冲洗的过程中要控制冲洗液的速度， 避免对水凝胶结构的破坏。 器件制作的工艺 流程如附图3所示。 说明书 3/3 页 5 CN 103992948 B 5 图1 图2 说明书附图 1/2 页 6 CN 103992948 B 6 图3 说明书附图 2/2 页 7 CN 103992948 B 7 。