一种制备鲍鱼硫酸多糖的方法.pdf

本发明公开了一种由鲍鱼内脏或性腺制备硫酸多糖的方法，步骤为：1、以鲍鱼内脏或性腺为原料，碱法或酶法提取，提取液离心；2、上清液经离子交换树脂吸附，水冲洗至流出液澄清后，两种不同浓度氯化钠溶液依次洗脱，收集流出液；3、可用超滤方法除盐和浓缩，然后醇沉；4、依次采用碱法和酶法再次解离蛋白；5、调酸除蛋白，氧化脱色，醇沉，沉淀溶解后膜过滤法除盐，收集膜内部分，经冷冻干燥后获得鲍鱼硫酸多糖。本发明所提供的方法获得的硫酸多糖纯度高，蛋白含量低于10％，制备条件温和，对鲍鱼硫酸多糖结构破坏小，产品品质好。

权利要求书
1.  一种制备鲍鱼硫酸多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、以鲍鱼内脏或性腺为原料，粉碎后，碱法或酶法使多糖与蛋白解离， 提取出粗多糖，提取液静置冷却后离心，取上清液；
S2、所述上清液经离子交换树脂吸附，水冲洗至流出液澄清后，分别用两 种浓度氯化钠溶液依次洗脱，收集流出液；
所述离子交换树脂为大孔径强碱性阴离子交换树脂，所述两种浓度氯化钠 溶液是指体积为离子交换树脂3～5倍的1.4mol/L氯化钠溶液和体积为离子交 换树脂2～4倍的3mol/L氯化钠溶液；
S3、所述流出液加入1.2～3倍体积的95％乙醇，静置8h以上，收集沉淀部 分；
S4、得到沉淀部分加入水或0～4％氯化钠水溶解后，采用碱法解离蛋白后， 静置冷却后离心，取上清液，酶法解离蛋白；
S5、调酸除蛋白，氧化脱色，醇沉，沉淀溶解后膜法除盐，收集膜内部分， 经冷冻干燥后获得鲍鱼硫酸多糖。

2.  根据权利要求1所述制备鲍鱼硫酸多糖的方法，其特征在于，步骤S1 中，所述碱法提取为加入2～4％氯化钠水溶液，氢氧化钠溶液调pH8～9，50～ 60℃加热搅拌1.5～3h。

3.  根据权利要求1所述制备鲍鱼硫酸多糖的方法，其特征在于，步骤S1 中，所述酶法提取为加入pH8.0Tris-醋酸缓冲液，加入原料干重2％胰蛋白酶35～ 45℃振摇3～5h，加入原料干重2％木瓜蛋白酶45～60℃振摇3～5h，90～100℃ 加热搅拌5～10分钟。

4.  根据权利要求1所述制备鲍鱼硫酸多糖的方法，其特征在于，步骤S4 所述碱法解离蛋白，具体为用氢氧化钠溶液调pH 8～9,50～60℃恒温搅拌1～ 3h。

5.  根据权利要求1所述制备鲍鱼硫酸多糖的方法，其特征在于，步骤S4 所述酶法解离蛋白，具体为加入沉淀干重0.1～0.5％胰蛋白酶，35～45℃搅拌4～ 6h。

6.  根据权利要求1所述制备鲍鱼硫酸多糖的方法，其特征在于，步骤S5 中：
所述调酸除蛋白，具体为加入0.2～2％亚硫酸氢钠作保护剂，盐酸调pH 1.5～2.0，低温离心，收集上清液；
所述氧化脱色，具体为加入体积比1％过氧化氢，调pH8.5，室温放置1日 后，盐酸调pH 6.5～7.0；
所述醇沉，具体为加入1.2～3倍95％乙醇，静置8h以上。

7.  根据权利要求1～6任一所述制备鲍鱼硫酸多糖的方法，其特征在于，在 步骤S3，流出液先采用超滤方法浓缩，然后醇沉。

说明书一种制备鲍鱼硫酸多糖的方法
技术领域
本发明涉及从海洋动物的加工副产物中制备多糖的技术领域，更具体，涉 及从鲍鱼的性腺或脏器中制备硫酸多糖的技术领域。
背景技术
鲍鱼是中国传统的名贵食材，位居四大海味之首。鲍鱼的脏器，包括性腺， 是鲍鱼加工的副产物，目前多作为低值饲料处理甚至被丢弃，造成了生物资源 的浪费和环境的污染。朱蓓薇等人的研究发现，鲍鱼脏器中的硫酸多糖具有抗 氧化、抗凝血、免疫调节等作用，非常具有开发价值。
通过检索，发现如下三篇与本专利申请相关的公开专利文献：1.朱蓓薇等 公开了鲍鱼多糖的提取方法(CN200510047409.X),是将鲍鱼去壳取肉(包括内 脏),用组织捣碎机破壁,加水混合均匀于20～80℃浸提2～6h,离心分离,不溶物再 次加水重复提取1～2次,上清液合并。浓缩提取液至含糖1.5～3.0％,加3～4倍 体积的95％乙醇,0～4℃下醇沉12～16h,离心后真空法或喷雾法干燥得产品。提 取还可以用加碱提取、超声波提取、酶提取。酶提取可以用单一酶、双酶、复 合酶、自溶酶和复合法提取。酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶等。2.陈锦权等公开了一 种鲍鱼多糖的制备工艺(CN 201110123164.X),它包括以下步骤:①将洗净的鲍 鱼肉或脏器打浆得到鲍鱼预处理液,常温下采用高压脉冲电场处理；②采用壳聚 糖对PEF处理后的鲍鱼料液进行絮凝除去粗蛋白,以提高多糖纯度；③采用电渗 析技术对预处理液进行处理,有效脱去重金属；④采用乙醇沉淀制备鲍鱼多糖。3. 集美大学翁武银公开了一种鲍鱼多糖、脂质和蛋白肽的联产制备方法(CN  201310142151.6)，技术工艺包括以鲍鱼内脏为原料，通过复合酶解、膜分离、 醇沉、离心分离、冷冻结晶、脱色、干燥等手段提取制备鲍鱼多糖、脂质和蛋 白肽。
通过比对，上述公开专利的技术方案和目标产品与本专利申请有本质的不 同，本专利申请具有新颖性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从鲍鱼内脏或性腺中制备鲍鱼硫酸多糖的方 法，该方法工艺成本低，适用于工业化生产，产品纯度高、品质好，可用于医 药、保健品行业等。
为了达到上述目的，本发明制备鲍鱼硫酸多糖的方法，包括以下步骤：
S1、以鲍鱼内脏或性腺为原料，粉碎后，碱法或酶法使多糖与蛋白解离， 提取出粗多糖，提取液静置冷却后离心，取上清液；
S2、所述上清液经离子交换树脂吸附，水冲洗至流出液澄清后，分别用两 种浓度氯化钠溶液依次洗脱，收集流出液；所述离子交换树脂为大孔径强碱性 阴离子交换树脂，所述两种浓度氯化钠溶液是指体积为离子交换树脂3～5倍的 1.4mol/L氯化钠溶液和体积为离子交换树脂2～4倍的3mol/L氯化钠溶液；
S3、所述流出液加入1.2～3倍体积的95％乙醇，静置8h以上，收集沉淀部 分；
S4、得到沉淀部分加入水或0～4％氯化钠水溶解后，采用碱法解离蛋白后， 静置冷却后离心，取上清液，酶法解离蛋白；
S5、调酸除蛋白，氧化脱色，醇沉，沉淀溶解后膜法除盐，收集膜内部分， 经冷冻干燥后获得鲍鱼硫酸多糖。
步骤S1中，所述碱法提取为加入2～4％氯化钠水溶液，氢氧化钠溶液调 pH8～9，50～60℃加热搅拌1.5～3h。
步骤S1中，所述酶法提取为加入pH8.0Tris-醋酸缓冲液，加入原料干重2％ 胰蛋白酶35～45℃振摇3～5h，加入原料干重2％木瓜蛋白酶45～60℃振摇3～ 5h，90～100℃加热搅拌5～10分钟。
步骤S4所述碱法解离蛋白，具体为用氢氧化钠溶液调pH 8～9,50～60℃恒 温搅拌1～3h。
步骤S4所述酶法解离蛋白，具体为加入沉淀干重0.1～0.5％胰蛋白酶，35～ 45℃搅拌4～6h。
步骤S5中：所述调酸除蛋白，具体为加入0.2～2％亚硫酸氢钠作保护剂， 盐酸调pH 1.5～2.0，低温离心，收集上清液；所述氧化脱色，具体为加入体积 比1％过氧化氢，调pH8.5，室温放置1日后，盐酸调pH 6.5～7.0；所述醇沉， 具体为加入1.2～3倍95％乙醇，静置8h以上。
在步骤S3，醇沉之前，为节约醇沉时乙醇的用量，流出液可采用超滤方法 浓缩，并可起到除盐效果，然后醇沉。
整合上述步骤，本发明一种最优的方式，鲍鱼硫酸多糖的制备方法，包括 以下步骤：
Step 1、以鲍鱼内脏或性腺为原料，粉碎后，碱法提取或酶法提取，提取液 静置冷却后离心，取上清液；
Step 2、Step 1得到的上清液反复流经大孔径强碱性阴离子交换树脂，使硫 酸多糖吸附于所述离子交换树脂，用水冲洗所述离子交换树脂，至流出液澄清 无色，然后用3～5倍树脂体积的1.4mol/L氯化钠溶液循环流经所述离子交换 树脂,收集流出液；2～4倍树脂体积的3mol/L氯化钠溶液循环流经所述离子交 换树脂,收集流出液；合并两种流出液；
Step 3、Step 2得到的流出液若体积过大，可用超滤方法除盐和浓缩；加入 1.2～3倍体积的95％乙醇，静置8h以上，收集沉淀部分；
Step 4、Step 3得到沉淀部分用0～4％氯化钠溶解，用氢氧化钠溶液调pH 8～ 9,50～60℃恒温搅拌1～3h，静置冷却后离心，取上清液，加入沉淀干重0.1～ 0.5％胰蛋白酶，35～45℃搅拌4～6h；
Step 5、Step 4后的溶液，冷却后加入0.2～2％亚硫酸氢钠作保护剂，盐酸 调pH 1.5～2.0，迅速低温离心，上清液加入1％(v/v)过氧化氢，调pH8.5，室 温放置1日后，盐酸调pH 6.5～7.0，加入1.2～3倍95％乙醇，静置8h以上， 沉淀部分用水溶解后，膜法除盐，收集膜内部分，经冷冻干燥后获得鲍鱼硫酸 多糖。
其中，Step 1所述碱法提取为加入2～4％氯化钠水溶液，氢氧化钠溶液调 pH8～9，50～60℃加热搅拌1.5～3h；所述酶法提取为加入pH8.0Tris-醋酸缓 冲液，加入原料干重2％胰蛋白酶35～45℃振摇3～5h，加入原料干重2％木瓜 蛋白酶45～60℃振摇3～5h，90～100℃加热搅拌5～10min。
本发明具有以下优点和效果：
以本发明所提供的方法获得的硫酸多糖纯度高，蛋白含量低于10％，制备 条件温和，对硫酸多糖功能基团破坏小，硫酸基含量大于5％。
本发明使用强碱性阴离子离子交换树脂，能够特异性的富集硫酸多糖，避 免了蛋白、中性多糖等杂质的引入，保证了产品的品质。而且与其它工艺方法 相比，使用树脂富集的方法能够减少醇沉时的乙醇用量，降低成本和能耗。
本发明使用的离子交换树脂、膜分离等市场上均有供工业化生产的材料和 设备，易于建立工艺生产线。
本发明使用的原料为鲍鱼性腺和内脏，它们是鲍鱼加工的副产物，而且是 鲍鱼主要含硫酸多糖的部位，以它们为原料生产硫酸多糖，得率高，而且成本 低，实现了对海洋生物资源的综合利用。
附图说明
图1是实施例1所得的鲍鱼硫酸多糖的核磁共振氢谱和碳谱；
图2是实施例1所得的鲍鱼硫酸多糖的碳谱；
图3是实施例1所得的鲍鱼硫酸多糖的红外光谱图；
图4是实施例2所得的鲍鱼硫酸多糖的红外光谱图。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明， 但不以任何方式限制本发明。
实施例1：
一种鲍鱼硫酸多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)以550克鲍鱼性腺冻干粉为原料，粉碎后，加入4％氯化钠水溶液， 氢氧化钠溶液调pH8～9，50～60℃加热搅拌2h；静置冷却后离心，取上清液；
(2)将上述步骤得到的上清液反复流经D204强碱性阴离子交换树脂，使 硫酸多糖吸附于所述离子交换树脂，用水冲洗所述离子交换树脂，至流出液澄 清无色，然后用4倍树脂体积的1.4mol/L氯化钠溶液循环流经所述离子交换树 脂,收集流出液；3倍树脂体积的3mol/L氯化钠溶液循环流经所述离子交换树脂, 收集流出液；合并两种流出液；
(3)将上述步骤得到的流出液，加入3倍体积的95％乙醇，静置36h，收 集沉淀部分；
(4)将上述步骤得到沉淀部分用3％氯化钠溶解，用氢氧化钠溶液调pH8， 50℃恒温搅拌2h，静置冷却后离心，取上清液，加入0.2％胰蛋白酶，40℃恒温 搅拌5h；
(5)将上述步骤后的溶液，冷却后加入1g亚硫酸氢钠盐酸调pH 1.5，迅 速低温离心，上清液加入1％(v/v)过氧化氢，调pH8.5，室温放置1日后，盐 酸调pH 6.5，加入1.2倍95％乙醇，静置12h，沉淀部分用水溶解后，膜超滤法 除盐，收集膜内部分，经冷冻干燥后获得鲍鱼硫酸多糖。
所述的制备方法获得的鲍鱼硫酸多糖，Folin-酚法测定蛋白含量为4.0％，明 胶比浊法测得硫酸基含量为12.4％。
如图1～3所示，本实施例的图谱情况。
实施例2：
一种鲍鱼硫酸多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)以120克鲍鱼性腺冻干粉为原料，粉碎后，加入pH8.0Tris-醋酸缓冲 液，加入原料干重2％胰蛋白酶37℃振摇4h，加入原料干重2％木瓜蛋白酶50℃ 振摇4h，100℃加热搅拌5分钟；静置冷却后离心，取上清液；
(2)将上述步骤得到的上清液反复流经D204强碱性阴离子交换树脂，使 硫酸多糖吸附于所述离子交换树脂，用水冲洗所述离子交换树脂，至流出液澄 清无色，然后用4倍树脂体积的1.4mol/L氯化钠溶液循环流经所述离子交换树 脂,收集流出液；3倍树脂体积的3mol/L氯化钠溶液循环流经所述离子交换树脂, 收集流出液；合并两种流出液；
(3)将上述步骤得到的流出液，加入3倍体积的95％乙醇，静置24h，收 集沉淀部分；
(4)将上述步骤得到沉淀部分用3％氯化钠溶解，用氢氧化钠溶液调pH8, 50℃恒温搅拌2h，静置冷却后离心，取上清液，加入0.2％胰蛋白酶，40℃搅拌 5h；
(5)将上述步骤后的溶液，冷却后加入0.25g亚硫酸氢钠盐酸调pH 2.0， 迅速低温离心，上清液加入1％(v/v)过氧化氢，调pH8.5,室温放置1日后，盐 酸调pH 6.5，加入1.2倍95％乙醇，静置12h，沉淀部分用水溶解后，膜透析法 除盐，收集膜内部分，经冷冻干燥后获得鲍鱼硫酸多糖精制品。
所述的制备方法获得的鲍鱼硫酸多糖，Folin-酚法测定蛋白含量为4.6％，明 胶比浊法测得硫酸基含量为7.1％。
如图4所示，本实施例的图谱情况。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局 限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本 发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护 范围之内。