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1、(10)申请公布号 CN 102071215 A (43)申请公布日 2011.05.25 CN 102071215 A *CN102071215A* (21)申请号 201010564705.8 (22)申请日 2010.11.30 C12N 15/82(2006.01) C12N 15/87(2006.01) (71)申请人 上海交通大学 地址 200240 上海市闵行区东川路 800 号 (72)发明人 王贵荣 王志民 代田纯 候彩玲 徐美红 (74)专利代理机构 上海交达专利事务所 31201 代理人 王锡麟 王桂忠 (54) 发明名称 大豆离体生长点基因枪转化方法 (57) 摘要 一。
2、种生物工程技术领域的大豆离体生长点基 因枪转化方法， 通过用包含目的基因载体制成子 弹， 装到基因枪上， 然后轰击无菌苗， 经过接种诱 导， 得 T0 代植株 ； 然后将把 T0 代植株经诱导生 根和开瓶炼苗后经诱导其开花结实， 得到 T1 代种 子 ； 最后将 T1 代种子移载到人工气候室或大田 中， 得到 T2 代植株及其纯合阳性转化子。本发明 利用了大豆离体生长点植株再生比较容易的特 性， 可显著提高转化效率。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 CN 102071219 A1/1 页 2 1. 一种大豆。
3、离体生长点基因枪转化方法， 其特征在于， 通过用包含目的基因载体制成 子弹， 装到基因枪上， 然后轰击无菌苗， 经过接种诱导， 得 T0 代植株 ； 然后将把 T0 代植株经 诱导生根和开瓶炼苗后经诱导其开花结实， 得到T1代种子 ； 最后将T1代种子移载到人工气 候室或大田中， 得到 T2 代植株及其纯合阳性转化子。 2. 根据权利要求 1 所述的大豆离体生长点基因枪转化方法， 其特征是， 所述的转化方 法包括如下步骤 ： 步骤一， 用氯气对大豆种子表面进行消毒， 然后接种到种子萌发培养基中， 得到无菌 苗 ； 步骤二， 剥离足够多的生长点， 铺满到一个玻璃培养皿中 ； 步骤三， 用包含目的。
4、基因载体制成子弹， 装到基因枪上， 然后轰击培养皿的中央部位 3-4 次 ； 步骤四， 将基因枪轰击后的生长点接种到成苗培养基， 诱导成苗， 得到 T0 代植株 ； 步骤五， 把 T0 代植株转入生根用的培养瓶中诱导生根 ； 步骤六， T0 代生根植株开瓶炼苗 3-5 天后， 移载到人工气候室中， 并诱导其开花结实， 得到 T1 代种子 ； 步骤七， T1 代种子移载到人工气候室或大田中， 得到 T2 代植株 ； 步骤八， 对 T2 代植株进行分子鉴定和转基因功能验证， 从而得到纯合阳性转化子。 3. 根据权利要求 2 所述的大豆离体生长点基因枪转化方法， 其特征是， 所述的生长点 是指选取带。
5、有 4-6 片叶原基且长度为 0.4-0.6 厘米的无菌苗， 扒开叶原基使生长点暴露在 无菌苗外部。 4. 根据权利要求 2 所述的大豆离体生长点基因枪转化方法， 其特征是， 所述的子弹是 指 ： 包裹目标 DNA 的直径为 1.5m 的黄金颗粒， 60g 金粉包被 1g DNA。 5.根据权利要求1或2所述的大豆离体生长点基因枪转化方法， 其特征是， 所述的基因 枪采用 BD81-GJ-1000 型气体加速枪， 该基因枪将包被外源 DNA 的金属微粒加速， 使其穿过 细胞壁而进入细胞内， 将外源 DNA 分子送进细胞核或细胞器中， 整合到染色体或细胞基因 组上， 从而实现外源 DNA 的转移。
6、。 6. 根据权利要求 2 所述的大豆离体生长点基因枪转化方法， 其特征是， 所述的包含目 的基因载体， 为植物表达载体 PBI221。 7. 根据权利要求 2 所述的大豆离体生长点基因枪转化方法， 其特征是， 所述的成苗培 养基为添加 0.5mg/L 6- 苄氨基嘌呤的 MS 培养基。 8. 根据权利要求 2 所述的大豆离体生长点基因枪转化方法， 其特征是， 所述的成苗培 养基为添加 1.0mg/L 赤霉素的 1/2MS 培养基。 9. 根据权利要求 2 所述的大豆离体生长点基因枪转化方法， 其特征是， 所述的生根用 的培养瓶为， 20 厘米高， 直径 8 厘米的桶状瓶， 用可降解的聚内交酯。
7、制成， 该培养瓶内充有 生根培养基。 10. 根据权利要求 2 所述的大豆离体生长点基因枪转化方法， 其特征是， 所述的生根培 养基为添加 0.3mg/L 吲哚丁酸 1/2MS 培养基。 权 利 要 求 书 CN 102071215 A CN 102071219 A1/3 页 3 大豆离体生长点基因枪转化方法 技术领域 0001 本发明涉及的是一种生物工程领域的方法， 具体是一种大豆离体生长点基因枪转 化方法。 背景技术 0002 大豆是当今世界上第五大作物， 仅次于小麦、 水稻、 玉米和大麦。我国既是大豆生 产大国， 也是消费大国， 每年都要进口大量转基因大豆。与发达国家相比， 我国大豆科技。
8、水 平相对落后， 大豆品质缺乏国际竞争力。 加强转基因大豆的自主研究和利用， 是我国今后在 大豆产业应该坚持的发展方向。目前制约我国大豆转基因技术进一步发展的主要因素是， 农杆菌介导的大豆子叶节、 下胚轴， 愈伤组织等转基因受体植株再生系统的不完善， 多数再 生植株畸形， 不能伸长、 生根， 最后死亡， 导致转基因效率低下。 0003 经对现有技术文献的检索发现， 王萍等在 大豆科学上发表了 “基因枪法将 GmDREB基因导入大豆的研究” ， 获得了4个阳性转化子。 该文章中使用的转基因受体为体细 胞胚。体细胞胚诱导受基因型的限制， 目前只有少数几个品种诱导成功。另外体细胞胚的 植株再生频率也。
9、很低， 所以转化效率很低。 发明内容 0004 本发明针对现有技术存在的上述不足， 提供一种大豆离体生长点基因枪转化方 法， 以数量足够多的， 暴露在外面的大豆离体生长点为受体， 通过基因枪将目的基因导入其 中， 然后在后代种子中筛选得到阳性纯合转化子。 由于大豆离体生长点植株再生比较容易， 可以显著提高转化效率。 0005 本发明是通过以下技术方案实现的， 本发明通过用包含目的基因载体制成子弹， 装到基因枪上， 然后轰击无菌苗， 经过接种诱导， 得T0代植株 ； 然后将把T0代植株经诱导生 根和开瓶炼苗后经诱导其开花结实， 得到T1代种子 ； 最后将T1代种子移载到人工气候室或 大田中， 得。
10、到 T2 代植株及其纯合阳性转化子， 具体包括如下步骤 ： 0006 步骤一， 用氯气对大豆种子表面进行消毒， 然后接种到种子萌发培养基中， 得到无 菌苗 ； 0007 所述的大豆种子的种皮完整且健康无病斑。 0008 步骤二， 剥离足够多的生长点， 铺满到一个玻璃培养皿中 ； 0009 所述的生长点是指选取带有 4-6 片叶原基且长度为 0.4-0.6 厘米的无菌苗， 扒开 叶原基使生长点暴露在无菌苗外部。 0010 步骤三， 用包含目的基因载体制成子弹， 装到基因枪上， 然后轰击培养皿的中央部 位 3-4 次 ； 0011 所述的子弹是指 ： 包裹目标 DNA 的直径为 1.5m 的黄金颗。
11、粒， 60g 金粉包被 1g DNA。 0012 所述的基因枪采用BD81-GJ-1000型气体加速枪， 该基因枪将包被外源DNA的金属 说 明 书 CN 102071215 A CN 102071219 A2/3 页 4 微粒加速， 使其穿过细胞壁而进入细胞内， 将外源 DNA 分子送进细胞核或细胞器中， 整合到 染色体或细胞基因组上， 从而实现外源 DNA 的转移。 0013 所述的包含目的基因载体， 为植物表达载体 PBI221 ； 0014 步骤四， 将基因枪轰击后的生长点接种到成苗培养基， 诱导成苗， 得到 T0 代植株 ； 0015 所述的成苗培养基为添加 0.5mg/L 6- 苄。
12、氨基嘌呤的 MS 培养基。 0016 所述的成苗培养基为添加 1.0mg/L 赤霉素的 1/2MS 培养基。 0017 所述的 MS 培养基采用 Murashige 和 Skoog(1962) 公开的培养基， MS 培养基在现 有 0018 的生物以及农业等领域有着广泛的应用。具体成分如下 ： 0019 0020 所述的 1/2MS 培养基为大量元素减半的 MS 培养基。 0021 步骤五， 把 T0 代植株转入生根用的培养瓶中诱导生根 ； 0022 所述的生根用的培养瓶为， 20 厘米高， 直径 8 厘米的桶状瓶， 用可降解的聚内交酯 制成， 该培养瓶内充有生根培养基 ； 0023 所述的生。
13、根培养基为添加 0.3mg/L 吲哚丁酸 1/2MS 培养基 ； 0024 步骤六， T0 代生根植株开瓶炼苗 3-5 天后， 移载到人工气候室中， 并诱导其开花结 实， 得到 T1 代种子 ； 0025 所述的炼苗是指 ： 打开培养瓶让幼苗在人工气候室中锻炼， 使其尽快适应自然环 境。 0026 步骤七， T1 代种子移载到人工气候室或大田中， 得到 T2 代植株 ； 0027 所述的移载到人工气候室是指 ： 将 T0 代植株连同可降解培养瓶， 一起移载到人工 说 明 书 CN 102071215 A CN 102071219 A3/3 页 5 气候室的土壤中。 0028 步骤八， 对 T2。
14、 代植株进行分子鉴定和转基因功能验证， 从而得到纯合阳性转化 子。 0029 与现有技术相比， 本发明具有的优点为 ： 1. 生长点作为转化受体对受体材料的影 响小， 具有很高的植株再生频率， 可以提高转化效率 ； 2. 省去了农杆菌浸泡， 共培养， 除菌 等步骤， 操作简便， 可控度高。 具体实施方式 0030 下面对本发明的实施例作详细说明， 本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施， 给出了详细的实施方式和具体的操作过程， 但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。 0031 本实施例的大豆种子来自本实验室。 0032 本实施例包括如下步骤 ： 0033 步骤一， 用 75ml 次氯酸。
15、钠和 25ml 浓盐酸反应生成的氯气对大豆种子表面消毒 1 小时， 然后接种到添加 0.5mg/L 6- 苄氨基嘌呤的 MS 的种子萌发培养基 ( 即 MS+0.5mg/L 6-BA) 中， 得到无菌苗 ； 0034 步骤二， 剥离足够多的带 4-6 片叶原基， 长度为 0.4-0.6 厘米的生长点， 扒开叶原 基使生长点暴露在外面， 然后将这些生长点放到一个直径为 5-6 厘米的玻璃培养皿中， 铺 满整个皿底。 0035 步骤三， 用包含目的基因的载体包裹到子弹上， 装到基因枪上， 然后轰击培养皿的 中央部位 3-4 次 ； 0036 步骤四， 将基因枪轰击后的生长点接种到添加 1.0mg/。
16、L 赤霉素的 1/2MS 成苗培养 基 ( 即 1/2MS+1.0mg/L GA3) 中， 诱导成苗， 得到 T0 代植株 ； 0037 步骤五， 把 T0 代植株转入添加 0.3mg/L 吲哚丁酸 1/2MS 的生根培养基 ( 即 1/2MS+0.3mg/L IBA) 中， 诱导生根， 培养瓶用可降解材料聚内交酯制成 ； 0038 步骤六， T0 代生根植株开瓶炼苗 3-5 天后， 连同可降解培养瓶一起移载到人工气 候室中， 并诱导其开花结实， 得到 T1 代种子 ； 0039 步骤七， T1 代种子播种在人工气候室中， 得到 T2 代植株 ； 0040 步骤八， 对 T2 代植株进行 PCR 和 Northern 检测和转基因功能验证， 从而得到纯合 阳性转化子。 0041 本实施例对 100 粒大豆种子进行了消毒， 得到无菌苗后显微镜下剥离得到带 4 片 叶原基， 长度为 0.4-0.6 厘米的生长点。基因枪转化后得到了 10 个纯合阳性转化子。 说 明 书 CN 102071215 A 。