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1、(10)申请公布号 CN 103966319 A (43)申请公布日 2014.08.06 CN 103966319 A (21)申请号 201410152710.6 (22)申请日 2014.04.16 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 龙驹 地址 535099 广西壮族自治区钦州市安州大 道 1 号 (72)发明人 龙驹 (74)专利代理机构 桂林市持衡专利商标事务所 有限公司 45107 代理人 唐智芳 (54) 发明名称 用于检测常见缺失型 - 地中海贫血的试剂 盒及其使用方法 (57) 摘要 本发明公开了一种用于检测常见缺失。
2、型 - 地中海贫血的试剂盒及其使用方法。所述试 剂盒包括一对可以同时扩增 - 珠蛋白基因簇中 1 区段的特征序列 A1 和 2 区段的特征序列 A2 的引物， 一对扩增 - 珠蛋白基因簇中 -SEA基 因型的引物， 一对扩增 - 珠蛋白基因簇中 -THAI 基因型的引物 ； 一条特异性检测 1 区段的特征 序列 A1 的荧光探针， 一条特异性检测 2 区段的 特征序列 A2 的荧光探针， 一条特异性检测 -SEA 基因型扩增产物的荧光探针， 以及一条特异性检 测 -THAI基因型扩增产物的荧光探针。本发明所 述试剂盒对 - 地中海贫血珠蛋白基因缺失检测 具有高度的灵敏性、 稳定性、 准确性及较。
3、高的特异 性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 11 页 序列表 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书11页 序列表5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103966319 A CN 103966319 A 1/3 页 2 1. 用于检测常见缺失型 - 地中海贫血的试剂盒， 包括扩增引物和荧光探针， 其特征 在于 ： 所述的扩增引物为 ： 一对可以同时扩增 - 珠蛋白基因簇中 1 区段的特征序列 A1 和 2 区段的特征序列 A2 的引物 A1A2-F 和 A1A2-R， 一对扩增 - 珠蛋白基因簇中 。
4、-SEA 基因型的 Gap-PCR 引物 SEA-F 和 SEA-R， 以及一对扩增 - 珠蛋白基因簇中 -THAI基因型的 Gap-PCR 引物 THAI-F 和 THAI-R ； 所述的荧光探针为 ： 一条特异性检测 1 区段的特征序列 A1 的荧光探针 A1-Prob， 一 条特异性检测 2 区段的特征序列 A2 的荧光探针 A2-Prob， 一条特异性检测 -SEA基因型 扩增产物的荧光探针 SEA-Prob， 以及一条特异性检测 -THAI基因型扩增产物的荧光探针 THAI-Prob ； 其中 ： 所述的可以同时扩增 - 珠蛋白基因簇中 1 区段的特征序列 A1 和 2 区段的特征 。
5、序列 A2 的引物对中， A1A2-F ： 5 -GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3 ； A1A2-R ： 5 -GCAGGCAGTGGCTTAGGA-3 ； 所述的扩增 - 珠蛋白基因簇中 -SEA基因型的 Gap-PCR 引物对中， SEA-F ： 5 -CTCAGTATTGGAGGGAAGGA-3 ； SEA-R ： 5 -CAGTGTTGTAGTCATGGCTTA-3 ； 所述的扩增 - 珠蛋白基因簇中 -THAI基因型的 Gap-PCR 引物对中， THAI-F ： 5 -AAGCGAGAGGAATCACATTC-3 ； THAI-R ： 5 -CTTGGATCTGCACCTC。
6、TG-3 ； 所述的特异性检测特 1 区段的征序列 A1 的荧光探针 A1-Prob 为 ： A1-Prob ： 5 6-FAM-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-3 BHQ-1 ； 所述的特异性检测 2 区段的特征序列 A2 的荧光探针 A2-Prob 为 ： A2-Prob ： 5 ROXCCTGGGCCGCACTGACCCTC-3 BHQ-2 ； 所述的特异性检测 -SEA基因型扩增产物的荧光探针 SEA-Prob 为 ： SEA-Prob ： 5 -HEX-TCCTCCTGCCCCAGCCTCCAA-BHQ-1-3 ； 所述的的特异性检测 -THAI基因型扩增产物的荧光探针 T。
7、HAI-Prob 为 ： THAI-Prob ： 5 -CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3 。 2. 根据权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述 1 区段的序列为 ： 5 -ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGC GAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGCTCCCTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCA CAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAACCC。
8、CACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGT CCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAG AAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCT GCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGC GAGATGGCGCCTTCCTCGCAGGGCAGA。
9、GGATCACGCGGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTG GGCCCTCGGCCCCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTC 权 利 要 求 书 CN 103966319 A 2 2/3 页 3 CCCGCCGAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAA ATACCGTTAA-3 ； 所述 2 区段的序列为 ： 5 -ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGAC。
10、CAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGC GAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGCTCCCTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCA CAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAACCCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGT CCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAG AAGGTGGCCGACGCGCTGACCA。
11、ACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCT GCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGC GAGATGGCGCCTTCCTCTCAGGGCAGAGGATCACGCGGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTG GGCCGCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCG AGTTCACCCC。
12、TGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGT TAA-3 。 3. 根据权利要求 2 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述 1 区段的特征序列 A1 为 ： 5 -GGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCCTCGGCCCCACTGACCCTCTTCTCT GCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGC-3 ； 所述 2 区段的特征序列 A2 为 ： 5 -GGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCGCAC。
13、TGACCCTCTTCTCTGCACAGC TCCTAAGCCACTGCCTGC-3 。 4.根据权利要求13中任一项所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述的试剂盒还包括PCR 缓冲液、 酶液、 MgCl2和 dNTP。 5. 采用权利要求 1 所述试剂盒进行快速检测常见缺失型 - 地中海贫血的方法， 包括 以下步骤 ： 1) 抽提样本基因组 DNA， 制备 DNA 模板 ； 2) 配制反应体系， 具体为 ： 取可以同时扩增 - 珠蛋白基因簇中 1 区段的特征序列 A1 和 2 区段的特征序列 A2 的引物 A1A2-F 和 A1A2-R、 扩增 - 珠蛋白基因簇中 -SEA基因型的 Gap-P。
14、CR 引物 SEA-F 和SEA-R、 扩增-珠蛋白基因簇中-THAI基因型的Gap-PCR引物THAI-F和THAI-R ； 特异性 检测1区段的特征序列A1的荧光探针A1-Prob、 特异性检测2区段的特征序列A2的荧 光探针 A2-Prob、 特异性检测 -SEA基因型扩增产物的荧光探针 SEA-Prob、 特异性检测 -THAI 基因型扩增产物的荧光探针 THAI-Prob ； 以及 PCR 缓冲液、 酶液、 MgCl2、 dNTP、 水和 DNA 模板 配制成反应体系 ； 3) 样本检测 ： 分别将配制的反应体系进行 PCR 扩增， 记录每个 PCR 反应管内的荧光信 号到达设定的域。
15、值时所经历的循环次数 Cq ； 4) 数据分析及结果判定 ： 根据定量检测所获得的 Cq 值， 以正常基因型样本为对照标 本， 按下述公式进行计算 ： 待检样本的基因 Cq Cq_A2-Cq_A1； 待检样本的基因 Cq Cq_待检样本-Cq_正常样本； 权 利 要 求 书 CN 103966319 A 3 3/3 页 4 待检样本的 A1 和 A2 相对拷贝数比值 R 2-Cq ； 根据 R 的值结合下述表 1 中进行结果判定 ： 表 1 ： 其中， 当 R 在 1.8 2.5 范围时， 其结果匹配上表理论值中的 “2” ； 当 R 在 0.75 1.26 范围时， 其结果匹配上表理论值中的。
16、 “1” ； 当 R 在 0.37 0.55 范围时， 其结果匹配上表理 论值中的 “0.5” ； 若 R 的计算结果不在上述定义的 R 值范围内时， 应采用其他方法进行辅助 判断。 6. 根据权利要求 5 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 3) 中， PCR 扩增条件为 ： 95预变性 8 10 分钟， 然后 95 15 30 秒， 60退火 50 70 秒， 39 49 个循环。 7. 根据权利要求 5 所述的方法， 其特征在于 ： PCR 扩增条件为 ： 95预变性 10 分钟， 然 后 95 15 秒， 60退火 60 秒， 40 个循环。 权 利 要 求 书 CN 10396631。
17、9 A 4 1/11 页 5 用于检测常见缺失型 - 地中海贫血的试剂盒及其使用方 法 技术领域 0001 本发明涉及医学检测技术领域， 具体涉及一种用于检测常见缺失型 - 地中海贫 血的试剂盒及其使用方法。 背景技术 0002 地中海贫血简称地贫， 是最常见的单基因遗传疾病之一， 常见的地贫种类有 - 地贫和 - 地贫， 分别由 - 蛋白基因簇和 - 珠蛋白基因簇异常表达引起。在我国， 广西、 广东和海南是地中海贫血的高发省份， 其中广西 - 地贫的发病率是 15.5%。中国人 群中， 缺失型 - 地贫的基因型常见基因型为 -SEA、 -3.7和 -4.2， 以及广西区内相对常见 的泰国型缺。
18、失 （-THAI） 。 0003 同源基因定量技术是一种根据基因的同源性， 采用共同的扩增引物对同源基因进 行扩增， 最后采用荧光标记法或者探针法对基因的含量进行相对定量的方法。- 珠蛋白 基因簇 (NG_000006.1) 由调控因子 （HS-40） ， 基因 （1 和 2） ， 基因 (2)， 假基因 (1,2and1) 和 组成， 其排列顺序为 :HS402121 21。 地中海贫血基因据其同源性， 可划分为 X1， X2， Y1， Y2， Z1 和 Z2 区间， 其 中 -3.7( 也称为右侧缺失 ) 的形成源于 Z1 和 Z2 之间的同源重组， 其 DNA 结构表现为仅仅 包含一个 。
19、1 区段， 而 -4.2( 也称为左侧缺失 ) 则来源于 X1 和 X2 之间的同源重组， 如图 1 所示， 其 DNA 结构表现为存在一个 2-1 的融合基因。对 -3.7和 -4.2携带者而言， 其 表现型及危害相似。然而， 由于 -3.7和 -4.2均由大区段同源基因重组产生， 因而不同个 体所携带的 -3.7或 -4.2基因序列并不一致， 因此， 目前常用的诊断方法为通过跨越断点 式 PCR（Gap-PCR） 将其扩增出来， 但因其区段长度较长， 导致检测时间也较长。另一方面， 由于 -3.7和 -4.2的危害相似， 如果可以将其简并进行检测， 则可以实现短区段快速扩增 检测。 发明内。
20、容 0004 本发明要解决的技术问题是提供一种用于检测常见缺失型 - 地中海贫血的试 剂盒及其使用方法。采用该试剂盒可以相对定量检测 - 珠蛋白基因簇中 1 和 2 功能 基因的拷贝数及拷贝数的变化。 0005 本发明所述的用于检测常见缺失型 - 地中海贫血的试剂盒， 包括扩增引物和荧 光探针， 所述的扩增引物为 ： 一对可以同时扩增 - 珠蛋白基因簇中 1 区段的特征序列 A1 和 2 区段的特征序列 A2 的引物 A1A2-F 和 A1A2-R， 一对扩增 - 珠蛋白基因簇中 -SEA 基因型的 Gap-PCR 引物 SEA-F 和 SEA-R， 以 及一对扩增 - 珠蛋白基因簇中 -TH。
21、AI基因型 的 Gap-PCR 引物 THAI-F 和 THAI-R ； 所述的荧光探针为 ： 一条特异性检测 1 区段的特征序 列 A1 的荧光探针 A1-Prob， 一条特异性检测 2 区段的特征序列 A2 的荧光探针 A2-Prob， 一条特异性检测 -SEA基因型扩增产物的荧光探针 SEA-Prob， 以及一条特异性检测 -THAI基 说 明 书 CN 103966319 A 5 2/11 页 6 因型扩增产物的荧光探针 THAI-Prob ； 0006 其中 ： 0007 所述的可以同时扩增 - 珠蛋白基因簇中 1 区段的特征序列 A1 和 2 区段的 特征序列 A2 的引物对中， 。
22、0008 A1A2-F ： 5 -GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3 ； 0009 A1A2-R ： 5 -GCAGGCAGTGGCTTAGGA-3 ； 0010 所述的扩增 - 珠蛋白基因簇中 -SEA基因型的 Gap-PCR 引物对中， 0011 SEA-F ： 5 -CTCAGTATTGGAGGGAAGGA-3 ； 0012 SEA-R ： 5 -CAGTGTTGTAGTCATGGCTTA-3 ； 0013 所述的扩增 - 珠蛋白基因簇中 -THAI基因型的 Gap-PCR 引物对中， 0014 THAI-F ： 5 -AAGCGAGAGGAATCACATTC-3 ； 0015 T。
23、HAI-R ： 5 -CTTGGATCTGCACCTCTG-3 ； 0016 所述的特异性检测特 1 区段的征序列 A1 的荧光探针 A1-Prob 为 ： 0017 A1-Prob ： 5 6-FAM-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-3 BHQ-1 ； 0018 所述的特异性检测 2 区段的特征序列 A2 的荧光探针 A2-Prob 为 ： 0019 A2-Prob ： 5 ROXCCTGGGCCGCACTGACCCTC-3 BHQ-2 ； 0020 所述的特异性检测 -SEA基因型扩增产物的荧光探针 SEA-Prob 为 ： 0021 SEA-Prob ： 5 -HEX-TCCT。
24、CCTGCCCCAGCCTCCAA-BHQ-1-3 ； 0022 所述的的特异性检测 -THAI基因型扩增产物的荧光探针 THAI-Prob 为 ： 0023 THAI-Prob ： 5 -CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3 。 0024 本发明所述的荧光探针中， FAM 指羧基荧光素， HEX 指六氯 -6- 甲基荧光素， ROX 指 羧基 -X- 罗丹明， CY5 是指花青染料分子 5， BHQ-1 和 BHQ-2 是指荧光淬灭基团。 0025 上述技术方案中， 所述 1 区段的序列为 ： 5 -ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACC。
25、AAC GTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGCTCCCT CCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCACAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAACC CCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGAC CTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAA。
26、CGCCGTGGCGCACGT GGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCA AGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGATGGCGCCTTCCTCGCAGGGCAGAGGATCACGCGG GTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCCTCGGCCCCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTC CTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTT。
27、CACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGA CAAGTTCCTG GCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAA-3 ； 该 1 区段的特征序列 A1 为 ： 5 -GGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCCTCGGCCCCACTGACCCTCTTCTCTG CACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGC-3 。 0026 上述技术方案中， 所述 2 区段的序列为 ： 5 -ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAA CGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCA。
28、CGCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGCTCCC TCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCACAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAAC CCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGA CCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACG 说 明 书 CN 103966319 A 。
29、6 3/11 页 7 TGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTC AAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGATGGCGCCTTCCTCTCAGGGCAGAGGATCACGCG GGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCGCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGC CACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCACCTCCCCGCCGAGTTCACCCCTGCGG。
30、TGCACGCCTCCCTGGACAAGTT CCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAA-3 ； 该 2 区段的特征序列 A2 区段为 ： 5 -GGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCGCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCT AAGCCACTGCCTGC-3 。 0027 本发明所述的用于检测常见缺失型 - 地中海贫血的试剂盒还包括一些现有试 剂盒中常规且必须的组分， 如缓冲液、 酶液、 MgCl2和dNTP等， 具体的， 酶液即为DNA聚合酶， 具体可采用康为世纪所生产的 Gol。
31、dStar Taq DNA Polymerase， 缓冲液为与 GoldStar Taq DNA Polymerase 配套的缓冲液。 0028 本发明还提供采用上述试剂盒进行快速检测常见缺失型 - 地中海贫血 ( 如 -SEA、 - 和 THAI) 的方法， 包括以下步骤 ： 0029 1) 抽提样本基因组 DNA， 制备 DNA 模板 ； 0030 2) 配制反应体系， 具体为 ： 0031 取可以同时扩增 - 珠蛋白基因簇中 1 区段的特征序列 A1 和 2 区段中的特 征序列 A2 的引物 A1A2-F 和 A1A2-R、 扩增 - 珠蛋白基因簇中 -SEA基因型的 Gap-PCR 引。
32、物 SEA-F 和 SEA-R、 扩增 - 珠蛋白基因簇中 -THAI基因型的 Gap-PCR 引物 THAI-F 和 THAI-R ； 特异性检测 1 区段的特征序列 A1 的荧光探针 A1-Prob、 特异性检测 2 区段的特征序列 A2 的荧光探针 A2-Prob、 特异性检测 -SEA基因型扩增产物的荧光探针 SEA-Prob、 特异性检 测 -THAI基因型扩增产物的荧光探针 THAI-Prob ； 以及 PCR 缓冲液、 酶液、 MgCl2、 dNTP、 水和 DNA 模板配制成反应体系 ； 0032 3) 样本检测 ： 分别将配制的反应体系进行 PCR 扩增， 记录每个 PCR 。
33、反应管内的荧 光信号到达设定的域值时所经历的循环次数 Cq(Cq 值的大小可以反映所检测模板数的多 少 ) ； 0033 4) 数据分析及结果判定 ： 根据定量检测所获得的 Cq 值， 以正常基因型样 本为对 照标本， 按下述公式进行计算 ： 0034 待检样本的基因 Cq Cq_A2-Cq_A1； 0035 待检样本的基因 Cq Cq_待检样本-Cq_正常样本； 0036 待检样本的 A1 和 A2 相对拷贝数比值 0037 根据 R 的值结合下述表 1 中进行结果判定 ： 0038 表 1 ： 0039 说 明 书 CN 103966319 A 7 4/11 页 8 0040 其中， 当 。
34、R 在 1.8 2.5 范围时， 其结果匹配上表理论值中的 “2” ； 当 R 在 0.75 1.26 范围时， 其结果匹配上表理论值中的 “1” ； 当 R 在 0.37 0.55 范围时， 其结果匹配上 表理论值中的 “0.5” ； 若 R 的计算结果不在上述定义的 R 值范围内时， 应采用其他方法进行 辅助判断。表中 “+” 代表阳性， 表示存在扩增产物 ；“-” 代表阴性， 即不存在该扩增产物。 0041 本发明的基本原理是基于 - 珠蛋白基因缺失是导致 - 地贫根本原因的发病 机制。本试剂盒设计的理论依据为正常个体的基因型为 /， 其 A1=A2， 无 SEA 扩增 产物且无 THA。
35、I 扩增产物 ； -/ 基因型中， A1=2A2， 或者 A2=2A1 无 SEA 和 THAI 扩增产 物 ； -/- 基因型中， 有 A1 扩增产物， 无 A2 扩增产物 （由于 -/- 基因型系罕见基因 型， 而在 - 基因型中， 以 A1 为特征序列的为主， 因此在 -/- 基因型中， 同时出现 A1 和 A2 扩增曲线的样本相当罕见） ， 无 SEA 和 THAI 扩增产物 ； -SEA/-SEA基因型中， 无 A1 扩增产 物， 无 A2 扩增产物， 有 SEA 扩增产物但无 THAI 扩增产物 ； -THAI/-SEA基因型中， 无 A1 扩增 产物， 无 A2 扩增产物， 有 。
36、SEA 扩增产物且有 THAI 扩增产物 ； -THAI/-THAI基因型中， 无 A1 扩 增产物， 无 A2 扩增产物， 无 SEA 扩增产物但有 THAI 扩增产物。 0042 本发明所述的试剂盒， 即是采用四重 TaqMan 荧光定量技术， 定量检测样本中 A1、 A2 的拷贝数， 以及 SEA 及 THAI 的有无， 综合实现常见缺失型 - 地贫的快速分子诊断。由 于 TaqMan 荧光定量技术在使用时， 其定量结果并 不是遵循完美的理论值， 其结果会在理 论值的左右浮动， 因此， 本申请人在对大量已知基因型样本验证后统计才得以得出上述方 法中所述的 R 的计算值与表 1 中理论值中。
37、的对应关系， 如果 R 的计算结果不在上述定义的 R 值范围内时， 应采用其他方法进行辅助判断。 0043 上述方法的步骤 1) 中， 采用现有常规方法制备 DNA 模板。 0044 上述方法的步骤 2) 中 ： 0045 所述的可以同时扩增 - 珠蛋白基因簇中 1 区段的特征序列 A1 和 2 区段的 特征序列 A2 的引物对中， 0046 A1A2-F ： 5 -GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3 ； 0047 A1A2-R ： 5 -GCAGGCAGTGGCTTAGGA-3 ； 说 明 书 CN 103966319 A 8 5/11 页 9 0048 所述的扩增 - 珠蛋白基因簇中。
38、 -SEA基因型的 Gap-PCR 引物对中， 0049 SEA-F ： 5 -CTCAGTATTGGAGGGAAGGA-3 ； 0050 SEA-R ： 5 -CAGTGTTGTAGTCATGGCTTA-3 ； 0051 所述的扩增 - 珠蛋白基因簇中 -THAI基因型的 Gap-PCR 引物对中， 0052 THAI-F ： 5 -AAGCGAGAGGAATCACATTC-3 ； 0053 THAI-R ： 5 -CTTGGATCTGCACCTCTG-3 ； 0054 所述的特异性检测 1 区段的特征序列 A1 的荧光探针 A1-Prob 为 ： 0055 A1-Prob ： 5 6-FA。
39、M-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-3 BHQ-1 ； 0056 所述的特异性检测 2 区段的特征序列 A2 的荧光探针 A2-Prob 为 ： 0057 A2-Prob ： 5 ROXCCTGGGCCGCACTGACCCTC-3 BHQ-2 ； 0058 所述的特异性检测 -SEA基因型扩增产物的荧光探针 SEA-Prob 为 ： 0059 SEA-Prob ： 5 -HEX-TCCTCCTGCCCCAGCCTCCAA-BHQ-1-3 ； 0060 所述的的特异性检测 -THAI基因型扩增产物的荧光探针 THAI-Prob 为 ： 0061 THAI-Prob ： 5 -CY5-T。
40、GTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3 ； 0062 上述荧光探针中， FAM 指羧基荧光素， HEX 指六氯 -6- 甲基荧光素， ROX 指羧 基 -X- 罗丹明， CY5 是指花青染料分子 5， BHQ-1 和 BHQ-2 是指荧光淬灭基团。 0063 上述方法的步骤 2) 中， 所述反应体系中各组分的浓度优选为 ： 各引物 ： 0.25 0.8mmol/L ； DNA 模板 ： 20 200ng ； 镁离子 ： 1.5 1.9mmol/L ； 反应体系的终体积优选为 20L。 0064 上述方法的步骤 3) 中， PCR 扩增条件为 ： 95预变性 8 10 。
41、分钟， 然后 95 15 30 秒， 60退火 50 70 秒， 39 49 个循环， 于 60退火步骤末采集荧光信号。更优选的 PCR 扩增条件为 ： 95预变性 10 分钟， 然后 95 15 秒， 60退火 60 秒， 40 个循环。 0065 与现有技术相比， 本发明的特点在于 ： 0066 1、 本发明所述试剂盒中需要定量的 2 条基因 (A1 和 A2) 只采用 1 组引物即可以扩 增， 最大限度保障了扩增效率的一致性及定量的准确性 ； 0067 2、 本发明所述试剂盒无需引入内参基因， 采用相对定量方法， 通过比值 结果， 以 及结合 SEA 曲线及 THAI 曲线的有无即可准确。
42、判断基因型 ； 0068 3、 对 - 地中海贫血珠蛋白基因缺失检测具有高度的灵敏性、 稳定性和准确性， 以及较高的特异性 ； 0069 4、 采用本发明所述试剂盒可将 -3.7和 -4.2简并为 - 检测。 图 1 是 -3.7和 -4.2的分子生物学结构图。 具体实施方式 0070 下面以具体实施例对本发明作进一步说明， 但本发明并不局限于这些实施例。 0071 实施例 1 ： 采用本发明所述试剂盒在已知基因型样本中的检测结果 0072 1、 试剂盒的组成 ： 0073 (1)可以同时扩增-珠蛋白基因簇中1区段的特征序列A1和2区段的特征 序列 A2 的引物对 A1A2-F 和 A1A2-。
43、R ： 0074 A1A2-F ： 5 -GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3 (SEQ ID NO ： 1) ； 说 明 书 CN 103966319 A 9 6/11 页 10 0075 A1A2-R ： 5 -GCAGGCAGTGGCTTAGGA-3 (SEQ ID NO ： 2) ； 0076 (2) 扩增 - 珠蛋白基因簇中 -SEA基因型的 Gap-PCR 引物对 SEA-F 和 SEA-R ： 0077 SEA-F ： 5 -CTCAGTATTGGAGGGAAGGA-3 (SEQ ID NO ： 3) ； 0078 SEA-R ： 5 -CAGTGTTGTAGTCATGGCT。
44、TA-3 (SEQ ID NO ： 4) ； 0079 (3) 扩增 - 珠蛋白基因簇中 -THAI基因型的 Gap-PCR 引物对 THAI-F 和 THAI-R ： 0080 THAI-F ： 5 -AAGCGAGAGGAATCACATTC-3 (SEQ ID NO ： 5) ； 0081 THAI-R ： 5 -CTTGGATCTGCACCTCTG-3 (SEQ ID NO ： 6) ； 0082 (4) 特异性检测 1 区段的特征序列 A1 的荧光探针 A1-Prob 为 ： 0083 A1-Prob ： 5 6-FAM-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-3 BHQ-1(SEQ。
45、 ID NO ： 7) ； 0084 (5) 特异性检测 2 区段的特征序列 A2 的荧光探针 A2-Prob 为 ： 0085 A2-Prob ： 5 ROXCCTGGGCCGCACTGACCCTC-3 BHQ-2(SEQ ID NO ： 8) ； 0086 (6) 特异性检测 -SEA基因型扩增产物的荧光探针 SEA-Prob 为 ： 0087 SEA-Prob ： 5 -HEX-TCCTCCTGCCCCAGCCTCCAA-BHQ-1-3 (SEQ ID NO ： 9) ； 0088 (7) 特异性检测 -THAI基因型扩增产物的荧光探针 THAI-Prob 为 ： 0089 THAI-P。
46、rob ： 5 -CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3 (SEQ IDNO ： 10)。 0090 上述各引物和荧光探针均是针对 - 珠蛋白基因簇中的 1 区段和 2 区段设计 的， 更具体地说是针对 - 珠蛋白基因簇中 1 区段的特征序列 A1 和 2 区段的特征序列 A2 进行设计的， 其中 ： 0091 所述 1 区段的序列为 ： 0092 5 -ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCT GGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGC。
47、TCCCTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGAC CCACAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAACCCCACCC CTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTC CTGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGG CAAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCCGCCCTGAGCG ACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGG。
48、TGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGCGGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAG GGGCGAGATGGCGCCTTCCTCGCAGGGCAGAGGATCACGCGGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGG CCTGGGCCCTCGGCCCCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCCA CCTCCCCGCCGAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTGTGAGCACCGTGCTGACCT CCAAATACCGTT。
49、AA-3 (SEQ ID NO ： 11) ； 该 1 区段的特征序列 A1 为 ： 5 -GGGTTGCGGGAGGTGT AGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCCTCGGCCCCACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTG C-3 (SEQ ID NO ： 12)。 0093 所述 2 区段的序列为 ： 0094 5 -ATGGTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCACGCT GGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGCTCCCTCCCCTGCTCCGACCCGGGCTCCTCGCCCGCCCGGAC CCACAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAACCCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCC TGTCCTTCCCCACCACCAAGACCTACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGC AAGAAGGTGGCCGACGCGCTGACCAAC。