技术领域
本发明属于农业生物技术工程，特别涉及与稻米直链淀粉含量调控基因SSIVb有关的分 子标记SSIVb-m及其获得方法。
背景技术
高产、优质一直是水稻育种长期追求的目标。经过长期的努力，尤其是杂交稻技术的利 用，我国在水稻生产上取得了举世公认的成就。但是由于过去一直把如何解决人们的温饱问 题放在第一位，故而水稻育种工作的重点大部分集中于水稻高产新品种的培育，从而导致优 质稻米的育种严重滞后，特别是一些高产的杂交稻品质普遍偏差。
导致稻米品质改良进展较慢的另一个主要原因是稻米品质遗传的复杂性和传统育种手段 的局限性。稻米的品质性状包括外观品质、加工品质、蒸煮品质、营养品质和食味品质等诸 多方面，而稻米蒸煮品质是评价稻米品质的最重要指标。蒸煮品质是指稻米在蒸煮过程中所 表现出来的特性，主要由直链淀粉含量（Amylose Content,AC）、胶稠度（Gel Consistency， GC）、糊化温度（Gelatinization Temperature,GT）三个理化指标来评价，其中AC是影响稻米 品质最主要的理化指标。育种学家和遗传学家做了大量的工作以探寻稻米AC的遗传学基础， 然而不同实验室的结果有着较大的差别。早期的研究表明稻米AC是由一个主效基因控制， 并受到其他微效QTL的调控[1,2]。随后的研究发现Waxy(Wx)对于稻米AC的多少具有决定 性的作用，可能就是控制AC的主效基因[3-5]。除在第6染体上检测到1个主效QTL外，不 同研究检测到的微效QTL数目及位置很不一致。例如，Tan等在第1、2染色体上检测到了 两个微效QTLs[6]，He等在第5染色体检测到了一个微效QTL[6]，Aluko等在第3和8染色 体上分别检测到了微效QTLs[7]。黄祖六等研究发现除了第6染色体的Wx基因位点外，在 第3染色体也检测到一个控制稻米AC的主效QTL；另外5个微效QTLs分别位于第4、4、 6、9、11染色体的不同座位上[8]。其他实验室在第4、6、7染色体也检测到了控制AC的 QTLs[9]。吴长明等在第6染色体上并没有发现与AC有关的QTL位点，只是在第1，7，8， 9，12染色体上发现5个QTL位点[10]。
导致稻米品质改良进展较慢的另一个主要原因是在传统育种手段的局限性。传统育种方 法主要是对有利目标性状进行定向选择和固定，培育出优良新品种，这具有很大的盲目性和 不可预测性[11]。并且，个体选择的方法是对符合育种目标的农艺性状进行直接选择，即选 择的是个体表现型而不是基因型。由于基因间存在一因多效、多因一效、调控基因以及修饰 基因等的作用，个体的表现型与基因型往往存在较大差异，因而通过田间表型性状进行个体 选择的准确性较差。分子标记辅助选择（Marker-assisted Selection，MAS）技术给水稻育种提 供了新的途径，与传统育种技术相结合可大大提高育种效率，缩短育种周期。MAS的核心是 把常规育种中的表型选择转化为基因型选择，它直接反映了DNA的序列差异，不受基因表 达的影响，结果可靠性强，并且不受植物的生长发育阶段及环境条件的影响[12]。
上文中涉及的参考文献如下：
1.Bollich C.W.,BD.Inheritance of amylose in two hybrid populations of rice.Cereal Chem. 1973,50,631-636（Bollich C.W.,BD.直链淀粉含量的在两个杂交群体的遗传，谷物化学.1973. 50:631-636）；
2.McKenzie K.R.,JN.Genetic analysis of amylose content,alkali spreading score,and grain dimensions in rice.Crop Sci.1983,23,306-311（McKenzie K.R.,JN.水稻直链淀粉含量、碱消 值和籽粒形态的遗传分析.作物科学.1983,23:306-311）；
3.Sano Y.Differential regulation of waxy gene expression in rice endosperm.Theor.Appl. Genet.1984,68,467-473(Sano Y.水稻胚乳蜡质基因表达的差异调控.理论和应用遗传.1984, 68:467-473)；
4.Kumar I.K.,G S.Juliano,B O.Genetic analysis of waxy locus in rice(Oryza sativa L.). Theor.Appl.Genet.1987,73,481-488(Kumar I.K.,G S.Juliano,B O.水稻胚乳蜡质基因位点的 遗传分析.理论和应用遗传.1987,73:481-488)；
5.Kumar I.K.,GS.Inheritance of amylose content in rice(Oryza sativa L.).Euphytica1988, 38,261-269.(Kumar I.K.,GS.水稻直链淀粉含量的遗传.欧洲植物学.1988,38:261-269)
6.Tan Y.F.,Li J.X.,Yu S.B.,et al.The three important traits for cooking and eating quality of rice grains are controlled by a single locus in an elite rice hybrid,Shanyou63.Theor.Appl.Genet. 1999,99,642-648(Tan Y.F.,Li J.X.,Yu S.B.,等.优异杂交稻汕优63稻米蒸煮食味品质的三个 重要指标受单位点控制.理论和应用遗传.1999,99:642-648)；
7.Aluko G.,Martinez C.,Tohme J.,et al.QTL mapping of grain quality traits from the interspecific cross Oryza sativa x O.glaberrima.Theor.Appl.Genet.2004,109,630-639(Aluko G., Martinez C.,Tohme J.,等.稻米籽粒性状在亚洲栽培稻和非洲栽培稻种间杂交群体中的QTL定 位.理论和应用遗传.2004,109:630-639)；
8.黄祖六,和谭学林,Tragoonrung S.,et al.稻米直链淀粉含量基因座位的分子标记定 位.作物学报2000,26,777-782；
9.Lanceras J.C.,Huang Z.L.,Naivikul O.,et al.Mapping of genes for cooking and eating qualities in Thai jasmine rice(KDML105).DNA Res.2000,7,93-101(Lanceras J.C.,Huang Z.L., Naivikul O.,等.泰国香米蒸煮食味品质的基因作图.DNA研究.2000,7:93-101)；
10.吴长明,孙传清,陈亮,等.水稻直链淀粉含量与籼粳分化度的QTL及其相互关系研 究.中国农业大学学报2000,5,6-11；
11.黎志康.我国水稻分子育种计划的策略.分子植物育种2005,3,603-608；
12.冯建成.分子标记辅助选择技术在水稻育种上的应用.中国农学通报2006,22, 43-47。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种与稻米淀粉合成基因SSIVb有关的分子标记及其开 发方法和用途，本发明所得的分子标记SSIVb-m为稻米直链淀粉含量微控基因SSIVb的分子标 记，能用于稻米直链淀粉含量的辅助选择育种。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种稻米直链淀粉含量微控基因SSIVb的分子标记 SSIVb-m，以水稻作为物种，该分子标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，
SSIVb-m 正向：ATTTTCCTCAGTAGTAAGCAAGAGTT
反向：AAAACATTGCTCCAAAACAGC。
本发明还提供了上述分子标记SSIVb-m的开发方法，包括以下步骤：
1）、以粳稻品种日本晴作为低直链淀粉含量基因供体亲本与作为高直链淀粉的特青进行 杂交、回交和自交，从而获得作为后代的稻米低直链淀粉含量的单株；
2）、用CTAB（十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide）法提取 水稻亲本幼苗及后代幼苗基因组DNA；
3）、采用Indel（插入/缺失片段，insertion/deletions）分子标记方法进行稻米低直链淀粉 含量基因标记的筛选；
4）、开发出一个Indel分子标记SSIVb-m。
与稻米低直链淀粉含量有关的分子标记SSIVb-m，具体是用下述方法得到的：
1）、根据基因SSIVb的核苷酸序列，设计、发展Indel分子标记，用于检测低直链淀粉 含量日本晴和高直链淀粉含量特青的多态性；通过测序以进一步确定引物SSIVb-m区间的序 列在低直链淀粉含量的日本晴和高直链淀粉含量的特青之间的差异；通过杂交、回交和自交 结合标记辅助选择，获得特青背景的低直链淀粉含量的水稻新种质；
2）、用CTAB法提取水稻亲本幼苗及后代幼苗基因组DNA；
3）、采用Indel分子标记方法进行稻米低直链淀粉含量的基因标记筛选低直链淀粉含量 的水稻新种质；
4）、鉴定出一个Indel分子标记SSIVb-m，经多态性检测，发现其与稻米直链淀粉含量 相关联。
本发明还同时提供了上述分子标记SSIVb-m的用途，用于水稻稻米直链淀粉含量鉴定和 /或其后代辅助选择育种。
作为本发明的分子标记SSIVb-m的用途的改进：当筛选日本晴和特青的后代时，选择后 代中带型与日本晴带型一致的单株用于后续的育种改良。
采用Indel分子标记SSIVb-m进行稻米直链淀粉含量筛选的方法具体是：
(1)、Indel标记在高、低稻米直链淀粉含量品种日本晴和特青间的DNA多态性分析：
根据基因SSIVb的核苷酸序列，设计、发展Indel分子标记SSIVb-m，用于检测低直链淀粉 含量的日本晴和高直链淀粉含量的特青之间的多态性。引物委托上海申能博彩公司合成，在 PTC-225PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为：20ng/ul水稻基因组DNA1ul,10×PCR Buffer 2.0ul,25mM MgCl22.0ul,2mM dNTP2.0ul,10uM引物2.0ul,5U/ul Taq DNA聚合酶0.2ul， ddH2O10.8ul，总体系20ul。反应程序：95℃变性5分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1分 钟，72℃延伸1分钟，40个循环；72℃补齐10分钟；产物检测：在含有0.5％ug/ul EB的4.0％ 的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相记录结果。
(2)、Indel标记SSIVb-m的序列区间在低、高稻米直链淀粉含量品种日本晴和特青间的 基因组序列差异：
根据获得的Indel分子标记SSIVb-m，用于PCR扩增低直链淀粉含量品种日本晴和高直 链淀粉含量品种特青的基因组序列，PCR扩增产物委托上海英骏生物技术有限公司进行测序 分析。PCR扩增参照上述(1)进行，PCR产物的回收选用北京百泰克生物技术有限公司开发的 PCR产物回收试剂盒（离心柱型，目录号：DP1403）。
（3）、利用Indel标记SSIVb-m开展低直链淀粉含量的辅助选择育种
低直链淀粉含量的基因供体亲本日本晴，与高直链淀粉含量的籼稻品种特青进行杂交， 通过回交、自交结合标记辅助选择，将日本晴的低直链淀粉含量基因SSIVb导入到高直链淀 粉含量的特青中，选择分离群体中带型与日本晴带型一致的单株用于育种改良，获得了若干 份特青背景的带日本晴SSIVb基因的材料；收获这些植株上所结的种子，检测其直链淀粉含 量，发现其直链淀粉含量显著降低。
直链淀粉含量高是稻米品质低劣的最主要因素。本发明采用分子生物学方法以低直链淀 粉含量的日本晴为材料，发展和筛选新的、而且稳定的能降低稻米直链淀粉含量的分子标记 及其方法，用于优质稻米的辅助选择育种；由于研究所用的材料能有效降低一般稻米的直链 淀粉含量，其对我国稻米品质的改善具有普遍性。
本发明创造了稻米淀粉合成相关基因SSIVb的Indel标记SSIVb-m。利用这种方法，不 仅克服了常规育种方法所需时间周期长等缺点，可以有目标地将日本晴的低直链淀粉含量基 因SSIVb在实验室内选择获得并有目的地进行多个优质的聚合，从而培育出具有优质的水稻 新品种。在本发明中，当所得植株经检测出现日本晴的条带时，我们判定其属于低直链淀粉 含量的水稻；当所得植株经检测出现特青的条带时，我们判定其属于高直链淀粉含量的水稻； 当所得植株经检测同时出现特青+日本晴的条带时，我们判定其可能属于高直链淀粉含量的水 稻。
因此，本发明结果在水稻优质育种实践中具有重要意义。其优点具体归纳如下：
（1）本发明的能调控稻米直链淀粉含量的分子标记，是在通过低直链淀粉含量的粳稻 日本晴与高直链淀粉含量的籼稻特青的杂交、回交和自交中筛选获得的，能显著降低稻米直 链淀粉含量，而且稳定存在，可用于优质稻米的辅助选择育种。
（2）本发明依据的是稻米淀粉合成基因SSIVb的核苷酸序列发展而获得的Indel分子 标记，极大提高了辅助选择的效率。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是Indel标记SSIVb-m在低直链淀粉含量的粳稻日本晴、高直链淀粉含量的籼稻特 青、F1的电泳谱带图；
图2是引物SSIVb-m的PCR扩增产物在日本晴和特青间的序列差异；
图3是Indel标记SSIVb-m鉴定获得的8份低直链淀粉含量的日本晴和特青的后代的电 泳谱带图；
图4是标记SSIVb-m辅助选育的8份材料的直链淀粉含量；
对上述图1～4中符号分别作如下说明：
1代表：低直链淀粉含量的粳稻日本晴；
2代表：高直链淀粉含量的籼稻特青；
3代表：日本晴/特青的F1植株；
4,5,6,7,8,9,10,11均代表：日本晴和特青的后代，经Indel标记SSIVb-m的筛选后获得。
具体实施方式
实施例1、用Indel标记SSIVb-m鉴定低直链淀粉含量的粳稻日本晴和高直链淀粉含量的 籼稻特青的多态性
具体做法是：从中国水稻研究所种质资源库中选取水稻材料日本晴和特青，用日本晴和 特青杂交获得其F1，利用引物SSIVb-m鉴定其多态性（图1）。
一、提取DNA
1）、配制DNA提取缓冲液：
按顺序依次加1体积的DNA提取溶液（0.35M sorbitol;0.1M Tris,pH8.2;0.005M EDTA； 其余为水），1体积的核裂解液（0.2M Tris,pH7.5;0.05M EDTA;2M NaCl;0.055M CTAB； 其余为水）和0.4体积的5%（质量浓度）sarkosyl溶液（即十二酰-N-甲基甘氨酸钠的水溶 液）；最后加入亚硫酸氢钠，配制成DNA提取缓冲液；亚硫酸氢钠在DNA提取缓冲液中的 终浓度为0.02M。
上述DNA提取溶液的制备方法为：在0.35mol的sorbitol（山梨糖醇）、0.1mol的Tris（三 羟甲基氨基甲烷，pH8.2）、0.005mol的EDTA（乙二胺四乙酸）中加水定容至1L。
上述核裂解液的制备方法为：在0.2mol的Tris（三羟甲基氨基甲烷，pH7.5）、0.05mol 的EDTA（乙二胺四乙酸）、2mol的NaCl（氯化钠）、0.055mol的CTAB（十六烷基三甲基溴 化铵）加水定容至1L。
2）、对上述日本晴、特青、F1的水稻叶片分别进行如下处理：
①、称取0.1g的水稻叶片用液氮研磨成粉状，然后加入700μl的上述步骤1）配制的 DNA提取缓冲液，65℃水浴40分钟。再加700μl的氯仿:异戊醇（24:1的体积比），并混匀。 10,000rpm离心5分钟，将上清液转移到新的离心管中。
②、在上述步骤①离心后所得的上清液中加2/3～1倍体积预冷（至4℃）的异丙醇，轻轻 混匀至DNA沉淀。13,000rpm离心8分钟，倒出上清液。
③、再用70%（体积浓度）的已醇200μl洗涤上述步骤②所得的DNA沉淀物。
④、将上述洗涤后的DNA晾干并溶于100μl TE缓冲液或纯水中。
⑤、紫外分光光度法检测上述步骤④所得的DNA样品的浓度，0.7％的琼脂糖凝胶电泳 检测DNA的完整性。完整合适的DNA用于PCR扩增，不完整的DNA则重新提取，直至获 得完整的DNA。
二、PCR扩增
1）、反应体系：
水稻基因组DNA20ng/ul1ul，10×PCR Buffer2.0ul，25mM MgCl22.0ul，2mM dNTP2.0ul， 10uM引物各1.0ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0.2ul，ddH2O10.8ul，总体系20ul。
所述引物为：SSIVb-m 正向：ATTTTCCTCAGTAGTAAGCAAGAGTT
反向：AAAACATTGCTCCAAAACAGC；
2）、反应程序：
95℃变性5分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，40个循环；72℃ 补齐10分钟。
三、电泳检测
取扩增产物20ul，用4.0％的琼脂糖凝胶（含有0.5％ug/ul EB）电泳，紫外灯下观察并 照相记录结果。如图1所示。
在图1中，日本晴为62bp的条带，特青为59bp的条带，“F1”为62bp+59bp的条带。
根据图1，我们能得出下述结论：Indel分子标记SSIVb-m能够检测特青和日本晴之间的 多态性，且日本晴的PCR扩增产物片段要大于特青，由此表明SSIVb-m能用于特青和日本 晴之间的分子检测及其后代的标记辅助选择。
实施例2、用Indel分子标记SSIVb-m鉴定低直链淀粉含量的粳稻日本晴和高直链淀粉含 量的籼稻特青的序列差异
具体做法是：应用Indel分子标记SSIVb-m对日本晴和特青的基因组DNA进行PCR扩 增，扩增产物委托上海英骏生物技术有限公司进行测序，比较其序列的差异（图2）。
一、提取DNA
1）、配制DNA提取缓冲液：
同实施例1。
2）、对上述日本晴和特青的水稻叶片分别进行如下处理：
同实施例1。
3）PCR扩增
同实施例1。
4）PCR产物的回收
PCR产物的回收选用北京百泰克生物技术有限公司开发的PCR产物回收试剂盒（离心柱 型，目录号：DP1403），参照产品说明要求进行，回收的PCR产物委托上海英骏生物技术有 限公司进行测序。
根据图2，我们能得出以下结论：日本晴和特青的SSIVb-m扩增产物存在3bp的碱基差 异（如图2中的下划线所示），这是我们能够使用Indel分子标记SSIVb-m检测出其多态性的 原因所在，也是我们能用于其后代标记辅助选择的遗传基础。
实施例3、利用Indel标记SSIVb-m开展低直链淀粉含量的辅助选择育种
具体做法是：低直链淀粉含量的基因供体亲本日本晴，与高直链淀粉含量的籼稻品种特 青进行杂交、回交和自交，对所得后代结合分子标记SSIVb-m的辅助选择，选择分离群体中 带型与日本晴带型一致的单株用于育种改良。
一、提取DNA
1）、配制DNA提取缓冲液：
同实施例1。
2）、对上述日本晴、特青、所得后代的水稻叶片分别进行如下处理：
同实施例1。
二、Indel标记检测
1）、PCR扩增
同实施例1。
2）、电泳检测
同实施例1。
三、Indel分子标记SSIVb-m开展低直链淀粉含量的辅助选择育种
低直链淀粉含量的基因供体粳稻品种日本晴与高直链淀粉含量的普通籼稻品种特青进行 杂交、回交和自交，结合分子标记SSIVb-m的辅助选择，选择分离群体中带型与日本晴带型 一致的单株进一步用于育种改良（图3），淘汰带型与高直链淀粉含量特青的带型一致和杂合 带型（同时具有日本晴和特青带型）的个体，育种材料的稻米直链淀粉含量采用国家标准 （GB/T15683-2008）进行检测。分析表明，所选择的带日本晴带型的8个单株均比轮回亲本 特青明显降低（图4）。该实验结果表明：Indel标记SSIVb-m可以用于稻米直链淀粉含量的 辅助选择育种。
备注说明：
图3和图4中的“4～11”均为日本晴和特青依次进行杂交、回交和自交获得的，且是选 择了“带型与日本晴带型一致”的单株。
对比例1、利用Indel标记SSIVb-m判别稻米直链淀粉含量
具体做法是：将实施例3的步骤三中被淘汰的带型与高直链淀粉含量特青的带型一致和 杂合带型（同时具有日本晴和特青带型）的个体继续进行种植，通过对其后代稻米籽粒直链 淀粉含量的测定，进一步分析分子标记SSIVb-m辅助选择的可靠性。
一、提取DNA
1）、配制DNA提取缓冲液：
同实施例1。
2）、对上述水稻叶片分别进行如下处理：
同实施例1。
二、Indel标记检测
1）、PCR扩增
同实施例1。
2）、电泳检测
同实施例1。
三、Indel标记SSIVb-m判别稻米直链淀粉含量
随机选择了在实施例3的步骤三中被淘汰4个带型与特青一致的单株继续种植，经Indel 分子标记SSIVb-m检测，其后代均表现与特青一致的带型，分别收获这些单株籽粒并测定其 直链淀粉含量。另外，随机选择其中1个杂合带型（同时具有日本晴和特青带型）的个体用 于继续种植，在其后代中随机选取12个单株，Indel分子标记SSIVb-m检测表明，该12个单 株中有3个单株表现特青带型，6个单株表现杂合带型，3个表现日本晴带型，符合1:2:1的 分离关系；待植株成熟后，分别收获这些单株并测定其籽粒的直链淀粉含量。表1是这16个 单株（株系）的稻米籽粒的直链淀粉含量，4个与特青带型一致的单株均表现与特青类似的 高直链淀粉含量；而在带型杂合的12个后代单株中，有9个单株表现类似与特青的高直链淀 粉含量（其中，3个单株的带型表现特青带型，6个单株的带型表现杂合带型）；3个呈日本 晴带型的单株，其直链淀粉含量显著低于特青。该实验结果表明：Indel分子标记SSIVb-m可 以用于判别稻米直链淀粉含量。
表1.稻米直链淀粉含量及其对应的基因型
注：括号中字母代表该单株的基因型，T为特青带型，H为杂合带型，N为日本晴带型
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导 出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。