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1、(10)申请公布号 CN 103602685 A (43)申请公布日 2014.02.26 CN 103602685 A (21)申请号 201310519284.0 (22)申请日 2013.10.29 C12N 15/12(2006.01) C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 王景文 地址 116000 辽宁省大连市西岗区信诚街 3 号 1617 (72)发明人 王景文 (54) 发明名称 一种 VEGF-C 真核表达载体的构建和体外表 达的实验方法 (57) 摘要 本发明公开了一种 VEGF-C 真核表达载体 的构建和体外表达的实验方法。在首先进行的 MCF-7 细胞。
2、培养与总 RNA 提取中， 于 DMEM 培养基 培养 MCF 细胞 , 胰酶消化传代。收集对数期生长 的 MCF-7 细胞 , 总量为 5 6106 ； 按 Trizol 试 剂盒说明提取细胞总 RNA ； 其中 Trizol 试剂盒 , 为 cDNA 第一链合成试剂。本发明的有益效果是， 基因测序能够证实 RT-PCR 产物包含 VEGF-CcDNA 全长。 重组pcDNA3.1(-) 中含有 VEGF-CcDNA 全长 序列 ,Western-blotting 检测到细胞培养上清中 以及细胞内有 VEGF-C 蛋白存在。 结论 : 成功构建 了人类 VEGF-C 真核表达载体并检测到载体。
3、在真 核细胞中的表达。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书1页 (10)申请公布号 CN 103602685 A CN 103602685 A 1/1 页 2 1. 一种 VEGF -C 真核表达载体的构建和体外表达的实验方法， 其特征在于， 在首先进 行的 MCF-7 细胞培养与总 RNA 提取中， 于 DMEM 培养基培养 MCF 细胞 , 胰酶消化传代。 2.如权利要求1所述的一种VEGF -C 真核表达载体的构建和体外表达的实验方法， 其 特征在于， 收集对数期生长的 MCF -。
4、7 细胞 , 总量为 5 6 106。 3.如权利要求1所述的一种VEGF -C 真核表达载体的构建和体外表达的实验方法， 其 特征在于， 按 Trizol 试剂盒说明提取细胞总 RNA。 4.如权利要求1所述的一种VEGF -C 真核表达载体的构建和体外表达的实验方法， 其 特征在于， 其中 Trizol 试剂盒 , 为 cDNA 第一链合成试剂。 权 利 要 求 书 CN 103602685 A 2 1/1 页 3 一种VEGF -C 真核表达载体的构建和体外表达的实验方法 技术领域 0001 本发明涉及一种生化的实验方法， 具体来说， 一种 VEGF -C 真核表达载体的构建 和体外表达。
5、的实验方法。 背景技术 0002 血管内皮生长因子 C(VEGF -C) 属 VEGF/PDGF 家族成员 , 其受体为 VEGFR -2 , VEGFR -3 。VEGF 通过 VEGFR -2 调节血管和淋巴管的增生 , 而 VEGFR-3 表达则局限于 淋巴管内皮 ,VEGF -C 为 VEGFR-2 的结合 , 产生生物学效应的所需浓度远高于 VEGFR -C , 因此,VEGFR -3 是淋巴管增生特异性调节因子, 用VEGF -C 转基因鼠实验证实, VEGF -C 的高表达可以选择性地引起淋巴管增生 2 , 经研究,VEGF -C 表达与肿瘤淋巴管增 生和 转移的关系是 VEGF。
6、 -C 高表达可促进肿瘤的淋巴转移 , 其机理是 VEGF -C 促进了肿 瘤周围及间质的淋巴管生长以及肿瘤组织中淋巴管增生。 为进一步研究VEGF -C 在淋巴管 增生中的作用及其机制 , 我们构建了携带人 VEGF -C cDNA 的基因片段的真核表达载体 , 研究了它在真核细胞内的表达, 为探讨VEGF -C 与淋巴管增生的关系,VEGF -C 基因用于 治疗淋巴水肿和某些癌肿的可行性提供实验依据。 发明内容 0003 为克服上述技术问题， 我们提出了以下技术方案 ： 一种VEGF -C 真核表达载体的构建和体外表达的实验方法， 在首先进行的MCF-7 细胞 培养与总 RNA 提取中， 。
7、于 DMEM 培养基培养 MCF 细胞 , 胰酶消化传代。 0004 本发明中， 收集对数期生长的 MCF -7 细胞 , 总量为 5 6 106。 0005 本发明中， 按 Trizol 试剂盒说明提取细胞总 RNA。 0006 本发明中， 其中 Trizol 试剂盒 , 为 cDNA 第一链合成试剂。 0007 本发明的有益效果是， 基因测序能够证实RT -PCR 产物包含VEGF -C cDNA 全长。 重组pcDNA3 .1(-)中含有VEGF -C cDNA 全长序列,Western -blotting 检测到细胞培养 上清中以及细胞内有 VEGF -C 蛋白存在。结论 : 成功构建。
8、了人类 VEGF -C 真核表达载体 并检测到载体在真核细胞中的表达。 具体实施方式 0008 在首先进行的 MCF-7 细胞培养与总 RNA 提取中， 于 DMEM 培养基培养 MCF 细胞 , 胰酶消化传代。收集对数期生长的 MCF -7 细胞 , 总量为 5 6 106 ； 按 Trizol 试剂 盒说明提取细胞总 RNA ； 其中 Trizol 试剂盒 , 为 cDNA 第一链合成试剂。 0009 以上所述， 仅为本发明较佳的具体实施方式， 但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内， 根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103602685 A 3 。