技术领域
本发明属于纳米材料和生物技术领域，具体涉及一种荧光硅纳米点及其制备方法与应用。
背景技术
荧光材料在生物医学中有广泛的应用。与传统的有机荧光小分子相比，荧光纳米材料因为其具有较好的光稳定、可调的激发发射波长等优点，近些年受到广泛关注。目前已有的荧光纳米材料种类很多，但它们都存在一定的缺点，比如：传统的半导体量子点(如硒化镉、硫化铅等)一般含有毒性较大的重金属元素，所以其在生物医学中的使用剂量受到很大限制；贵金属纳米簇(如金纳米簇、银纳米簇)和上转换纳米颗粒的生物相容性虽然好于半导体量子点，但其量子产率一般较低，成像效果不佳；聚合物量子点的合成方法较为复杂，同时对聚合物量子点表面修饰可能会对其荧光性质有较大影响；碳点和石墨烯量子点的荧光发射峰较宽，同时还具有多色发光的性质，不利于与其他探针同时使用；其他新型纳米点(如黑磷量子点)则存在表面不易修饰、制备条件苛刻等问题。因此，开发性能优异且符合生物医学意义的超亮荧光纳米材料具有重要意义。
另一方面，溶酶体是真核细胞中的关键细胞器，为单层膜包被的囊状结构，内含多种酸性水解酶，可分解和消化细胞内多种外源性和内源性的分子和物质，是细胞的消化中心。溶酶体还在细胞凋亡、细胞自噬、细胞内胆固醇平衡、质膜修复、细胞骨架和组织重建、病原体防御以及细胞内信号转导等一系列生理过程中起重要作用。因此，对溶酶体的数量、大小和形貌等的观察和示踪对于了解细胞的行为和命运非常重要。与其他细胞器相比，溶酶体内呈酸性(pH 4.5–5.0)，因此通常使用能够靶向酸性环境的分子来实现溶酶体成像。比如，3-(2,4-二硝基苯胺)-3’-氨基-N-甲基二丙胺(DAMP)是一种常用的溶酶体靶向分子，但由于该分子自身没有荧光，因此需要在该分子的伯胺基团上接枝荧光分子才能实现溶酶体成像。一些荧光分子(如中性红和吖啶橙)虽然可以实现溶酶体的成像，但它们同时也会对细胞核内酸性的核酸成像。目前商品化的溶酶体荧光探针(如Thermo Fisher公司的LysoTracker系列染料)有较好的溶酶体成像效果，但其合成成本较高、光稳定性不佳且溶酶体成像时间短。同时，该类荧光探针表面无修饰基团，无法对其进行进一步修饰和应用。新兴的荧光纳米材料被认为是解决上述问题的有效方法。例如，Lin等制备的有机荧光纳米颗粒(PVP和BPVP)虽可靶向癌细胞的溶酶体，但不能实现正常细胞的溶酶体成像(Org.Biomol.Chem.,2009,7,2036.)。Dekiwadia等在金纳米颗粒表面修饰了荧光分子FITC和可靶向溶酶体的多肽后，实现了对溶酶体的成像(J.Pept.Sci.,2012,18,527.)。但是上述方法都没有评价纳米颗粒对固定和透化后的细胞溶酶体成像效果。此外，长时间实时观测溶酶体行为对研究细胞的生理变化有着重要作用，而上述方法都不能实现活细胞溶酶体的长时间成像。因此，亟需发展一种性能良好的荧光纳米颗粒作为长时间观测溶酶体的荧光探针，以实现对活细胞溶酶体的长时间成像和对固定和透化后细胞的溶酶体成像。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种荧光硅纳米点(SiNDs)，以实现超长时间、耐清洗、耐固定、耐透化的溶酶体成像，解决了现有技术存在的成本高，稳定性差和成像时间短等问题。
本发明还要解决的技术问题是提供该荧光硅纳米点的制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种荧光硅纳米点，它包括如下质量份数的组分：
水溶性硅烷 100份；
孟加拉玫瑰红 1～10份。
其中，优选如下质量份数的组分：
水溶性硅烷 100份；
孟加拉玫瑰红 3份。
其中，所述的水溶性硅烷为氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷(DAMO)、3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷(AEEA)或γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)，优选3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷(AEEA)。
上述荧光硅纳米点的制备方法，它包括如下步骤：
取配方量的孟加拉玫瑰红溶于超纯水中，加入配方量的水溶性硅烷后进行反应；反应完成后，降至室温的反应液经透析得到荧光硅纳米点水溶液。
其中，
反应温度为120～250℃，优选160℃；
反应时间为2～24h，优选3h；
反应装置优选为水热反应釜。
其中，透析所用透析袋的截留分子量为500-1000。
上述荧光硅纳米点在作为溶酶体荧光探针中的应用也在本发明的保护范围之内。
孟加拉玫瑰红在制备荧光硅纳米点中的应用也在本发明的保护范围之内；其中，所述的制备荧光硅纳米点是指与水溶性硅烷(优选3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷)参照前述的方法进行制备。
本发明中，孟加拉玫瑰红不仅仅是作为染色剂来使用，而是参与了荧光硅点的合成，其对荧光硅点的合成具有重要作用，不可将其替换为其他染色剂。
有益效果：
与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)超高的荧光量子产率：该荧光硅纳米点量子产率可高达100％，仅20μg/mL的样品浓度就可获得优异的溶酶体成像效果；
(2)极佳的溶酶体特异靶向性：与商品化的溶酶体探针共定位率高达98％以上，并且该探针即使长时间与细胞孵育，仍然只存在于溶酶体中；
(3)能实现超长时间的溶酶体成像：该探针与细胞孵育并经磷酸缓冲液洗涤后，在48h内仍然有较好的溶酶体成像效果，而商品化的溶酶体探针仅在2h内有较好的溶酶体成像效果；
(4)具有优异的抗光漂白能力：该硅纳米点在激光照射下不易被光漂白，其光稳定性好于商品化溶酶体染料，因此可以实现长时间连续成像观察；
(5)具有良好的耐清洗、耐固定、耐透化能力：在细胞多次清洗、固定、透化后，该硅纳米点仍能对溶酶体有较好的成像效果；
(6)具有较好的生物相容性：经细胞毒性评价实验，该硅纳米点在500μg/mL及以下的浓度时，对细胞的毒性很低；并且用激光长时间照射后，其细胞毒性仍然很低，证明该材料具有很好的生物相容性和较低的光毒性；
(7)本发明制备方法简单、原料价廉易得、可实现大量制备。
附图说明
图1为实施例1中用硅烷试剂AEEA和孟加拉玫瑰红制备超亮荧光硅纳米点(SiNDs)的示意图；
图2为实施例1中制得的SiNDs的透射电子显微镜图；
图3为实施例1中制得的SiNDs的粒径统计结果图；
图4为实施例1中制得的SiNDs的紫外–可见吸收光谱图；
图5为实施例1中制得的SiNDs的荧光激发和发射光谱图；
图6为实施例1中制得的SiNDs在不同pH环境中650nm处的消光度图；
图7为实施例1中制得的SiNDs在A549细胞中孵育不同时间后的溶酶体成像效果图；
图8为商品化的绿色溶酶体荧光染料LysoTracker Green(LT-Green)与A549细胞孵育不同时间后的溶酶体成像效果图；
图9为商品化的红色溶酶体荧光染料LysoTracker Red(LT-Red)与A549细胞孵育不同时间后的溶酶体成像效果图；
图10为实施例1中制得的SiNDs与LT-Green和LT-Red在清洗后放置不同时间段的溶酶体成像效果比较图；
图11为实施例1中制得的SiNDs与LT-Red在激光下照射不同时间后的荧光稳定性比较图；
图12为实施例1中制得的SiNDs与LT-Green和LT-Red在A549细胞中耐固定和耐透化效果比较图；
图13为实施例1中制得的SiNDs在不同细胞系中的溶酶体成像效果图；
图14为实施例1中制得的SiNDs在A549细胞中于光照和正常条件下的细胞毒性图。
具体实施方式
实施例1
以AEEA为例，制备荧光硅纳米点，包括以下步骤：
(1)称取孟加拉玫瑰红并使其充分溶解于超纯水中，加入适当体积的AEEA，使AEEA和孟加拉玫瑰红的质量比为100：3。将二者充分混匀并转移至水热反应釜中；
(2)反应：在水热反应釜中以160℃反应3h，形成硅纳米点溶液；
(3)纯化：透析即得目标超亮荧光硅纳米点溶液。
该反应的示意图见图1，制备得到的SiNDs的透射电子显微镜结果见图2，其粒径分布统计结果见图3，,其紫外–可见吸收光谱见图4，其荧光激发发射光谱见图5，其在不同pH环境中650nm处的消光度见图6。由以上各图可知，制得的SiNDs呈均匀球状，粒径大致为2.5nm，其最大紫外吸收峰位于511nm处，最大激发波长和最大发射波长分别为511nm和525nm。经计算，该SiNDs的荧光量子产率可高达100％。特别地，由图6可知该SiNDs在弱酸性环境条件下易聚集沉淀，这一特性使其在进入细胞内酸性溶酶体中导致颗粒聚集，从而实现长时间的溶酶体成像。
实施例2
测试实施例1所制得的SiNDs对A549细胞的溶酶体成像效果，方法如下：
(1)细胞培养：将A549细胞以5×103个/孔的密度将种于96孔板中，于37℃、5％CO2环境中培养24h；
(2)细胞染色：将每个孔中的培养液换成含20 g/mL SiNDs的新鲜培养液，于37℃、5％CO2环境中分别培养2、4、18和24h后，用磷酸缓冲液(PBS)清洗2遍。而后，用商品化的红色溶酶体荧光染料(LT-Red)和细胞核染色试剂(Hoechst 33342)分别染色30和10分钟。最后，用PBS清洗细胞2遍；
(3)共聚焦荧光显微镜成像观测：用波长为405、488和552nm激光作为激发光，Hoechst 33342染料在405nm激发光激发下发射蓝色荧光，而SiNDs在488nm激发光激发下发出绿色荧光，LT-Red染料在552nm激光下则呈红色荧光。
溶酶体成像和共定位结果见图7。由图可见，该SiNDs进入细胞后主要分布于一些点状位置，通过与红色的商品化溶酶体荧光染料(LT-Red)共定位分析后，证实该SiNDs点亮的区域为溶酶体，且与溶酶体染料共定位率经计算后高达98％。此外，即使将加药时间延长至24h，该SiNDs仍停留于溶酶体中。因此，本发明合成的SiNDs靶向溶酶体的能力不会随加药时间的改变而不同，体现了其溶酶体成像的稳定性。
实施例3和4
测试商品化的溶酶体绿色荧光染料(LT-Green)和红色荧光染料(LT-Red)对A549细胞的溶酶体成像效果。
实施例3和4的操作过程与实施例1基本相同，只需将步骤(2)中SiNDs换成1LT-Green和LT-Red分别培养30min，4h和8h。
溶酶体成像效果见图8和9。观察图8和图9可知，加药时间的改变对绿色的溶酶体荧光染料LT-Green的影响甚微，但却极大程度的改变了LT-Red的染色位点。随加药时间延长至4h，LT-Red转移至除溶酶体之外的细胞质和细胞核膜等区域，甚至在8h的时候，有些染料已进入细胞核。由此可见，较LT-Red而言，本发明合成的SiNDs更适用于长时间跟踪溶酶体成像。
实施例5
测试实施例1制得的SiNDs与商品化的LT-Green和LT-Red在清洗后的溶酶体成像稳定性，方法如下：
(1)细胞培养：该过程与实施例2中的步骤(1)一致；
(2)细胞染色与清洗：将细胞培养孔中的培养液分别换成含SiNDs(20μg/mL)，LT-Green(1μM)和LT-Red(1μM)的新鲜培养液，对应孔染色2h、30min和30min。经PBS清洗两遍后，于37℃、5％CO2的黑暗环境中分别培养0、1、2、4、12、24、36和48h后，置于共聚焦荧光显微镜下观察；
(3)溶酶体成像效果观测：用488nm和552nm激光作为激发光。其中，SiNDs和LT-Green在488nm激光下发出绿色荧光，LT-Red在552nm激光下发射红色荧光。
荧光成像结果见图10。对比三种染料的成像结果可知，商品化的溶酶体染料LT-Green和LT-Red在细胞经清洗后的2h内，二者的荧光均显著减弱。明显不同的是，本发明制备的SiNDs在细胞经清洗后48h内仍具有很强的荧光，因此可实现超长时间的溶酶体清晰成像。
实施例6
测试实施例1制得的SiNDs与商品化的LT-Red在激光下照射不同时间后的溶酶体荧光成像稳定性。方法如下：
(1)细胞培养：该过程与实施例2中的步骤(1)一致；
(2)细胞染色：将细胞培养孔中的培养液分别换成含SiNDs(20μg/mL)和LT-Red(1μM)的新鲜培养液，分别染色2h和30min后，用PBS清洗细胞两遍；
(3)激光照射：将染色后的细胞置于488nm激光下分别照射0、0.5、1、3、5、10、15、20和30min后，用共聚焦荧光显微镜观察；
(4)荧光稳定性观测：用488nm和552nm激光作为激发光。其中，SiNDs在488nm激光下发出绿色荧光，LT-Red在552nm激光下发射红色荧光。
由图11可见，在激光照射3min之内LT-Red的荧光明显减弱，而本发明制得的SiNDs则在照射20min后仍保持清晰的溶酶体成像效果。该实验证实了SiNDs在抗光漂白稳定成像方面的显著优势。
实施例7
测试实施例1制得的SiNDs与商品化的LT-Green和LT-Red耐固定和耐透化的能力。步骤如下：
(1)细胞培养：该过程与实施例2中的步骤(1)一致；
(2)细胞染色：该过程与实施例5中的步骤(2)一致，用含SiNDs(20μg/mL)，LT-Green(1μM)和LT-Red(1μM)的新鲜培养液分别染色2h，30min和30min。染色后的细胞均置于共聚焦荧光显微镜下观察；
(3)细胞固定：将染色后的细胞置于含4％戊二醛的磷酸缓冲液中30分钟后，用PBS清洗2遍，于共聚焦荧光显微镜下观察溶酶体成像结果；
(4)细胞透化：细胞经固定步骤后，再用含0.1％Triton X-100的磷酸缓冲液处理10分钟，最后用PBS清洗细胞2遍，置于共聚焦荧光显微镜下观察。共聚焦荧光显微镜的设置条件与实施例5中的步骤(3)一致。
由图12可知，LT-Green和LT-Red均不适用于经固定和透化后的细胞的溶酶体成像，而本发明制得的溶酶体成像探针具有耐固定和抗透化能力。
实施例8
测试实施例1制得的SiNDs在不同细胞系中的溶酶体成像效果，其操作步骤与实施例2大致相同，只需将实施例2中的A549细胞分别换成正常肺细胞AT II、乳腺癌细胞MCF-7和巨噬细胞Raw 264.7，染色时间改为2h即可。
图13表明本发明合成的SiNDs在不同细胞系中均具有优异的溶酶体成像能力。
实施例9
测试实施例1制得的SiNDs对A549细胞在黑暗条件和光照条件下的细胞毒性，其操作步骤如下：
(1)细胞培养：该过程与实施例2中的步骤(1)一致；
(2)SiNDs处理：将细胞培养孔中的培养液分别换成含不同浓度SiNDs的新鲜培养液，SiNDs的浓度梯度为：0，50，100，200，500和1000μg/mL，于37℃、5％CO2环境中培养24h之后。将细胞分为两组，一组置于白光下照射30min，另一组则置于黑暗环境下。随后，将两组细胞均放于37℃、5％CO2环境中培养4h；
(3)细胞活性检测：通过MTT法检测细胞毒性。
细胞存活率结果如图14。由图可知，即使SiNDs的浓度高达200μg/mL，光照和不光照组的细胞均保持90％以上的活性，体现了本发明合成的SiNDs的低毒性，使其成为一种安全的溶酶体成像荧光探针。