技术领域
本发明涉及生物传技术技术领域，特别涉及一种生物传感器及基因捕获系 统的构建方法。
背景技术
合成生物学是生命科学的最新分支领域之一，它通过分子生物学手段，对 细胞软件(以DNA为代表的遗传物质)和硬件(以核糖体为代表的细胞器)进 行系统改造，使之具备特定功能。这些活体细胞能自我复制并作为“合成工厂”， 将简单和低价的能量和物质(例如阳光与二氧化碳)转化为具有高附加值的药 物、材料和生物能源，将化学品的浓度或毒性转变为可被测量的信号，或用于 消除难降解污染物。发展合成生物学，对于解决关系国计民生相关的重大经济 与技术问题有着长远的战略意义和现实的策略意义，因此，2009年英国皇家工 程学会报告指出，合成生物学带来的突破和效益“必将成为国家财富的重要组成 部分”。
合成生物学技术的发展首先取决于具有创新功能的生命组分(基因、蛋白、 细胞、群落等)的获得，以及对细胞内生命组分的运作机制的理解，而两大瓶 颈制约了上述关键过程。首先，作为分子生物学研究中最易操作的研究对象与 载体，微生物的生物量大约占据了全球总生物量的一半，其所提供的各种合成、 代谢、调控基因和蛋白，使微生物成为合成生物学的最重要资源库。对微生物 的细胞工程、基因工程改造，已经应用于工业、农业、医药、环保等领域并产 生巨大的价值。目前微生物资源获取主要依赖于细胞培养分离，然而根据估计， 自然环境中超过99％的微生物为不可培养微生物，不能通过传统的培养方法分 离和研究，这些不可培养微生物中蕴含着大量未知的功能基因，且可能具有比 可培养微生物更重要的功能。不可培养微生物数量巨大，Craig Venter在百慕大 Sargasso海域研究中，仅在数百升海水中就发现了148种新的微生物和大约120 万个未知基因。另有研究表明，仅1克土壤中就含有超过18,000种微生物，这 一数字已经超过已知原核生物的总数(16,177种)。通过相关研究，人们逐渐认 识到不可培养微生物作为一种尚未被开发的生物资源，在生物能源、工业生物 催化、环境修复、医药等领域具有难以估量的价值。
现有基因捕获技术主要依靠宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白组学，通过 直接分析环境样品中获取的DNA、RNA和蛋白质，研究其微生物功能基因与环 境条件之间的关系。由于RNA稳定周期短、蛋白质纯化和扩增困难，因此宏转 录组学宏基因组学的研究受到很大局限。现阶段主要采用宏基因组学，基于其 分析结果获得数据庞大的宏基因组数据库。通过序列驱动筛选和功能驱动筛选 两大类主要研究方法，鉴定环境微生物资源中可能具备的功能基因。序列驱动 筛选主要依靠两类技术获得功能基因信息。第一类技术通过对特定环境样品的 完全测序和大量生物信息学手段分析序列来获得基因数据。第二类技术使用简 并引物或探针，通过链式聚合酶反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)或不 同的杂交手段获得与已知功能基因序列类似的环境样品中的基因。然而序列驱 动筛选所面临的主要问题是缺乏对所获取未知基因的功能解析，也不能确定相 关未知基因在实际环境条件下的功能性。功能驱动筛选主要依靠将未知基因导 入到合适的宿主菌中表达，通过宿主菌所获得的新表观形态或代谢功能来确定 未知基因的功能性。现有宿主菌的分选方法主要依靠表观形态识别(基于颜色 和形态改变)或限制性培养基(基于唯一碳源或抗生素)，限制了其分选的适用 范围和可筛选基因的种类。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提出了一种以现有的宏基因组学相关技术为基 础而开发的基于全细胞生物传感器的微生物新型功能基因捕获系统的构建方法 及其应用方法。该方法可用于已知或未知基因的捕获。
本发明提供的生物传感器是以不动杆菌Acinetobacter baylyiADP1为底盘生 物构建的转化体或重组体，其构建方法包括以下步骤：
在不动杆菌Acinetobacterbaylyi ADP1的salA-salR基因中构建BamHI和 EcoRI限制性内切酶酶切位点，通过引物及引物上的BamHI酶识别位点和EcoRI 酶识别位点获得不动杆菌Acinetobacter baylyi ADP1的salA-salR基因的5’部分 和3’部分；
将salA-salR基因的5’部分和3’部分连接，获得完整的salA-salR基因；
将所述salA-salR基因与pGEM-T载体连接，获得重组表达载体pSalAR_BE， 进而获得质粒pSalAR_BE；
利用内切酶酶切所述质粒pSalAR_BE，获得线性pSalAR_BE；
将经过内切酶酶切的含有报道基因的质粒和所述线性pSalAR_BE连接，获 得含有所述报道基因的表达载体；
利用所述含有报道基因的表达载体筛选具有所述报道基因特性的单克隆菌 株；
利用所述单克隆菌株和所述Acinetobacter baylyi ADP1的感受态细胞浓缩液 筛选出具有所述报道基因特性的所述生物传感器。
作为优选，
用于获得获得不动杆菌Acinetobacter baylyi ADP1的salA-salR基因的5’部 分的引物是
P1：5’-CTCAAAGGAAATGAGTCGTGGGTA-3’
P2：5’-TCAAAACACTCTGGATCCGAATTCTTAGCG-3’
所述引物P2上具有BamHI酶识别位点；
用于获得不动杆菌Acinetobacter baylyi ADP1的salA-salR基因的3’部分的 引物是
P3：5’-CGCTAAGAATTCGGATCCAGAGTGTTTTGA-3’
P4：5’-GACCTGAGTATGCCCGGTAG-3’
所述引物P3上具有EcoRI酶识别位点。
作为优选，所述报道基因是发光基因luxCDABE，含有所述发光基因 luxCDABE的表达载体是pSalAR_lux，所述生物传感器是能够生物自发光的单克 隆Acinetobacter baylyi ADPWH_lux。
作为优选，所述报道基因是绿色萤光蛋白基因gfp，含有所述绿色萤光蛋白 基因gfp的表达载体是pSalAR_gfp，所述生物传感器是在蓝色波长范围的光线 的激发下发出绿色萤光的单克隆Acinetobacter baylyi ADPWH_gfp。
作为优选，所述连接是利用T4 DNA连接酶实现的。
本发明提供的基因捕获系统的构建方法，包括基因片段的捕获和对所述捕 获的基因片段进行测序得到所述捕获的基因片段的序列，
所述基因片段的捕获包括以下步骤：
从环境样品中提取总DNA，
从所述总DNA中分离出被稳定同位素标记的DNA，
对所述被稳定同位素标记的DNA进行预处理，得到随机外源DNA片段， 即为捕获的基因；
对所述捕获的基因进行测序包括以下步骤：
将所述随机外源DNA片段整合到载体的位点，所述外源DNA片段与所述 载体形成第I种质粒，从而得到外源DNA片段的靶标库，
将所述靶标库导入到所述生物传感器中，获得宿主菌菌液，
从所述宿主菌菌液中筛选出能够成功导入所述第I种质粒的转化菌株，即 为目标转化菌株，
从所述目标转化菌株中提取第II种质粒，
对所述第II种质粒进行DNA测序，得到所述第II种质粒的DNA序列，即 为所述捕获的基因片段的序列。
作为优选，对所述被稳定同位素标记的DNA进行预处理，得到随机外源 DNA片段时，是采用超声波技术或酶切技术实现的。
作为优选，将所述随机外源DNA片段整合到载体的位点时，所述质粒的位 点为经过BamHI酶切处理的pWH1274质粒的BamHI位点。
作为优选，所述将所述质粒库导入到所述生物传感器中，获得宿主菌菌液 中的导入技术选自电击转导、自然转导、超声转导中的一种。
本发明提供的基因捕获系统的构建方法及其应用方法的有益效果在于：
本发明提供的基因捕获系统的构建方法提供了一种以现有的宏基因组学相 关技术为基础而开发的基于全细胞的生物传感器的及从环境样品中捕获功能基 因的技术。
具体实施方式
为了深入了解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
本发明提供的生物传感器是以不动杆菌Acinetobacter baylyiADP1为底盘生 物构建的转化体或重组体，其构建方法包括以下步骤：
步骤1：在不动杆菌Acinetobacterbaylyi ADP1的salA-salR基因中构建BamHI 和EcoRI限制性内切酶酶切位点，通过引物及引物上的BamHI酶识别位点和 EcoRI酶识别位点获得不动杆菌Acinetobacter baylyi ADP1的salA-salR基因的5’ 部分和3’部分。
其中，用于获得不动杆菌Acinetobacter baylyi ADP1的salA-salR基因的5’ 部分的引物是
P1：5’-CTCAAAGGAAATGAGTCGTGGGTA-3’
P2：5’-TCAAAACACTCTGGATCCGAATTCTTAGCG-3’
引物P2上具有BamHI酶识别位点；
用于获得获得不动杆菌Acinetobacter baylyi ADP1的salA-salR基因的3’部 分的引物是
P3：5’-CGCTAAGAATTCGGATCCAGAGTGTTTTGA-3’
P4：5’-GACCTGAGTATGCCCGGTAG-3’
引物P3上具有EcoRI酶识别位点。
步骤2：将salA-salR基因的5’部分和3’部分连接，获得完整的salA-salR基 因。
其中，连接可以利用T4 DNA连接酶实现。
步骤3：将salA-salR基因与pGEM-T载体连接，获得重组表达载体 pSalAR_BE，进而获得质粒pSalAR_BE。
其中，连接可以利用T4 DNA连接酶实现。
步骤4：利用内切酶酶切质粒pSalAR_BE，获得线性pSalAR_BE，其中， 内切酶可以是EcoRI内切酶。
步骤5：将经过内切酶酶切的含有报道基因的质粒和线性pSalAR_BE连接， 获得含有报道基因的表达载体，其中，内切酶可以是EcoRI内切酶。
步骤6：利用含有报道基因的表达载体筛选具有报道基因特性的单克隆菌 株；
步骤7：利用单克隆菌株和Acinetobacter baylyi ADP1的感受态细胞浓缩液 筛选出具有报道基因特性的生物传感器。
其中，
报道基因可以是发光基因luxCDABE，含有发光基因luxCDABE的表达载体 是pSalAR_lux，生物传感器是能够生物自发光的单克隆Acinetobacter baylyi ADPWH_lux。或者，
报道基因可以是绿色萤光蛋白基因gfp，含有绿色萤光蛋白基因gfp的表达 载体是pSalAR_gfp，生物传感器是在蓝色波长范围的光线的激发下发出绿色萤 光的单克隆Acinetobacter baylyi ADPWH_gfp。
本发明提供的基因捕获系统的构建方法，包括基因片段的捕获和对捕获的 基因片段进行测序得到捕获的基因片段的序列，其中：
基因片段的捕获包括以下步骤：
步骤1：从环境样品中提取总DNA。
步骤2：从总DNA中分离出被稳定同位素标记的DNA，其中，稳定同位素 可以是13C。
步骤3：对被稳定同位素标记的DNA进行预处理，得到随机外源DNA片 段，即为捕获的基因。
其中，对被稳定同位素标记的DNA进行预处理，得到随机外源DNA片段 可以采用超声波技术或酶切技术实现。
对捕获的基因进行测序包括以下步骤：
步骤4：将随机外源DNA片段整合到载体的位点，外源DNA片段与载体 形成第I种质粒，从而得到外源DNA片段的靶标库。
其中，将随机外源DNA片段整合到载体的位点时，质粒的位点可以为经过 BamHI酶切处理的pWH1274质粒的BamHI位点。
步骤5：将靶标库导入到生物传感器中，获得宿主菌菌液。
步骤6：从宿主菌菌液中筛选出能够成功导入第I种质粒的转化菌株，即为 目标转化菌株。
其中，将质粒库导入到生物传感器中，获得宿主菌菌液中的导入技术选自 电击转导、自然转导、超声转导中的一种。
步骤7：从目标转化菌株中提取第II种质粒。
步骤8：对第II种质粒进行DNA测序，得到第II种质粒的DNA序列，即 为捕获的基因片段的序列。
实施例
本实施例提供的生物传感器以生物传感器Acinetobacter baylyi ADPWH_lux 为例，其构建方法如下：
1)在不动杆菌Acinetobacterbaylyi ADP1的salA-salR基因中构建BamHI和 EcoRI限制性内切酶酶切位点，通过引物及引物上的BamHI酶识别位点和EcoRI 酶识别位点获得不动杆菌Acinetobacter baylyi ADP1的salA-salR基因的5’部分 和3’部分。在不动杆菌Acinetobacter baylyi ADP1的salA-salR基因中构建BamHI 和EcoRI限制性内切酶酶切位点，其中，Acinetobacter baylyi ADP1(Barbe et al.， 2004)染色体DNA已全部测序，可由NCBI Genebank数据库获得(NC_005966.1)。 设计如下引物通过PCR反应获得Acinetobacter baylyi ADP1完整的salA-salR基 因的5’部分和3’部分：
P1：5’-CTCAAAGGAAATGAGTCGTGGGTA-3’
P2：5’-TCAAAACACTCTGGATCCGAATTCTTAGCG-3’
P3：5’-CGCTAAGAATTCGGATCCAGAGTGTTTTGA-3’
P4：5’-GACCTGAGTATGCCCGGTAG-3’
其中，P1，P2为一对引物，用以扩增salA-salR基因的5’部分；P3，P4为 一对引物，用以扩增salA-salR基因的3’部分。
在引物P2和P3上分别设计EcoRI和BamHI的酶识别位点。
以Acinetobacter baylyi ADP1细胞为模板，PCR的反应条件如下：
PCR产物进行1％的琼脂糖电泳后，使用QIAGEN公司的QIAquick gel extraction kit进行切胶纯化。分别获得salA-salR基因的5’部分和3’部分。
2)将salA-salR基因的5’部分和3’部分连接，获得完整的salA-salR基因。
以步骤1)中所获得的salA-salR基因的5’部分和3’部分为模板，同时以P1 和P4为引物，进行重叠PCR反应，得到完整的salA-salR基因。PCR反应条件 如下：
PCR产物进行1％的琼脂糖电泳后，使用QIAGEN公司的QIAquick gel extraction kit进行切胶纯化。获得完整的salA-salR基因。
3)将salA-salR基因与pGEM-T载体连接，获得重组表达载体pSalAR_BE， 进而获得质粒pSalAR_BE。用T4 DNA连接酶(New England Biolabs)将步骤2) 中经纯化的salA-salR基因与商业载体pGEM-T连接，获得重组表达载体 pSalAR_BE，转化入大肠杆菌JM109感受态细胞(由Promega公司购得)，在含 有氨苄西林，表面涂布IPTG和X-Gal的LB平板上进行蓝白斑筛选，得到阳性 重组菌。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)提取重组菌质粒，获得质 粒pSalAR_BE。
4)利用EcoRI内切酶(New England Biolabs)酶切质粒pSalAR_BE，获得 线性pSalAR_BE。
5)将经过EcoRI内切酶酶切的含有发光基因luxCDABE的质粒和线性 pSalAR_BE连接，获得含有发光基因的表达载体pSalAR_lux。
6)利用含有发光基因luxCDABE的表达载体pSalAR_lux筛选具有报道基因 特性的单克隆菌株。含有发光基因luxCDABE的表达载体pSalAR_lux转化入大 肠杆菌JM109感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB培养基上筛选发光的单克 隆菌株。
7)利用发光的单克隆菌株和Acinetobacter baylyi ADP1的感受态细胞浓缩 液筛选出具有报道基因特性的生物传感器Acinetobacter baylyi ADPWH_lux。 Acinetobacter baylyi ADP1感受态细胞的制备：在LB培养基中接种Acinetobacter baylyi ADP1细胞；30℃过夜培养的ADP1细胞按照体积比为1∶20接种至新 鲜LB培养基，30℃下震荡培养3小时。通过离心将Acinetobacter baylyi ADP1 感受态细胞浓缩十倍，向其中加入1-10μL发光的单克隆菌株，在30℃下培养 3小时。培养后将细胞涂布在LB培养基上进行筛选，生长出的能够生物自发光 的单克隆Acinetobacter baylyi ADPWH_lux即为生物传感器Acinetobacter baylyi ADPWH_lux。
本实施例提供的基因捕获系统的构建方法以环境样品中捕获萘降解基因为 例：
使用13C稳定同位素标记的萘(＞99％)作为碳源，将其加入到原位地下水中用 以富集萘降解相关基因。萘的投加浓度为3.8μM，与原位地下水中萘污染的浓 度相同。从上述经过13C稳定同位素富集的环境样品中提取总DNA，使用超速 离心机(Optima L-80 XP Ultracentrifuge，Beckman Coulter)将其中13C标记的 DNA分离出来。对上述13C标记的DNA使用Sau3AI酶切技术，将其随机打断 成长度为2kb至10kb的外源DNA片段。利用琼脂糖凝胶回收长度为4kb-10kb 的DNA片段。使用BamHI酶切预处理pWH1274质粒。使用Fast-Link DNA Ligation Kits(由EPICENTRE购得)将随机外源DNA片段整合到质粒pWH1274 的BamHI位点，并构成环状DNA质粒，得到外源DNA片段的靶标库。将得到 的靶标库与生物传感器Acinetobacter baylyi ADPWH_lux细胞混合，采用电击转 导的方式将基因靶标库导入到生物传感器Acinetobacter baylyi ADPWH_lux中， 得到宿主菌菌液。取100μL宿主菌菌液，涂布于含有300mg/L氨苄青霉素和 50μM 1，2-二羟基苯的LB固体培养基中，30℃条件下培养过夜，筛选出成功导 入质粒的转化菌株库，即为具有发光基因的目标转化菌株库。提取筛选出的目 标转化菌株中的质粒，通过DNA测序的方法获得目标DNA的序列，即为捕获 的基因片段的序列。
本发明提供的基因捕获系统的构建方法提供了一种以现有的宏基因组学相 关技术为基础而开发的基于全细胞的生物传感器及从环境样品中捕获功能基因 的技术。
以上的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一 步详细说明，所应理解的是，以上仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于 限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改 进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 北京惟馨雨生物科技有限公司
<120> 一种生物传感器及基因捕获系统的构建方法
<160> 13
<210> 1
<211> 2286
<212> DNA
<213> 不动杆菌（Acinetobacterbaylyi ADP1）的salA-salR基因
<400> 1
GTGGGTAAAAAAATTAGTATAGCCATTATTGGTGGTGGTATTGCAGGGGTCGCGCTTGCAGCCAACTTATTTAAGCAACCACATTTAGAGGTTTGCTTGT 100
ATGAAGCAGCACCTCAATTTTCTGAAATTGGTGCCGGAATTTCATTTGGCGCGAATGCGGTTCGTGCCATTGAGCTACTTGGTTTGGCTTCGCAATATAC 200
CGCGATTGCAGATCAAGTATCTGCGCCATTTCAGGATGTGTGGTTTCAATGGCGAAATGGTTATAACGATGATTATTTGTCGAGTTCAATTTCTCCTCAG 300
GTTGGTCAGTCTTCGGTGCATCGTGCCGATTTCTTAGATGCTATTTTAGGGAATATTCCACAGCACCAGTGTAAGTTTAATAAAAAACTCAAATCGATTC 400
AGGAGTACGACACACATATTGAATTGAGTTTTGAAGATGGTACATGCGCCGAAGCCGATTATGTGATTGGTGCAGATGGCATACACTCAGCCACGCGTGA 500
TTATGTGCTGCAAACCCATCAGTTTGCTCCAGTGCGTCCTAATTTTACTGGAACATGGGCTTACCGAGGCATTATTAAAGCAGCAGAATTTAGGCAAGCC 600
ATTGTCGCAGCCGGCCTAGATGTAGAAATTGCCGACGTACCACAAATGTTTTTAGGCCAAAACAAGCACATTTTAACCTTTCCGATTCGTCAAGGTGAAG 700
ACATTAACATTGTGGCGTTTAAGACAAACCCTGAGCAGCGTACGCTTCCAGAACATACCCCATGGACACGTGCGGTAGACAAACAGGAAATGTTGGACGA 800
TTTTCAGGACTGGAGCGAAAGCTGCCGAATTTTACTCGGTTTGATTGAGCGTCCGACCTTGTGGGCACTGCACGAACTGGCCGAATTGCCGACTTATCAA 900
AGCCACTCTGGCCGCGTCATATTAATGGGAGATGCTGCGCACGCCATGCTTCCACATCAGGGTGCCGGAGCAGGACAAGGGCTTGAAGATGCACTCACGC 1000
TCAAAGTATTGTTTGAGCACACTGAGCTGACTGTTGAAGATTTACCGCGAGTTTCTGCAATTTATGAACAGATCCGAAAAGAACGCGCCTGCAAGGTTCA 1100
GCGTACTTCGCGTGAGTCTGGGCAAATATATGAACTTAACTCAGCACTGTATCCAAGCTTTGAAGCAGTGGGTGCACATTTGCAAAACCGTTTTGACTGG 1200
TTATGGCAGCATGATTTAGCACAAGACATGTTAGCCGCGCGAGCAGCAATACAACCTGTTGCAACGATTTAAACGCTAAGAATTTGGCACAAGAGTGTTT 1300
TGAACGACTTGTGCCTTTAAAACAATTCTATTTTGAAAGAGTTGAATAAAAGTGTTTATGATAGGATTAAATTAAAATCATGGAAGATTCTAAAACGTGG 1400
ACTTAAGCCTGATCCGTATTTTTATTTGTGTTTATGAAAATAAAAATATCAGTAAAGCCGCTGAGATTTTAAATCTGAGTCAACCTTCTGTTACCTATAA 1500
TTTAAATCGATTACGTAAGCATTTAAATAATCCTTTATTTGAACGCACGCAATATGGTGTGGAAGCAACTAAATTATCGCATGAATTATATCCTGTATTT 1600
AAAGAGTCGATTTTAAAAATTGAAATAGCAGTCGATGAGGCATTAAATTTTAATCCACTCACTTCAAATAAAACCTTTCGAATTGGTTTATCAGATATTG 1700
GTGAAATTTGCTTGTTACCGACATTAATCGAATACTTACGAGCACATGCACCAAAAATAAAAATAGAAGTAGAAGAGATTAAAATTGATCAAGTCGAAAA 1800
ATGGTTAATCGAAGGATTTATTGATGTGGCTGTTTTTAATAGTACACATTTGGAGTTTAAGCATCTTGAATATGAAACTCTTTTTTTAGAGCGATATGTT 1900
GCACTGGTCAACATGAATCATCCGCGAATAAGAAGTACGCTCAGTTTTGATGCGTATTTGAATGAATCTCATGTGGCGATAAAGTCATCTACCGGGCATA 2000
CTCAGGTCGATCATGTATTAAAACTAATGGGGCATCAGCGTAAAATTGCCTTGGAAGTGCCACATTTTGGAGTTTTACAAGGTGTGCTGGATAAAACAGA 2100
TTTGATGGTGACGCTGCCCAGTCGTGCTGCACAGCAATATTTAAATCAATCCCATGTCCGTGTTTTGGAGTTGCCGTTTCAAATGTCTGAATTTTATGTG 2200
GGCTTACATTGGTTTGCCCAAACCAATGAGCCCCTTGCTCGGATATGGTTGATTCAAACCTGTAAAAAGGTTATTTCAGTTTTGTA 2286
<210> 2
<211> 3000
<212> DNA
<213> pGEM-T载体
<400> 2
GGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAAC 100
GCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACA 200
ATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTT 300
TCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCAC 400
TGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAG 500
AACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAA 600
ATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCT 700
GCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGC 800
TCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTAT 900
CGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAG 1000
AAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGT 1100
GGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAA 1200
ACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATA 1300
TGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTC 1400
GTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAA 1500
ACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTC 1600
GCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGA 1700
TCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCAC 1800
TCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATA 1900
GTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCT 2000
TCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCA 2100
GCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATA 2200
TTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGA 2300
AAAGTGCCACCTGATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGT 2400
TAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGT 2500
TCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCA 2600
CCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACG 2700
TGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAA 2800
TGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAG 2900
GGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATA 3000
<210> 3
<211> 5025
<212> DNA
<213> pSalAR_BE载体
<400> 3
GGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATCTCAAAGGAAATGAGTCGTGGGTAAAAAAATTAGTATAGCCATTATTGG 100
TGGTGGTATTGCAGGGGTCGCGCTTGCAGCCAACTTATTTAAGCAACCACATTTAGAGGTTTGCTTGTATGAAGCAGCACCTCAATTTTCTGAAATTGGT 200
GCCGGAATTTCATTTGGCGCGAATGCGGTTCGTGCCATTGAGCTACTTGGTTTGGCTTCGCAATATACCGCGATTGCAGATCAAGTATCTGCGCCATTTC 300
AGGATGTGTGGTTTCAATGGCGAAATGGTTATAACGATGATTATTTGTCGAGTTCAATTTCTCCTCAGGTTGGTCAGTCTTCGGTGCATCGTGCCGATTT 400
CTTAGATGCTATTTTAGGGAATATTCCACAGCACCAGTGTAAGTTTAATAAAAAACTCAAATCGATTCAGGAGTACGACACACATATTGAATTGAGTTTT 500
GAAGATGGTACATGCGCCGAAGCCGATTATGTGATTGGTGCAGATGGCATACACTCAGCCACGCGTGATTATGTGCTGCAAACCCATCAGTTTGCTCCAG 600
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CAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGA 5700
TCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCAC 5800
TGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAG 5900
TTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCA 6000
AGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAA 6100
AAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCA 6200
GGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC 6300
TAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAA 6372
<210> 9
<211> 4973
<212> DNA
<213> 实施例中捕获的基因片段的序列
<400> 9
ATGAAGACGAAATTGTTCATCAACAACACCTGGAGCGCTTCGAGTGACAAAAAGTCATTCGATCGCAAGCACCCTGTCAGTGGCGAGGTCGTGACCCAAT 100
GCGCGAACGCCACGGTGGACGATGCGGTCAATGCGGCTCGAGCCGCTCAAGAGGCGTTCAAGTCCTGGAAGGCCGTCGGACCCTCGGAGCGGCGGCGCCT 200
TCTTTTGAAGGTGGCAGACGTCATGGAGAGCAAAACGCCCGAGTTCATCGAAGTGATGGCCAAGGAAGTGGGCGCCTCCGCGCTATGGGCGGGGTTCAAC 300
GTGCACCTGTCGGCCAATGTGTTCCGGGAAGCCGCCTCACTGGCCACGCAAATACAAGGTGAAACCATTCCGACGGACAAGGCTGACACCCTGTCGATGA 400
CGCTGCGTCAACCGGTCGGCCCCATCTTGAGTATCGCGCCATGGAACGGCACCGCAGTGCTCGCGGCGCGGGCCATCGCGTATCCGTTGGTCTGCGACAA 500
TACCGTGGTGTTCAAAGGCTCCGAGTTCAGCCCCGGCACGCACGCGTTGATCGCGAAGTGCGTACAGGAGGCCGGCCTGCCCGCTGGCGTGCTCAATTAT 600
CTGAACTCGTCCCCGGACCGCTCGCCCGATATCGCCGATGCGCTGATTTCGTCTAAAGAGATTCGTCGCATCAACTTTACGGGCTCCACTCGCGTGGGGC 700
GCATCATCGCCCAGAAAGCGGCCCAACATCTCAAGCGCTGCTTGCTGGAGTTGGGTGGCAAGTCCCCGCTGATCGTTCTGGACGACGCGGACATCGACGC 800
GGCGGTCAAGGCAGCGGTGTTTGGCAGTTTCCTGTTCCAAGGCCAGATCTGCATGTCCACCGAACGCCTGGTGGTCGACGAGAAGATCGCGGACGAATTT 900
GTCGCGAAGTTCGTCGAGAAAACCAAGAAGTTGAGTGCAGGCGATCCGTGCGTGACCGGGGACTGCGTCATTGGTCCGATGGTGTCGTCCAACTCGGGGG 1000
ACCGGATCAATGGCCTGTTGAAAGATGCCATCGACAAGGGTGCCAAGGTCGTGTGCGGTGGTATGGCCGAGGGTGCGGTCATGCCCGCCACGATCCTGGA 1100
CCACGTGACAGCCGACATGCAGATCTACGATGAGGAAACCTTTGGTCCCATCACTGTGGTTGTTCGTTGCAAGGGCGAAGCCGATGCCATCCGTATTGCC 1200
AACGACAGTGCATATGGCCTGTCATCGGGCGTGTTTGGCCGGGACGTGAACCGGGCCCTGCGCGTGGGCATGGCGATCGAATACGGCTCGGTCCATATCA 1300
ACGGGTCCACCGTACAGACCGAGGCGCAGGCGCCTTATGGCGGCACAGAGGCCACCGGTTATGGTCGCTTCGACGGACGCGCGGTGATTGACGAGTTCAC 1400
GGAGATCAAATGGCTGACCATTGAACCGTTCGAGCAGCAGTATCCCTTCTAAGCCGAAGCAACAAAGGAGTTAAACCATGAACAAGCCGGCAGCAGTCAT 1500
TGAATTGGGGTACATGGGCATTTCGGTCAAGGATCCTGCAGCGTGGAAATCCTTTGCCGCAAACATGCTGGGACTTCAAGTCCTCGATGAGGGTGACAAG 1600
GATCGCTTCTATCTGCGAATGGACAATTGGCACCATCGGATCGTGGTTCATCACAACGGTCAAGATGACCTTGAATACCTGGGCTGGCGTGTCGCCGGTC 1700
AACCGGAATTCGAGGCATTAGGTCAAAAGCTCGTGGACGCAGGCTACAAAGTCCGCGTGTGCGACAAAGCCGAAGCACAAGAACGGATGGTGCTGGGCCT 1800
GATGAAGACAGAAGATCCGGGGGGCAACCCGACCGAGATTTTCTGGGGACCTCGGATTGACCTGAACAATCCCTTCCACCCCGGTCGTCCCTTGCACGGA 1900
AAATTTCTAACCGGCGATCAGGGCCTAGGCCACTGCATCGTGCGTCAGAATGATGTTGAAGCGGCGCGTAAGTTCTATAGCTTGCTGGGATTTCGTGGAG 2000
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TGGCCGAATCGGAATATTACGTCGGCGACATCTTCGGCCATGCTATCGAGGCCACAGGATATGGTTTGGACGTCAAGCTGAGCTAACCATGCAATAGATG 2400
CGCAATCGGTCGCATCTATTTTTGTTGCATGCAGTTTTATATAAACATAAGGAGACAATGATGATCAAAAAAGCCATTTCCCTCGCCGCGGTTGGGATGC 2500
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CGGTCGTCGAAACCGCCCGTGGTCGAGTGCCCTACTTCTGCGGCACAACAGCCTTGAATACCCGTGAAGTTATACGCCAGACCCGCGAAGTGATGGACAT 3500
TGGTGCCCAAGGAACCATGCTCGGCGTGCCGATGTGGGTGAAGATGGATCTGCCCACCGCCGTGCAGTTTTATCGCGATGTGGCGGAAGCGGTGCCAGAT 3600
GCTGCCATCGCTGTTTATGCCAACCCGGAGGCTTTCAAATTTGATTTTCCTCGCCCGTTTTGGGCCGAAATGTCCAAAATCCCGCAAGTTGTTACAGCCA 3700
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GAGCAAAAACGGCCATTGGCAACATCGGGCCATCCAATCGGGACCTCAAGGTCAAGCTTGACTACTTAAAGGTGGATTTACAGCGATGGGCCGATCTCTA 4600
TAGGATTCCGTTGGTTTTCCCCCCTAACTTCAACAGCCGCCGGGTGAATGCCGGACTGTATTACCCGGCAGCCAGGGAGCGAGCCGCTGAATATGTTCGC 4700
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TGATCAAATGTGGTGGGGAAATGACCGCCTTTTCATGCTTGAGAGCAGGTTGCAAAAGGAAACGCAACCATAA 4973
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列P1
<400> 10
CTCAAAGGAAATGAGTCGTGGGTA 24
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
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<400> 11
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<210> 12
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CGCTAAGAATTCGGATCCAGAGTGTTTTGA 30
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列P4
<400> 13
GACCTGAGTATGCCCGGTAG 20