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1、(10)申请公布号 CN 102643799 A (43)申请公布日 2012.08.22 CN 102643799 A *CN102643799A* (21)申请号 201210120450.5 (22)申请日 2012.04.23 C12N 15/10(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 中国水产科学研究院淡水渔业研究 中心 地址 214081 江苏省无锡市滨湖区大浮镇戚 塘北村 1 号 (72)发明人 唐永凯 李建林 俞菊华 李红霞 董在杰 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 李纪昌 (54) 发明名称 建鲤 G。
2、APDH 基因含内含子的部分序列的克隆 方法及其 realtimePCR 方法 (57) 摘要 本发明通过克隆建鲤 GAPDH 含内含子的部 分序列， 然后设计跨越内含子的引物， 优化扩增 反应条件， 来消除 DNA 的污染， 从而提高扩增效 率。这样， 可为 GAPDH 作为内参基因， 在利用 realtimePCR 对建鲤功能基因的研究中提供有用 的方法。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 3 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 3 页 附图 3 页 1/1 页 2 1.。
3、 一种建鲤 GAPDH 基因含内含子的部分序列的克隆方法， 按照以下步骤实现 ： 建鲤血 液基因组 DNA 提取， 设计引物、 PCR 扩增， 产物纯化， 转入载体， 蓝白斑筛选， 质粒测序， 其特 征在于 ： 所设计的引物序列为 ： 正向 ： CCGTTCATGCTATCACAGCTACACA 反向 ： GGAAGCAGGATCTTACCATGTGAC 用此方法克隆所得建鲤 GAPDH 基因含内含子的部分序列为如 SEQ ID 中 No.1 所述。 2. 根据权利要求 1 所述克隆方法， 其特征在于 ： 所述 PCR 扩增的反应条件为 ： 95 3min ； 30 循环 94 30s、 57。
4、 30s、 72 1min ； 72延长 8min ； 4度保存。 3. 一种 real time PCR 扩增权利要求 1 中所述建鲤 GAPDH 基因含内含子的部分序列 的方法， 按如下步骤实现 ： 抽提总RNA， 以Oigo dT Primer和Random 6 mers为引物进行RT 反应， 然后以此 RT 液为模板进行 real time PCR， 荧光染料为 SYBR Green I， 其特征在于 ： real time PCR 中的建鲤引物为跨越内含子的定量引物， 其序列为 ： 正向 ： AGCTCAATGGCAAGCTTACTGG 反向 ： GTGGATACCACCTGGTCC。
5、TCTG。 4. 根据权利要求 3 中所述 real time PCR 扩增方法， 其特征在于， 所述 real time PCR 扩增的反应条件为 ： 94 3min， 然后 40 个循环 94 5sec， 62 20sec， 最后 72 3min， 4保存。 权 利 要 求 书 CN 102643799 A 2 1/3 页 3 建鲤 GAPDH 基因含内含子的部分序列的克隆方法及其 realtimePCR 方法 技术领域 0001 本发明属于分子生物学技术领域， 尤其涉及一种建鲤管家基因 GAPDH 基因含内含 子的部分序列的克隆方法及其 real time PCR 方法。 背景技术 00。
6、02 在实时定量 PCR(real time PCR) 中， 目标基因的相对表达量是通过内参基因 的均一化来确定。理想的内参基因应该是它的表达量在不同的组织中恒定， 而且不受实 验处理条件的影响。大量的研究表明， 目前还没有通用的内参基因符合这一条件， 最好 的选择就是内参基因表达量在自己所研究的样品中变化较小。甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH) 是糖酵解反应中的一个酶， 由 4 个 30 40kDa 的亚基组成， 分子量 146kDa。该基因几乎在所有组织中都高水平表达， 在同种 细胞或者组织中的蛋白。
7、质表达量一般是恒定的， 且不受含有的部分识别位点、 佛波脂等诱 导物质的影响而保持恒定， 故被广泛用作 real time PCR 实验操作的管家基因。 0003 在用 Trizol 提取的 RNA 样品中， 不可避免的会有少量的 DNA 残留， 反转录后， cDNA 中还是含有 DNA， 而 DNA 同样会作为模板和 cDNA 一起被扩增， 这必然会影响扩增效率， 从而 影响到实验结果的准确性。为了消除 DNA 的污染， 通常需要将 RNA 样品进行 DNAse 酶处理， 但这会增加样品被染污的机率， 同时也会减少 RNA 的得率， 导致表达量很低的基因甚至无 法检测出。最直接的方法就是通过。
8、设计跨越内含子的引物来消除 DNA 的污染， 优化反应条 件， 使样品中的大片段 DNA 不能被扩增。 0004 建鲤 (Cyprinuscarpio var.jian) 是本中心培育出的遗传性状稳定的鲤鱼新品 种， 具有生长快、 体型佳、 肉质好等优良的经济性状， 已遍及我国 27 个省。本研究通过克隆 建鲤 GAPDH 含内含子的部分序列， 设计一对跨越内含子的定量引物， 建立基于 SYBR Green I 染料技术的建鲤 GAPDH real time PCR 方法， 从而为 GAPDH 作为内参基因， 在利用 real time PCR 对建鲤功能基因的研究中提供有用的方法。 发明内容。
9、 0005 发明目的 ： 本发明目的之一在于克隆出建鲤 GAPDH 基因含内含子的部分序列 ； 本 发明目的之二是基于获得的序列， 设计一对跨越内含子的定量引物， 建立基于 SYBR Green I 染料技术的建鲤 GAPDH real time PCR 方法， 从而为 GAPDH 作为内参基因， 在利用 real time PCR 对建鲤功能基因的研究中提供有用的方法。 0006 技术方案 ： 0007 基于现有技术中存在的问题， 本发明提供一种建鲤 GAPDH 基因含内含子的部分序 列的克隆方法， 按照以下步骤实现 ： 建鲤血液基因组 DNA 提取， 设计引物、 PCR 扩增， 产物纯 化。
10、， 转入载体， 蓝白斑筛选， 质粒测序 ； 其中所设计的引物序列为 ： 0008 正向 ： CCGTTCATGCTATCACAGCTACACA 说 明 书 CN 102643799 A 3 2/3 页 4 0009 反向 ： GGAAGCAGGATCTTACCATGTGAC 0010 用此方法克隆所得建鲤 GAPDH 基因含内含子的部分序列如 SEQ ID 中 No.1 所述。 0011 作为本发明的进一步改进， PCR 扩增的反应条件如下 ： 95 3min、 30 循环 (94 30s、 57 30s、 72 1min)、 72延长 8min， 4度保存。 0012 本发明还提供一种 re。
11、al time PCR 扩增图 1 中所示建鲤 GAPDH 基因含内含子的部 分序列的方法， 按如下步骤实现 ： 抽提总 RNA， 以 Oigo dT Primer 和 Random 6 mers 为引物 进行 RT 反应， 然后以此 RT 液为模板进行 real time PCR， 荧光染料为 SYBR Green I， 其中 real time PCR 中的建鲤引物为跨越内含子的定量引物， 其序列为 ： 0013 正向 ： AGCTCAATGGCAAGCTTACTGG 0014 反向 ： GTGGATACCACCTGGTCCTCTG 0015 作文本发明的进一步改进， real time 。
12、PCR扩增的反应条件为 ： 94 3min， 然后40 个循环 94 5sec， 62 20sec， 最后 72 3min， 4保存。 0016 有益效果 0017 为检验反应的特异性， 在real time PCR后进行融解曲线分析， 以确定得到的产物 是否为目的产物。扩增温度以 0.2的增幅从 65缓慢递增到 95， 连续测定样品的荧光 强度以获取融解曲线。结果见图 2， 其 Tm 温度为 84.8， 只有一个特异峰， 表明无引物二聚 体以及非特异性产物扩增， 表明设计的一对跨越内含子的引物特异性强， 扩增效率高， 反转 录的 cDNA 产物中含有的 DNA 未被扩增， 消除了样品中的 D。
13、NA 污染， real time PCR 条件得 到了较好的优化。 0018 本发明通过克隆建鲤 GAPDH 含内含子的部分序列， 然后设计跨越内含子的引物， 优化扩增反应条件， 来消除 DNA 的污染， 从而增加了扩增的效率。这样， 可为 GAPDH 作为内 参基因， 在利用 real time PCR 对建鲤功能基因的研究中提供有用的方法。 附图说明 0019 图1建鲤GAPDH基因含内含子的部分序列， 其中外显子以大写字母表示， 内含子以 斜体小写字母表示， 定量 PCR 引物以下划线表示 0020 图 2GAPDH 溶解曲线 0021 图 3GAPDH 标准曲线 具体实施方式 0022。
14、 实施例 1 建鲤 GAPDH 基因含内含子的部分序列的扩增 0023 建鲤来自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴养殖基地， 根据 GenBank 上 公布的鲤 GAPDH 基因 cDNA 序列以及斑马鱼 GAPDH 基因的 DNA 序列设计一对引物， 能扩增建 鲤 GAPDH 基因内含子， 见表 1。 0024 表 1 扩增建鲤 GAPDH 的引物 说 明 书 CN 102643799 A 4 3/3 页 5 0025 0026 PCR 是 在 含 有 50ng 基 因 组 DNA、 15mmol/L Tris-HCl、 50mmol/L KCl(pH8.0)、 2mmol/L MgCl。
15、2， 200umol/L dNTPs、 10mol/L 引物和 0.5U Taq DNA 聚合酶的 25l 反应 体系中进行、 反应条件是 95 3min、 30 循环 (94 30s、 57 30s、 72 1min)、 72延长 8min， 4度保存。扩增的 PCR 产物纯化后连接到 pMD18-T 载体， 转化到感受态细胞中， 经 蓝白斑筛选， 挑选阳性质粒， 送到上海博尚生物技术有限公司测序。DNA 序列用 Blast 软件 (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/) 进行分析。建鲤 GAPDH 含内含子的部分序列如图 1 所 示。 0027 实验例 2 建立基于 SY。
16、BR Green I 染料技术的建鲤 GAPDH real time PCR 方法 0028 取建鲤成鱼肝脏约 50mg， 参照 Takara 公司 RNA 提取说明书， 用 Trizol 裂解法抽 提总 RNA。用 1g 总 RNA， 以 Oigo dTPrimer 和 Random 6 mers 为引物， 根据 M-MLV 使用说 明进行 RT 反应， 反应总体积为 10l， 然后以此 RT 液为模板进行 real time PCR， 荧光染 料为 SYBR Green I， 引物见表 2。反应条件为 ： 94 3min， 然后 40 个循环 94 5sec， 62 20sec， 最后 7。
17、2 3min， 4保存。为检验反应的特异性， 在 PCR 后进行融解曲线分析， 以确 定得到的产物是否为目的产物。扩增温度以 0.2的增幅从 65缓慢递增到 95， 连续测 定样品的荧光强度以获取融解曲线。结果显示 ( 图 2)， 其 Tm 温度为 84.8， 只有一个特异 峰， 表明无引物二聚体以及非特异性产物扩增， 表明设计的一对跨越内含子的引物特异性 强， 扩增效率高， 反转录的cDNA产物中含有的DNA未被扩增， 消除了样品中的DNA污染， real time PCR 条件得到了较好的优化。 0029 表 2 建鲤 real time PCR 引物 0030 0031 实验例 3 标准。
18、曲线的建立 0032 以反转录的建鲤肝脏 cDNA 为标准品， 用 Takara 公司提供的稀释液以 10 倍稀释 度进行倍比稀释， 分别稀释至 1/10， 1/100， 1/1000， 1/10000， 1/100000。然后以此 6 个浓度 的标准品 (100 10-5) 进行 real time PCR 反应， 反应条件为 ： 94 3min， 然后 40 个循环 94 5sec， 62 20sec， 最后 72 3min， 4保存。标准曲线方程为 Y -0.3705x+7.48， 其相关系数为 r2 0.991， 见图 3。 说 明 书 CN 102643799 A 5 1/3 页 6。
19、 序列表 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 建鲤 GAPDH 基因含内含子的部分序列的克隆方法及其 realtimePCR 方法 5 PatentIn version 3.3 1 918 DNA 人工序列 1 ccgttcatgc tatcacagct acacagaaga ccgtggacgg gccctcagga aaactgtgga 60 gggatggtcg cggtgccagt cagaacatta tcccagcctc cactggggct gccaaggctg 120 tgggcaaagt cattcctgag ctcaatgggt cagtaacaca actgttggat 。
20、tgtagttcca 180 ttcatttccc agatttgtgt taaatctttt gtgaaaagca tgccgtttta aatgttagag 240 ttcagttttc ctaaaacatg cgttcttgtc ttaggacaac tttgaaaggt tttgatccac 300 ttcaaatgtt gactactgta tttactcaaa agtggaatgt tatgcttggg aacttgttgc 360 atttttgctt ctgctttcca aacatactct gatgcttgtt gcttatttca gcaagcttac 420 tggta。
21、tggcc ttccgtgtcc ccacccccaa tgtgtctgtg gtggatctga cggtccgtct 480 tgagaaacct gtgagtttat ttgcagacct gcataaagtg gcttcagttg aatgaactct 540 gatttgccta cagcaggact gattcattct gcgtacctct gggtgcagtg taggtgaatt 600 序 列 表 CN 102643799 A 6 2/3 页 7 gactgacctg tttgcttttc atctctcttc tgccaactgc aggccaagta tgatgatat。
22、c 660 aagaaagtgg ttaaggctgc ggctgatgga cccatgaaag gcattctggg atacacagag 720 gaccaggttt gcacattgag ttttgtcagt gttgtgaccc agggtttttc agcatattgt 780 tttataactt cctgctgtgt gcaggtggta tccactgact tcaatgggga tgtgcgttca 840 tccatctttg atgccggtgc tggcattgcc ctcaatgatc actttgtcaa gctagtcaca 900 tggtaagatc ctg。
23、cttcc 918 2 25 DNA 人工序列 2 ccgttcatgc tatcacagct acaca 25 3 24 DNA 人工序列 3 ggaagcagga tcttaccatg tgac 24 4 22 DNA 人工序列 4 agctcaatgg caagcttact gg 22 序 列 表 CN 102643799 A 7 3/3 页 8 5 22 DNA 人工序列 5 gtggatacca cctggtcctc tg 22 序 列 表 CN 102643799 A 8 1/3 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 102643799 A 9 2/3 页 10 图 2 说 明 书 附 图 CN 102643799 A 10 3/3 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 102643799 A 11 。