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1、(10)申请公布号 CN 102604889 A (43)申请公布日 2012.07.25 CN 102604889 A *CN102604889A* (21)申请号 201210071586.1 (22)申请日 2012.03.19 CGMCC No.5824 2012.02.29 C12N 5/073(2010.01) C12N 7/00(2006.01) C12P 21/00(2006.01) C12R 1/91(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 地址 150001 黑龙江省哈尔滨市南岗区马端 街 427 号 (72)发明人 仇华吉 孙元 (74)专利代理。
2、机构 北京科龙寰宇知识产权代理 有限责任公司 11139 代理人 孙皓晨 (54) 发明名称 适应无血清培养的 HEK293 细胞系及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种适应无血清培养的HEK293 细胞系及其应用。本发明采用培养液渐进替换的 方法获得了一株适应无血清培养的 HEK293 细胞 (293SF)， 其菌种保藏编号为 ： CGMCC No.5824。经 检测 293SF 细胞具有稳定的腺病毒增殖能力与 外源蛋白表达能力 ； 平均病变时间为 97 小时， 比 HEK293 细胞缩短 12.9 ； 毒价达到 107.48TCID50/ mL， 比 HEK293 细胞提高 43.3 。
3、； 并且随着代数的 提高稳定性良好， 连续传 16 次后 293SF 细胞状态 与易感性没有发生变化。此细胞系可用于腺病毒 载体疫苗的无血清生产。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一株适应无血清培养的 HEK293 细胞系， 命名为 293SF， 保藏在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心， 其菌种保藏编号为 ： CGMCC No.5824。 2. 建立权利要求 1 所述的 HEK293 细胞。
4、系的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： (1)HEK293 细胞进行适应培养前， 采用 10 FBS DMEM 对其进行培养， 细胞铺满培养瓶 底面时用含 0.25 EDTA 的胰酶消化， 1500r/min 离心 5min 收集细胞， 用适应液稀释细胞至 5105个细胞 /mL， 进入适应阶段 ； (2) 适应过程中采用培养液渐进替换的方法， 按照以下步骤进行适应培养 ： 第 1 步 ： 用含有 25的无血清培养基 293 SFM II 和 75的含 10牛血清 DMEM 培养 基， 传代 2 次 ； 第 2 步 ： 用含有 50的 293 SFM II 培养基和 50的含 10牛血清 。
5、DMEM 培养基， 传代 2 次 ； 第 3 步 ： 用含有 75的 293 SFM II 培养基和 25的含 10牛血清 DMEM 培养基， 传代 3 次 ； 第 4 步 ： 用含有 87.5的 293 SFM II 培养基和 12.5的含 10牛血清 DMEM 培养基， 传代 3 次 ； 第 5 步 ： 用含有 95的 293 SFM II 培养基和 5的含 10的牛血清 DMEM 培养基， 根 据细胞状态， 传代 3 5 次 ； 第6步 ： 当第5步细胞生长快速、 状态良好后， 更换为100的293 SFM II培养基传代， 得到适应无血清培养的 HEK293 细胞系。 3. 如权利要求。
6、 2 所述的方法， 其特征在于在适应过程中， 当细胞密度 1106个细胞 /mL 时， 以 3105 5105个细胞 /mL 的细胞密度进行传代培养 ； 完全更换为 100的 293 SFM II 培养基后， 当细胞密度达到 1106 3106个细胞 /mL 时， 以 5105个细胞 /mL 的 细胞密度进行传代培养。 4. 如权利要求 2 所述的方法， 其特征在于处于适应初期的细胞传代时使用胰酶消化 ； 当适应液中 293 SFM II 的比例达到 95时， 停止使用胰酶， 改用弯头吸管将细胞从培养瓶 表面吹下。 5. 如权利要求 2 所述的方法， 其特征在于所述方法还进一步包括待细胞适应无。
7、血清培 养后， 采用含有 400mmol/L GlutaMAX-I 的 293 SFM II 培养液在培养条件为 37、 8 CO2 的培养箱中培养。 6. 培养权利要求 1 所述的 HEK293 细胞系的方法， 其特征在于， 所述的方法分为贴壁培 养和悬浮培养两种 ； 用于贴壁培养时， 在培养细胞前， 使用多聚赖氨酸处理细胞培养瓶促使适应无血清培 养的细胞贴壁， 具体操作如下 ： 用去离子水配制的 PBS 缓冲液稀释多聚赖氨酸至 0.1mg/ml， 经0.22m滤膜过滤备用 ； 将2ml多聚赖氨酸稀释液加入细胞培养瓶中， 摇动培养瓶使液体 铺满瓶底， 放入 37培养箱中孵育 6 小时后取出，。
8、 处理后的培养瓶即可用于所述的 HEK293 细胞系的培养 ； 用于悬浮培养时， 直接将细胞置于未经任何处理的培养瓶中培养。 7. 权利要求 1 所述的 HEK293 细胞系在表达外源蛋白中的应用。 8. 权利要求 1 所述的 HEK293 细胞系在培养腺病毒疫苗载体中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102604889 A 2 1/5 页 3 适应无血清培养的 HEK293 细胞系及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种细胞系及其应用， 特别涉及一种适应无血清培养的 HEK293 细胞 系及其应用。属于生物技术领域。 0002 发明背景 0003 血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种复。
9、杂混合物， 其组成成份包括碳水化合 物、 血浆蛋白、 多肽、 脂肪、 生长因子、 激素、 无机物等， 这些物质是通过促进细胞生长或抑制 细胞生长活性从而达到生理平衡的。除此之外， 血清还提供除营养物质外的激素、 生长因 子， 转运大分子的结合蛋白以及能够促使细胞贴壁并免受机械损伤的促接触和伸展因子。 0004 在常规细胞培养中， 血清是一个不可或缺的成分， 但仍存在一些问题。比如 ： 成份 复杂， 不同批次之间差异明显 ； 而且对于大多数细胞， 血清不是它们在体内的常规内环境， 只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清， 因此使用血清有可能会改变某种细胞在 体内的正常状态。 0005 无血清。
10、培养作为一种新兴的细胞大规模培养方案， 在避免了上述采用有血清培养 基培养的缺点的同时， 并有一些新的特性， 例如培养液成分明确， 不同批次之间各成分含量 没有差异等， 这些特性提高了培养基的稳定性和实验数据的一致性， 并简化了纯化和下游 加工的过程 ； 另外， 无血清培养基不含动物源性大分子蛋白， 避免了细胞水平和机体水平不 必要的副作用 ( 如疫苗过敏反应 )。 0006 重组腺病毒载体作为一种基因转移载体系统， 具有安全、 病毒增殖滴度高、 基因转 移效率高、 宿主谱广等优点， 在疫苗开发、 基因治疗等方面得到广泛应用。但现行的腺病毒 生产工艺存在产量低、 纯化困难、 依赖血清培养等缺点。
11、。 发明内容 0007 为了解决以上问题， 本发明发明人驯化了一株能高效包装腺病毒的无血清细胞 系。本发明以 HEK293 细胞为原始材料， 筛选了一株适应无血清培养的细胞系， 并研究了其 产毒性能和稳定性。 0008 本发明的一株适应无血清培养的 HEK293 细胞系， 其特征在于所述 HEK293 细胞系 命名为 293SF， 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址在北京市朝 阳区北辰西路 1 号院中科院微生物研究所， 其菌种保藏编号为 ： CGMCCNo.5824， 保藏日期为 2012 年 2 月 29 日。 0009 本发明还提供了一种建立以上所述的 HEK293 。
12、细胞系的方法， 其特征在于， 包括以 下步骤 ： 0010 (1)HEK293 细胞进行适应培养前， 采用 10 FBS DMEM 对其进行培养， 细胞铺满培 养瓶底面时用含 0.25 EDTA 的胰酶消化， 1500r/min 离心 5min 收集细胞， 用适应液稀释细 胞至 5105个细胞 /mL， 进入适应阶段 ； 0011 (2) 适应过程中采用培养液渐进替换的方法， 按照以下步骤进行适应培养 ： 0012 第1步 ： 用含有25的无血清培养基293 SFM II和75的含10牛血清DMEM培 说 明 书 CN 102604889 A 3 2/5 页 4 养基， 传代 2 次 ； 00。
13、13 第 2 步 ： 用含有 50的 293 SFM II 培养基和 50的含 10牛血清 DMEM 培养基， 传代 2 次 ； 0014 第 3 步 ： 用含有 75的 293 SFM II 培养基和 25的含 10牛血清 DMEM 培养基， 传代 3 次 ； 0015 第 4 步 ： 用含有 87.5的 293 SFM II 培养基和 12.5的含 10牛血清 DMEM 培 养基， 传代 3 次 ； 0016 第5步 ： 用含有95的293 SFM II培养基和5的含10的牛血清DMEM培养基， 根据细胞状态， 传代 3 5 次 ； 0017 第 6 步 ： 当第 5 步细胞生长快速、 状。
14、态良好后， 更换为 100的 293 SFM II 培养基 传代， 得到适应无血清培养的 293SF 细胞系。 0018 在本发明的方法中， 其特征在于在适应过程中， 当细胞密度 1106个细胞 /mL 时， 以 3105 5105个细胞 /mL 的细胞密度进行传代培养 ； 完全更换为 100的 293SFM II 培养基后， 当细胞密度达到 1106 3106个细胞 /mL 时， 以 5105个细胞 /mL 的细胞 密度进行传代培养。 0019 在本发明的方法中， 其特征在于处于适应初期的细胞传代时使用胰酶消化 ； 当适 应液中 293 SFM II 的比例达到 95时， 停止使用胰酶， 改。
15、用弯头吸管将细胞从培养瓶表面 吹下。 0020 在本发明的方法中， 其特征在于所述方法还进一步包括待细胞适应无血清培养 后， 采用含有 400mmol/L GlutaMAX-I 的 293 SFM II 培养液在培养条件为 37、 8 CO2的 培养箱中培养。 0021 本发明的 HEK293 细胞系 ( 命名为 293SF) 可用于贴壁培养或悬浮培养。为促使细 胞在无血清条件下贴壁， 本发明在培养细胞前， 使用多聚赖氨酸 (PDL) 处理细胞培养瓶， 具 体操作如下 ： 用去离子水配制的 PBS 缓冲液稀释多聚赖氨酸至 0.1mg/ml， 经 0.22m 滤膜 过滤备用 ； 将 2ml 多聚。
16、赖氨酸稀释液加入细胞培养瓶中， 摇动培养瓶使液体铺满瓶底， 放入 37培养箱中孵育 6 小时后取出 ； 处理过的培养瓶即可用于所述的 HEK293 细胞系的培养 ； 0022 用于悬浮培养时， 可直接将细胞置于未经任何处理的培养瓶中培养。 0023 进一步的， 本发明还公开了所述的 HEK293 细胞系在表达外源蛋白中的应用。及所 述的 HEK293 细胞系在培养腺病毒疫苗载体中的应用。 0024 本研究采用目前较为成熟的商品化培养基加以渐进替换法驯化 HEK293 细胞， 最 大限度地减少了培养条件对细胞的冲击， 对保持细胞株活性、 降低细胞株变异有重要作用。 由于无血清培养的 HEK293。
17、 细胞具有悬浮生长的特征， 难以快速区分正常细胞与病变细胞， 因此本实验采用 PDL 处理过的培养瓶培养使无血清细胞贴壁， 使细胞贴壁生长， 以提高病 毒毒价测定数据的准确性。 0025 目前市售用于无血清培养的 293 细胞系有多种， 如 GIBOC 293F、 HEK-293N3S。本 发明中驯化无血清细胞的原材料 (HEK293 细胞系 ) 与以上商品化无血清细胞系相同， 通过 改进驯化工艺和方法获得了本细胞系， 本发明的细胞系具有商品化细胞系的稳定性和实用 性， 同时也为后期实验节约了资金， 降低了疫苗的生产成本。 0026 GIBOC 293F 所使用的 293F 细胞是 HEK29。
18、3 细胞的一个亚群， 而本细胞系是采用 说 明 书 CN 102604889 A 4 3/5 页 5 HEK293 细胞系直接驯化而来 ； HEK-293 N3S 细胞系在国内应用较少， 多采用灌流培养， 而灌 流培养对设备和人员要求较高， 成本也较大 ； 本研究建立的无血清 HEK293 细胞系能以贴壁 或悬浮状态的方式生长， 是目前商品化细胞系所没有达到的。贴壁生长的特性有利于提高 腺病毒包装效率， 悬浮生长的特性有利于腺病毒载体疫苗的大规模生产。 0027 由于无血清培养基中不含球蛋白、 抗体等干扰腺病毒感染的组分， 本研究方案降 低了腺病毒的不必要损耗。病变时间由 110 小时缩短到 。
19、97 小时， 同时产率平均提高了 43.3， 可降低腺病毒疫苗的生产成本， 同时为腺病毒疫苗生产和加工提供了便利条件。 0028 另外由于高滴度接种腺病毒会引起细胞快速裂解死亡， 细胞中大部分未成熟的病 毒粒子未能组装成为具有感染性的完整病毒粒子， 这样可导致毒价下降， 影响结果准确性 ； 因此本研究采用低感染复数腺病毒接种， 在细胞病变初期采用 IFA 方法测定外源蛋白表达 情况， 这样既能避免腺病毒裂解作用对实验结果的影响， 也能直观的对比腺病毒增殖对数 期的蛋白表达情况。 0029 无血清细胞培养技术一般应用于灌注培养、 生物反应器等大规模培养方案， 本研 究建立的无血清细胞系能够用于较。
20、大规模培养， 并评价所生产的腺病毒载体疫苗。 附图说明 0030 图 1 为完全适应无血清培养的细胞的生长状态 ； 0031 A ： 293SF 细胞 ； B ： HEK293 细胞 0032 图 2 为腺病毒在两种细胞中分别连续传代 16 次后各代的毒价测定 ； 0033 图 3 为不同细胞感染重组腺病毒后的目的蛋白表达情况。 0034 A ： 感染 rAdV-SFV-E2 的 HEK293 细胞 ； B ： 感染 rAdV-SFV-E2 的 293SF 细胞 ； C ： 未感 染的 293SF 细胞 具体实施方式 0035 下文将参考实施例详细描述本发明， 所述实施例仅是意图举例说明本发明。
21、， 而不 是意图限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围 下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换， 但这些修改和替换均在本发明的 保护范围之内。 0036 实施例 1 0037 1 材料与方法 0038 1.1 细胞、 抗体、 培养基、 病毒和其它材料 0039 HEK293 细胞系由本实验室保存提供 ； 抗猪瘟病毒 E2 蛋白单克隆抗体 HQ06 为本 实验室制备 ； 无血清培养液 293 SFM II、 DMEM、 犊牛血清 (FBS)、 GlutaMAXTM-1 均购自 Life Technology 公司 ； 细胞培养耗材均购自 Cornin。
22、g 公司 ； 多聚赖氨酸 (Poly-L-Lysine， PDL) 购自 Sigma 公司 ； rAdV-SFV-E2 为携带甲病毒复制子载体、 表达猪瘟病毒 E2 基因的重组腺 病毒， 具体构建过程记载在申请日为 2010 年 9 月 30 日， 申请号为 201010297576.0， 发明名 称为 “腺病毒 / 甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗及其应用” 的专利文献中。 0040 1.2 培养方法 0041 细胞进行适应培养前， 采用 10 FBS DMEM 对其进行培养， 细胞铺满细胞培养瓶底 说 明 书 CN 102604889 A 5 4/5 页 6 面时用含 0.25 EDTA 的胰。
23、酶消化， 1500r/min 离心 5min 收集细胞， 用适应液稀释细胞至 5105个细胞 /mL， 进入适应阶段。 0042 适应过程中采用培养液渐进替换的方法， 按照表格中所给出的适应液配比和传代 次数进行适应培养。处于适应初期的细胞传代时使用胰酶消化 ； 当适应液中 293SFM II 的 比例达到 95时， 停止使用胰酶， 改用弯头吸管将细胞从培养瓶表面吹下。 0043 适应过程中， 当细胞密度 1106个细胞 /mL 时， 以 3105个细胞 /mL 到 5105 个细胞/mL的细胞密度进行传代培养。 完全更换为无血清培养基后， 当细胞密度达到1106 个细胞 /mL 到 3106。
24、个细胞 /mL 时， 以 5105个细胞 /mL 的细胞密度进行传代培养。 0044 待细胞完全适应无血清培养后， 采用含有 400mmol/L GlutaMAX-I 的 293 SFM II 培养液进行培养， 培养液在 37、 8 CO2培养箱中保存备用。 0045 本实验采用分步适应的方法， 使 HEK293 细胞适应无血清培养条件， 具体步骤如 下 ： 首先配制 10 FBS DMEM 作为正常细胞生长液。然后用 10 FBS DMEM 和 293SFM II 混 合配制细胞适应液， 并用不同配比的适应液培养数代细胞 ( 表 1)。 0046 表 1 适应液的配比及培养代数 0047 0。
25、048 在适应过程中， 视细胞密度确定传代时间。 细胞处于贴壁生长状态， 前四个适应梯 度的传代均使用胰酶消化， 从第五个梯度开始停用胰酶， 改用弯头吸管将细胞从培养瓶表 面吹下。 0049 待细胞完全适应无血清培养后， 使用以下方法传代细胞 ： 用细胞计数板对台盼蓝 染色后的细胞进行计数， 当细胞密度达到 1.5106个细胞 /mL 时进行传代， 将细胞培养液 倒入 50mL 离心管中， 100g 离心 5min， 去除原有培养液， 用培养液稀释至 2.5 3.0105 个细胞 /mL， 并分装至培养瓶中， 于 37， 8 CO2培养箱中培养。 0050 1.3 培养条件的优化 0051 1。
26、.3.1 多聚赖氨酸 (Poly-D-lysine， PDL) 促使适应无血清培养的细胞贴壁 0052 用去离子水配制的 PBS 缓冲液稀释 PDL 至 0.1mg/mL， 经 0.22m 滤膜过滤备用 ； 将 2mL 稀释液加入细胞培养瓶中， 摇动培养瓶使液体铺满瓶底， 放入 37培养箱中孵育 6h 后取出， 回收用过的 PDL 稀释液 ； 处理过的培养瓶密封瓶口后放入 4冰箱保存。 0053 1.3.2 使用谷氨酰胺替代物代替谷氨酰胺 0054 以 400mmol/L L- 丙氨酰 -L- 谷氨酰胺 (GlutaMAXTM-1) 代替 L- 谷氨酰胺加入培养 液中， 配好的培养液在 37，。
27、 8 CO2培养箱中保存。 说 明 书 CN 102604889 A 6 5/5 页 7 0055 1.4 细胞系鉴定 0056 1.4.1 形态学观察 0057 每代细胞传代 24h 后观察细胞是否贴壁和生长状态。 0058 1.4.2 细胞稳定性 0059 细胞连续传代16次， 72h时观察细胞形态、 密度， 并接毒进行病毒培养， 72h后收获 病毒， 并用有限稀释法测定病毒滴度。 0060 1.4.3 接毒后外源蛋白的表达 0061 将适应无血清培养的 HEK293 细胞 ( 称之为 293SF) 和普通 HEK293 细胞分别铺 6 孔板， 铺板时适当提高 293SF 的初密度， 以使。
28、两种细胞生长速度同步 ； 生长 36h 后接种 104TCID50/mL 重组腺病毒 rAdV-SFV-E2， 继续培养 48h 后收获细胞， 用 4甲醛固定 20min， 0.2 TritonX100 透膜 10min ； 加入抗猪瘟病毒 E2 蛋白单克隆抗体 HQ06， 室温孵育 1h ； 再 加入 FITC 标记的羊抗鼠 IgG(Sigma， 1 100) 室温孵育 1h ； 置荧光显微镜下观察。 0062 2 结果 0063 2.1 适应无血清培养的 293SF 细胞的形态学 0064 从Step1 F1代开始， 每代细胞传代24h后使用显微镜观察细胞形态和生长状态的 变化。 Step。
29、1 F1至Step4 F3细胞逐渐收缩变圆， 转变为半贴壁状态， 细胞分裂减慢， 平均传 代时间由 48h 延长至 96h ； 待到 Step5F2 时， 细胞开始变为悬浮状态 ； 去除血清和 DMEM 成分 后细胞生长速度加快， 平均传代时间达到 72h 左右， 单个细胞呈透明圆形， 胞质清亮， 静止 培养时呈现细胞团状， 且始终悬浮于培养液中。完全适应无血清培养的细胞的生长状态如 图 1 所示。 0065 2.2 细胞稳定性 0066 细胞连续传代 16 次， 72h 时观察细胞形态、 密度。取每代细胞， 按照之前方 法测定毒价 ( 图 2 所示 )， 期间统计完全病变所需时间。使用普通 。
30、HEK293 细胞培养， 110.3010.70h 病变完全， 毒价为 107.320.54TCID50/mL ； 使用适应无血清培养的 293SF 细胞 培养， 97.0011.50h 细胞病变完全， 毒价为 107.480.71TCID50/mL。293SF 细胞增殖腺病毒的 能力较普通 HEK293 细胞提高 43.3， 且平均生产时间降低了 12.9。腺病毒在两种细胞 中分别连续传代 16 次后各代的毒价测定结果如图 2 所示。 0067 2.3 蛋白表达情况 0068 将接种 rAdV-SFV-E2 48h 后的 293SF 和 HEK293 细胞收获， 用 IFA 检测 E2 蛋白表 达情况 ( 图 3 所示 )。可见 293SF 细胞系在支持病毒复制的同时仍具有对外源蛋白的表达 能力。 说 明 书 CN 102604889 A 7 1/1 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102604889 A 8 。