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1、(10)授权公告号 CN 102676601 B (45)授权公告日 2015.01.14 CN 102676601 B (21)申请号 201110065427.6 (22)申请日 2011.03.17 C12P 17/06(2006.01) C12R 1/66(2006.01) (73)专利权人 河南天方药业股份有限公司 地址 463000 河南省驻马店市光明路 2 号 (72)发明人 刘守强 张宏周 毛全贵 时新生 李武德 焦国华 李翠平 沈芳 王文华 (74)专利代理机构 北京中誉威圣知识产权代理 有限公司 11279 代理人 王正茂 丛芳 贾志华， 张小里， 曹学君， 秦宝福， 刘建。
2、党 . 复 合氮源对土曲霉洛伐他汀生物合成的影响. 西北 农林科技大学学报 .2010, 第 38 卷 ( 第 10 期 ), 摘要， 正文左栏第 3 段 . J.L. Casas Lpez , J.A. Snchez Prez , J.M. Fernndez Sevilla.Production of lovastatin by Aspergillus terreus: effects of the C:N ratio and the principal nutrients on growth and metabolite production.Enzyme and Microbial Te。
3、chnology .2003, 第 33 卷 ( 第 2 3 期 ),2 材 料与方法 2.1. 吴波 , 陈长华 , 杨琳 . 洛伐他汀发酵培 养基配方优化及 15L 罐放大 .中国抗生素杂 志 .2007, 第 32 卷 ( 第 7 期 ), 正文第 2 段， 1 材 料与方法 1.1 菌种和培养基 . (54) 发明名称 一种洛伐他汀的制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种洛伐他汀的制备方法， 包 括在发酵培养基中对土曲霉菌种进行发酵以获得 洛伐他汀的步骤， 其特征在于， 在发酵过程中向发 酵培养基中添加已灭菌的生物素溶液和 / 或锌离 子溶液。本发明的制备方法有效提高洛伐他汀的 产。
4、量， 降低了生产成本。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 刘婷 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 (10)授权公告号 CN 102676601 B CN 102676601 B 1/1 页 2 1. 一种洛伐他汀的制备方法， 包括在发酵培养基中对土曲霉菌种进行发酵以获得洛伐 他汀的步骤， 其特征在于， 在发酵过程中向发酵培养基中添加已灭菌的生物素溶液和锌离 子溶液， 其中， 在发酵过程中向发酵培养基中添加已灭菌的生物素溶液和锌离子溶液时， 使得 发酵培养基中生物素浓度为 0.00006 (w/。
5、w) 和锌离子浓度为 1mM， 其中， 在发酵开始时， 向发酵培养基中添加已灭菌的生物素溶液和锌离子溶液， 然后再 继续进行发酵。 2. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于， 发酵条件为在 261下发酵 180-230 小时。 3. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于， 还包括在发酵之前将菌种在种子培 养基中进行培养的步骤， 然后再将经过培养的种子液接种于发酵培养基中， 进行发酵。 4. 根据权利要求 1-3 中任一所述的制备方法， 其特征在于， 菌种在发酵培养基中的接 种量为 5-15。 5. 根据权利要求 1-3 中任一所述的制备方法， 其特征在于， 所述洛伐他汀的。
6、制备方法， 还包括在发酵之后对发酵液进行分离提纯的步骤。 6. 根据权利要求 1-3 中任一所述的制备方法， 其特征在于， 发酵培养基为按重量百 分比计 ： 20葡萄糖、 4豆粕、 0.5麦精、 1蛋白胨、 0.1 NaCl、 0.05 MgSO4、 0.05 KH2PO4、 0.1 NaNO3、 余量为水， pH6.8。 7. 根据权利要求 1-3 中任一所述的制备方法， 其特征在于， 向发酵培养基中添加锌离 子是通过添加硫酸锌或者氯化锌来实现的。 权 利 要 求 书 CN 102676601 B 2 1/4 页 3 一种洛伐他汀的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种洛伐他汀的制备方。
7、法， 尤其涉及一种通过发酵法制备洛伐他汀的 方法。 背景技术 0002 洛伐他汀 (lovastatin， 也称莫那可林 K， monacolin K) 是一种来源于微生物 HMG-CoA( 羟甲基戊二酰辅酶 A) 还原酶抑制剂， 是用于治疗高胆固醇症的药物， 它能阻止动 脉硬化发展， 减少心肌梗塞等发病的危险， 因此在医学上具有重要意义。 目前生产中普遍存 在产量偏低、 生产成本偏高等问题。 0003 目前， 生产洛伐他汀所采用的微生物主要有三大类 ： 青霉菌、 红霉菌和土曲霉， 其 中土曲霉是工业生产中最常用的菌种。国内对其研究主要集中在提取工艺研究和发酵碳 源、 氮源优化方面及发酵过程中。
8、菌球形态变化。国外对其发酵过程研究主要集中在洛伐他 汀生物合成途径及其前体的研究。金属离子及生物素对土曲霉菌 (Aspergillus terreus) 发酵产生洛伐他汀产量的影响尚未见报道。 发明内容 0004 为解决上述问题， 本发明的目的是提供一种洛伐他汀的制备方法， 从而有效提高 产量， 降低生产成本。 0005 为实现上述目的， 本发明所提供的一种洛伐他汀的制备方法， 包括在发酵培养基 中对土曲霉菌种进行发酵以获得洛伐他汀的步骤， 其特征在于， 在发酵过程中向发酵培养 基中添加已灭菌的生物素溶液和 / 或锌离子溶液。 0006 根据本发明的一个具体实施方式， 在所述制备方法中， 在发。
9、酵过程中向发酵 培养基中添加已灭菌的生物素溶液或锌离子溶液， 使得发酵培养基中生物素浓度为 0.00002 -0.0002 (w/w) 或锌离子浓度为 0.5mM-9mM ； 优选为发酵培养基中生物素浓度 为 0.00002 -0.00012 (w/w) 或锌离子浓度为 1mM-7mM。 0007 根据本发明的一个优选的实施方式， 在所述制备方法中， 在发酵过程中向发 酵培养基中添加已灭菌的生物素溶液和锌离子溶液， 使得发酵培养基中生物素浓度为 0.00002-0.0002 (w/w) 和锌离子浓度为 0.5mM-9mM ； 优选为发酵培养基中生物素浓度 为 0.00006-0.00012 (。
10、w/w) 和锌离子浓度为 1mM-7mM。 0008 优选的， 在发酵开始后的 0-36h 过程中， 向发酵培养基中添加已灭菌的生物素溶 液和 / 或锌离子溶液， 然后再继续进行发酵。申请人发现， 在发酵初期加入已灭菌的生物 素溶液和 / 或锌离子溶液， 效果较好。其它发酵的条件本领域技术人员可以根据常规发酵 方法进行选择。例如， 可在发酵药瓶中， 以 200r/min 在 261的旋转式摇床中进行发酵 180-230 小时。 0009 本发明的洛伐他汀的制备方法中， 通常还包括在发酵之前将菌种在种子培养基中 进行培养的步骤， 然后再将培养后获得的种子液接种于发酵培养基中， 进行发酵。优选的，。
11、 说 明 书 CN 102676601 B 3 2/4 页 4 在种子培养基中进行培养的条件为在在温度 261下培养 90-96h。优选的， 将培养后获 得的种子液以 5-15的接种量接种于发酵培养基中。 0010 本发明的洛伐他汀的制备方法中， 通常还包括在发酵之后对发酵液进行分离提纯 的步骤。例如对发酵液进行过滤、 萃取、 结晶、 干燥， 以获得洛伐他汀成品。 0011 根据本发明的一个具体实施方式， 可以先将菌种接种于种子培养基中， 在温度 261下培养 90-96h， 然后按 10接种量将培养后获得的种子液接种于发酵培养基中， 200r/min， 261旋转式摇床进行发酵， 在发酵 0。
12、-36h 过程中， 单独添加已灭菌的生物素 溶液或锌离子溶液， 使得发酵瓶培养基中生物素浓度为 0.00002 -0.00012 (w/w) 或锌 离子浓度为 0.5mM-9mM， 或者复合添加已灭菌的生物素溶液和锌离子溶液， 使得发酵瓶培 养基中生物素浓度为0.00006-0.00012(w/w)和锌离子浓度为0.5mM-9mM。 培养216h ； 将所得发酵液按常规处理， 过滤、 萃取、 结晶、 干燥， 即得洛伐他汀成品。 0012 本发明中， 发酵培养基可以按照常规配制方法进行配制。例如， 发酵培养基可以 为 ( 按重量百分比计 ) ： 20葡萄糖、 4豆粕、 0.5麦精、 1蛋白胨、 。
13、0.1 NaCl、 0.05 MgSO4、 0.05 KH2PO4、 0.1 NaNO3、 余量为水， pH6.8。 0013 在洛伐他汀的生物合成过程中， 首先是乙酰辅酶 A 和丙二酰辅酶 A 经 LovB、 LovC 基因编码的聚酮合成酶合成二氢莫那克林L， 然后在LovA基因编码的P450加氧酶的作用下 将其氧化成中间体莫那克林J。 同时LovF基因编码的二酮合成酶则催化乙酸和丙二酸单位 缩合为 2- 甲基丁酰侧链， 并在 LOvD 基因编码的酰基转移酶 (AT) 的作用下， 被转移至莫那 克林 J 分子的 C-8 位羟基上成为最终产物洛伐他汀。实验发现金属离子 Zn2+影响洛伐他汀 的。
14、生物合成过程中相关酶的活性。本发明中， 可以通过向发酵培养基中添加硫酸锌来添加 锌离子， 也可以通过添加氯化锌等来实现。 0014 本申请的发明人在研究提高洛伐他汀产量的过程中惊奇的发现， 向土曲霉的发酵 培养基中加入金属离子Zn2+和生物素， 能提高洛伐他汀的产量。 使用本发明提供的方法， 通 过向洛伐他汀发酵培养基中加入金属离子 Zn2+和生物素， 无论是单独的加入金属离子 Zn2+ 或生物素， 还是加入复合的金属离子Zn2+和生物素， 均能显著提高洛伐他汀的生物合成。 而 且， 当发酵培养基中加入金属离子Zn2+和生物素时， 金属离子Zn2+和生物素之间能起协同作 用， 大幅提高洛伐他汀。
15、的产量。 具体实施方式 0015 以下结合具体实施例， 对本发明作进一步说明。 应理解， 以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。 0016 除特别说明外， 以下实施例中所使用的均为重量比。 0017 在本发明的实施例中， 将斜面 ( 即菌种 ) 接种于摇瓶种子培养基中， 260.5 摇床转速 200 转 / 分， 周期 90-96 小时 ； 按 10接种量接入摇瓶发酵培养基中， 发酵培养 基按常规配制方法配制， 发酵培养基的配方为 ： 20葡萄糖、 4豆粕、 0.5麦精、 1蛋白 胨、 0.1 NaCl、 0.05 MgSO4、 0.05 KH2PO4、 0.1 NaNO3、 。
16、余量为水， pH6.8， 发酵温度为 261。 0018 在本发明的实施例中， 洛伐他汀的含量测定采用 HPLC， 照高效液相色谱法 ( 中国 药典 2000 版二部附录 VD) 进行检测。 说 明 书 CN 102676601 B 4 3/4 页 5 0019 实施例 1 添加金属离子 Zn2+对洛伐他汀产量的影响 0020 配制洛伐他汀的发酵培养基， 并向洛伐他汀发酵培养基中分别添加 ZnSO4， 使 Zn2+ 在相应的培养基中的重量比浓度分别为 1mM、 3mM、 5mM、 7mM， 同时， 以不加 ZnSO4的洛伐他汀 原始发酵培养基作为对照培养基， 接入土曲霉菌(Aspergillu。
17、s terreus)发酵培养216小时 后， 取样测定洛伐他汀的含量。结果如表 1 所示。 0021 表 1、 添加 ZnSO4对洛伐他汀产量的影响 0022 ZnSO4加量 0 1mM 3mM 5mM 7mM 相对含量 100 108 116 115 109 0023 根据表 1 的结果。在培养基中添加不同浓度金属离子 ZnSO4后， 洛伐他汀的产量 发生了不同程度的改变， 其中， 添加 1-7mM 的 Zn2+后， 洛伐他汀的产量获得明显提高。 0024 实施例 2 添加生物素对洛伐他汀产量的影响 0025 配制洛伐他汀的发酵培养基， 并向洛伐他汀发酵培养基中分别添加生物素， 使生物素在相。
18、应的培养基中的重量比浓度分别为 0.00002、 0.00006、 0.0001、 0.00012， 同时， 以不加生物素的洛伐他汀原始发酵培养基作为对照培养基， 接入土曲霉 菌(Aspergillus terreus)发酵培养216小时后， 取样测定洛伐他汀的含量。 结果如表2所 示。 0026 表 2、 添加生物素对洛伐他汀产量的影响 0027 生物素加量 0 0.00002 0.00006 0.0001 0.00012 相对含量 100 105 109 108 107 0028 根据表 2 的结果。在培养基中添加不同浓度生物素后， 洛伐他汀的产量发生了不 同程度的改变， 其中， 添加 0。
19、.00002 -0.00012的生物素后， 洛伐他汀的产量获得明显提 高。 0029 实施例 3 复合添加金属离子 ZnSO4和生物素对洛伐他汀产量的影响 0030 3.1ZnSO4和生物素的交互试验 0031 根据实施例 1、 实施例 2 的结果， 选择 ZnSO4和生物素进行复合添加实验， 并分别 以它们各自的最适添加浓度为中心， 按照实施例 1 的培养方法， 作 ZnSO4和生物素的交互作 用， 同时， 以不添加 ZnSO4和生物素的洛伐他汀原始发酵培养基作为对照培养基， 培养并检 测最终培养物中的洛伐他汀的产量， 结果如表 3。 0032 表 3、 ZnSO4和生物素组合添加的水平试验。
20、表 0033 ZnSO4 生物素 相对含量 1mM 0.00006 121 3mM 0.00006 118 说 明 书 CN 102676601 B 5 4/4 页 6 5mM 0.00012 120 7mM 0.00012 116 0 0 100 0034 根据表 3 的结果， 复合添加 ZnSO4和生物素可以提高洛伐他汀的产量， 且相比单一 添加ZnSO4或生物素， 复合添加ZnSO4和生物素的效果更佳， ZnSO4和生物素之间具有协同作 用， 其浓度范围分别为 ： 1-7mM， 0.00006 -0.00012 . 0035 3.2 复合添加金属离子 ZnSO4和生物素添加时间对洛伐他汀。
21、产量的影响 0036 配制洛伐他汀的发酵培养基， 接入土曲霉菌 (Aspergillus terreus) 发酵培养， 分别于 0、 12、 36、 60、 84、 108 小时， 向洛伐他汀的发酵培养基中分别加入 ZnSO4、 生物素， 使 Zn2+、 生物素的重量比浓度分别达到5mM、 0.00004， 同时， 以不添加ZnSO4、 生物素的洛伐他 汀原始发酵培养基作为对照培养基， 培养并检测最终培养物中的洛伐他汀的含量， 结果如 表 4 所示。 0037 表 4、 复合添加 ZnSO4和生物素添加时间对洛伐他汀产量的影响 0038 添加时间 (h) 0 12 36 60 84 108 对。
22、照 相对含量 120 118 117 109 110 108 100 0039 根据表4的结果， 在发酵前期向发酵培养基中添加Zn2+(5mM)、 生物素(0.00004) 可明显提高洛伐他汀的生物合成， 优选的添加时间为 0-36 小时。 0040 综上所述， 使用本发明提供的方法， 向洛伐他汀的发酵培养基中加入 ZnSO4和生物 素， 无论是单独加入 ZnSO4或生物素， 还是加入复合 ZnSO4和生物素， 发酵培养洛伐他汀， 均 能显著提高洛伐他汀的生物合成。 0041 虽然本文已经描述出本发明的优选的实施方式， 但是很明显对于本领域技术人员 而言可以进行的许多改变和修改并不能超出从本发明的较宽方面的范围。因此， 所附的权 利要求是为了试图覆盖所有在本发明的真实精神和范围之内的所有的改变和修改。 说 明 书 CN 102676601 B 6 。