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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610296600.6 (22)申请日 2016.05.03 (71)申请人 中国药科大学 地址 211198 江苏省南京市江宁区龙眠大 道639号 (72)发明人 余伯阳许家琦张剑樊妮 王倩倩 (51)Int.Cl. C07H 17/07(2006.01) C12P 19/60(2006.01) A61K 31/7048(2006.01) A61P 11/06(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 异槲皮苷制备方法及其抗哮喘方面的用途。
2、 (57)摘要 本发明涉及生物药物领域， 具体涉及异槲皮 苷(槲皮素-3-O- -D-吡喃葡萄糖苷， I)的生物转 化制备方法， 本发明还公开了其在抗哮喘方面的 用途。 权利要求书1页 说明书6页 CN 105906676 A 2016.08.31 CN 105906676 A 1.结构式I的化合物或其药学上可接受的溶剂化物： 2.权利要求1的化合物或其药学上可接受的溶剂化物的制备方法， 其特征是： 用保藏号 为NRRL1086菌株对槲皮素进行生物转化获得。 3.权利要求2的制备方法， 其中生物转化方法如下： 以槲皮素为底物， 利用保藏号为 NRRL1086的菌株， 将底物和该菌株在培养基中培。
3、养12h， 终止反应， 发酵液用有机溶剂萃 取， 浓缩萃取液， 得浸膏， 通过硅胶柱层析分离得到目标化合物。 4.权利要求3的制备方法， 其中有机溶剂包括： 乙酸乙酯、 氯仿、 二氯甲烷、 甲酸乙酯、 乙 酸丁酯、 甲苯、 己烷、 正丁醇等。 5.权利要求3的制备方法， 培养基含1030的马铃薯煎煮液、 KH2PO4、 MgSO4、 维生素B1 和选自葡萄糖、 蔗糖、 麦芽糖、 木糖、 淀粉中一种或几种的碳源， 培养基pH5.07.0。 6.权利要求3的制备方法， 其中按20马铃薯煎煮液100毫升计， KH2PO40.10.5克； MgSO40.050.5克； 葡萄糖0.5-2.5克(或蔗糖0。
4、.5-2.5克)。 7.权利要求2的制备方法， 其中菌种在培养前先进行活化， 活化时间2030h。 8.一种药物组合物， 其中含有权利要求1的化合物或其药学上可接受的溶剂化物及药 学上可接受的载体。 9.权利要求1的化合物或其药学上可接受的溶剂化物用于制备平喘药物的用途。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105906676 A 2 异槲皮苷制备方法及其抗哮喘方面的用途 技术领域 0001 本发明涉及生物药物领域， 具体涉及异槲皮苷(槲皮素-3-O- -D-吡喃葡萄糖苷， I)的生物转化制备方法， 本发明还公开了其在抗哮喘方面的用途。 背景技术 0002 哮喘是是一种由嗜酸性粒细胞、 T淋巴细。
5、胞(Th2)等炎症细胞、 肥大细胞、 气道上皮 细胞参与的气道慢性过敏反应炎症性疾病。 哮喘是一种常见病、 多发病， 对人类健康造成了 很多不利影响。 目前全球哮喘患者约3亿人， 我国哮喘患者约3000万， 每年有近20万人死于 哮喘， 且大量研究表明近20年内哮喘的患病率尚有逐渐增高的趋势。 哮喘的发病机制复杂， 至今尚未完全明确。 在当前的哮喘治疗中， 一般使用糖皮质激素来控制气道的慢性炎症。 然 而， 激素类药物只能减轻症状， 无法针对哮喘的根本原因进行治疗， 并且长期使用副作用较 大。 因此天然来源的小分子药物的开发和结构改造， 及其药理作用机制的研究成为当前新 药研发的热点。 槲皮素。
6、是黄酮类化合物中最具代表性的一种黄酮醇类化合物， 在自然界中 分布广泛， 具有抗氧化、 抗炎、 保护心血管系统等多种生物活性。 研究表明， 槲皮素可调节 Th1/Th2平衡， 降低组胺含量和磷脂酶A2的活性， 改善嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润， 抑 制气管收缩， 达到治疗哮喘的目的。 然而槲皮素水溶性较低， 生物利用度较差， 限制了其临 床应用。 0003 微生物转化是利用微生物产生的特异酶对外源性化合物进行结构修饰的特定生 化反应。 微生物转化具有高度的立体结构选择性， 能专一地催化特定的反应、 无需繁琐的保 护与脱保护操作， 具有高效、 环保的优点， 是天然活性化合物进行结构修饰的一种有效。
7、方 法。 因此， 我们选择微生物转化的方式， 对槲皮素的3位羟基进行糖基化修饰， 以提高生物利 用度， 同时保持或增加其活性。 发明内容 0004 本发明公开了结构式I的化合物： 0005 0006 命名为异槲皮苷(槲皮素-3-O- -D-吡喃葡萄糖苷)。 本发明同时也包括结构式I的 说明书 1/6 页 3 CN 105906676 A 3 化合物的溶剂化物。 其13C-NMR(500MHz， DMSO)与底物槲皮素相比增加了六个碳信号， 分别是 C100.8， C74.0， C76.4， C69.9， C77.5， C60.9ppm这与D-葡萄糖的化学位移值相符。 1H- NMR(500MH。
8、z， DMSO)与底物槲皮素相比， 在化学位移 3.09- 5.46处， 出现了D-吡喃葡萄糖的 氢及羟基氢信号： 3.09- 3.59(6H， m， glu上的H)， 5.46(1H， d， J7.0Hz， H-1 )； 端基质子 的化学位移在5.46处， 可以判断糖基化位点位于3位， 端基质子的耦合常数为7.0Hz， 表明连 接的D-葡萄糖立体构型为 型。 药理试验表明， 本发明的式I的化合物具有抗哮喘的活性。 0007 本发明的式I化合物优选用微生物转化法， 以槲皮素为底物进行转化制备， 方法如 下： 0008 0009 为寻找槲皮素转化生成异槲皮苷的适宜菌种， 本发明筛选了多种微生物，。
9、 结果发 现保藏号为NRRL1086的菌种对槲皮素有较好的转化能力(见表1)。 0010 筛选所用的液体培养基为复合马铃薯培养基(PDA)： 200克新鲜去皮马铃薯切成碎 块， 加蒸馏水适量煮沸15min后过滤， 滤液加葡萄糖20g、 KH2PO43.0g、 MgSO40.75g、 Vb1 10.0mg， 加蒸馏水定容至1.0L， 加NaOH或HCl调pH值至6.0， 150mL三角烧瓶每瓶分装30mL液 体培养基， 121、 0.15MPa灭菌20min。 0011 筛选菌种时， 保存菌种所用斜面培养基是在上述液体培养基加入1.5的琼脂， 15mL具塞试管每管5mL， 121、 0.15MP。
10、a灭菌20min冷却后制成。 0012 菌种的保存与活化： 菌种活化采用两步活化法， 参见： Nair， M.S.R.， andBasile， D.V.BioconversionofarteniumBtoartmisinn.天然产物杂志(JounalofNatural Products)1993， 56(9)： 1559。 先将菌种接种于液体培养基， 28、 180r/min旋转培养24-48h 后， 转接于另一液体培养基， 接种量1-5(V/V)， 同条件培养24h后加样。 0013 样品的制备及加样： 取槲皮素溶于乙醇， 配成10mg/mL溶液备用； 每瓶经两步活化 的菌液(30mL)加0。
11、.5mL样品溶液， 使每瓶菌液含槲皮素5mg。 同条件培养120h后， 中止反应， 过滤菌体， 发酵液用等量的乙酸乙酯萃取35次， 合并萃取液、 回收乙酸乙酯； 得到萃取浸 膏， 菌体用乙醇提取3次， 合并提取液， 回收乙醇， 得到提取浸膏， 将两种浸膏合并， 加少许乙 酸乙酯溶解后备薄层鉴定用。 0014 空白对照： 空白对照设阳性对照(底物+培养基)、 阴性对照(培养基+菌)、 溶剂对照 (培养基+菌+乙醇)， 培养和萃取条件同上。 0015 转化产物的薄层鉴定： 0016 薄层条件： 0017 薄层板： 0.7的CMC-Na制成的硅胶G板。 0018 展开剂： 氯仿 甲醇 甲酸(85 1。
12、5 0.5)上行展开。 0019 显色剂： 5三氯化铁乙醇溶液。 0020 操作： 0021 转化萃取物和空白对照萃取物分别于薄层板点样， 充分展开后取出， 置于通风橱 中晾干， 喷5三氯化铁显色剂显色， 转化结果见表1。 说明书 2/6 页 4 CN 105906676 A 4 0022 表1微生物转化槲皮素筛选结果 0023 0024 从筛选结果看， 只有NRRL1086可转化， 经测算， 转化率可达80。 因此， 本发明选 用菌株NRRL1086， 以槲皮素为原料来制备异槲皮苷。 0025 本发明公开了一种制备式I化合物的制备方法， 用保藏号为NRRL1086菌株对槲皮 素进行生物转化获。
13、得。 0026 更优选的方法是： 以槲皮素为底物， 利用保藏号为NRRL1086的菌株， 将底物和该 菌株在培养基中共培养12h， 终止反应， 用有机溶剂萃取， 浓缩萃取液， 通过硅胶柱层析分离 即得。 0027 其中有机溶剂选自甲醇、 乙酸乙酯、 氯仿、 二氯甲烷、 甲酸乙酯、 乙酸丁酯中的一种 或几种。 更优选乙酸乙酯。 0028 硅胶柱层析分离用氯仿和甲醇进行梯度洗脱。 0029 培养基含1030的马铃薯煎煮液、 KH2PO4、 MgSO4、 维生素B1和选自葡萄糖、 蔗糖、 麦芽糖、 木糖、 淀粉中一种或几种碳源， 培养基pH5.07.0。 其中按20马铃薯煎煮液100 毫升计， 培养。
14、基中各组分优选的含量为KH2PO4含0.10.5克； MgSO4含0.050.5克； 葡萄糖 或蔗糖0.5-2.5克。 0030 最为优选的制备方法是： 将保藏号为G.deliquescensNRRL1086的菌株由斜面接 种到液体培养基中， 置28， 转速为180r/m的摇床中培养24小时成为种子液， 种子液转接至 发酵液后继续培养24小时， 加入转化底物； 继续培养12小时后终止催化反应， 过滤菌体， 发 酵液用等量的乙酸乙酯萃取5次， 合并萃取液、 回收乙酸乙酯， 得到萃取浸膏， 浸膏经硅胶拌 样后柱层析分离； 以氯仿-甲醇为洗脱系统。 转化产物经甲醇重结晶， 得到黄色粉末状的转 化产物。
15、。 0031 药理试验证明， 本发明的结构式I化合物具有显著的抗哮喘作用， 以下是试验方法 说明书 3/6 页 5 CN 105906676 A 5 及结果： 0032 异槲皮苷抗哮喘活性的研究 0033 1、 异槲皮苷对乙酰胆碱和组胺引起的豚鼠哮喘潜伏期的影响 0034 选取健康、 雄性荷兰种豚鼠， 体重30020g。 将豚鼠放置于20cm20cm50cm的玻 璃箱内， 配制2乙酰胆碱和0.2磷酸组胺混合液， 超声雾化喷入15s， 筛选出引喘潜伏期 低于120s的豚鼠。 次日， 将豚鼠随机分成6组， 每组10只， 即空白对照组(生理盐水， 10ml/ kg)、 模型对照组(生理盐水， 10m。
16、l/kg)、 阳性对照组(地塞米松， 5mg/kg)、 以及异槲皮苷低剂 量组(20mg/kg)、 中剂量组(40mg/kg)、 高剂量组(80mg/kg)， 灌胃给药1次。 给药1h后， 超声雾 化喷以2乙酰胆碱和0.2磷酸组胺混合液， 持续15s。 测定引喘潜伏期(即从喷雾开始到 哮喘发作， 呼吸困难， 直至抽搐倒地的时间)。 0035表2异槲皮苷对豚鼠引喘潜伏期的影响(， n10) 0036 0037 注： *P0.05，*P0.01 0038 由表2所示， 异槲皮苷低、 中、 高剂量组相比模型对照组， 豚鼠的引喘潜伏期均明显 延长， 其中高剂量组的引喘潜伏期最长， 平喘效果最好， 且强。
17、于阳性药组。 表现出异槲皮苷 的抗哮喘作用。 0039 2、 异槲皮苷对豚鼠离体肺支气管平滑肌张力的作用 0040 选取健康、 雄性荷兰种豚鼠， 体重30020g。 将豚鼠随机分成6组， 每组10只， 即模 型对照组、 阳性对照组(异丙肾上腺素， 300mg/l)、 以及异槲皮苷低剂量组(100mg/l)、 中剂 量组(200mg/l)、 高剂量组(400mg/l)。 预先准备好肺支气管灌流装置， 贮流瓶内充满含氧的 乐氏营养液。 取豚鼠， 木槌击毙， 颈动脉放血， 迅速打开胸腔， 暴露心脏、 肺， 剪下一段气管连 同心脏及左右肺取出胸腔外， 将肺浸入37含氧乐氏营养液的培养皿中， 轻轻挤捏肺。
18、数次， 以排除肺内的气体， 然后将气管用线扎于灌流装置的套管上， 以乐氏液灌流， 在肺表面可用 针头散在穿79个孔， 调节灌流速度为50滴/min。 待灌流量恒定后， 可将0.5ml药物注入套 管顶端的橡皮管内。 观察并比较给药后3min内液体流出滴数和流出量。 0041表3异槲皮苷对豚鼠离体肺支气管平滑肌张力的作用(， n10) 说明书 4/6 页 6 CN 105906676 A 6 0042 0043 注： *P0.05，*P0.01 0044 表3显示， 异槲皮苷作用于豚鼠的离体支气管平滑肌， 可增加灌流液滴数和液体流 出量， 提示异槲皮苷对支气管平滑肌有一定的舒张作用。 0045 3。
19、、 异槲皮苷对抗原引起的哮喘大鼠肺组织中白三烯B4、 D4的影响 0046 取健康、 清洁级SD大鼠， 体重20020g， 雌雄各半。 随机分成6组， 每组10只， 即空白 对照组(生理盐水， 10ml/kg)、 模型对照组(生理盐水， 10ml/kg)、 阳性对照组(地塞米松， 5mg/kg)、 以及异槲皮苷低剂量组(20mg/kg)、 中剂量组(40mg/kg)、 高剂量组(80mg/kg)。 采 用抗原卵清蛋白致敏模型， 配制每毫升含卵清蛋白10mg、 Al(OH)3干粉100mg的生理盐水混 悬液， 除空白对照组外， 将其它5组动物分别在第1、 2、 3天腹腔注射致敏液1ml， 第8天。
20、重复致 敏1次。 从第15天开始， 将这5组动物用超声雾化1卵清蛋白进行激发， 每天1次， 每次 30min。 直至大鼠出现哮喘样发作， 共4周。 雾化时见大鼠出现烦躁不安、 打喷嚏、 大小便失 禁、 抓耳朵、 紫绀等症状， 表明造模成功。 从第五周起， 按分组要求分别灌胃给药， 每天1次， 持续30天。 末次给药后1h， 用2戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠， 取右肺制成10 组织匀浆， 制备好的匀浆放入离心机中3500r/min离心10min， 提取上清液， 首先用二辛可宁 酸蛋白定量试剂盒测定肺组织匀浆中蛋白浓度， 采用ELISA法、 按试剂盒说明书测定匀浆中 白三烯B4(L。
21、TB4)、 D4(LTD4)的含量， 测定结果以每毫升匀浆液中蛋白含量(pg/mgprot)进行 校正。 0047表4异槲皮苷对哮喘大鼠肺组织中LTB4、 LTD4含量影响(， n10， pg/mgprot) 0048 0049 注： *P0.05，*P0.01 说明书 5/6 页 7 CN 105906676 A 7 0050 如表4所示， 相对于空白组， 模型组中LTB4、 LTD4含量显著升高， 表明造模较为成功。 相比模型组， 异槲皮苷低、 中、 高三个剂量组中LTB4、 LTD4含量显著降低， 表明异槲皮苷可以 减少大鼠哮喘模型中的炎症因子白三烯B4、 D4的表达。 0051 综上，。
22、 异槲皮苷可显著延长哮喘发作潜伏期， 扩张支气管平滑肌， 从而发挥平喘作 用。 同时， 通过实验证实异槲皮苷可以降低肺组织中炎症因子白三烯B4、 D4的含量， 推测其 平喘作用可能与抗炎有关。 0052 本发明的异槲皮苷可与药学上可接受的载体混合， 用于制备治疗用药物组合物。 可制备成药剂学上通用的剂型， 如胶囊、 片剂、 丸剂、 口服液、 颗粒剂、 酊剂、 缓释剂等胃肠道 给药剂型及注射剂、 透皮贴剂、 外用制剂等胃肠外给药剂型。 具体实施方式 0053 实施例1 0054 异槲皮苷的制备 0055 菌种NRRL1086由4的固体斜面接种至液体PDA培养基(培养基按100毫升20马 铃薯煎煮。
23、液中含KH2PO40.3克； MgSO40.75克； 葡萄糖10克； 维生素B10.01克配制， 液体培养 基分装至150mL的三角瓶， 每瓶装液30mL)， 至摇床中培养24小时(28， 180r/m)， 即为种子 液； 将种子液在无菌条件下转移至液体PDA培养基(培养基组成同前)中， 在摇床中继续培养 24小时。 每瓶加1ml槲皮素乙醇溶液(20mg/ml)， 共转化200mg， 培养12小时后终止反应。 发酵 液用等量的乙酸乙酯萃取5次， 合并萃取液、 回收乙酸乙酯； 得到萃取浸膏321mg， 称取100- 200目硅胶0.8g与残渣均匀拌样， 柱层析200300目20g干法装柱， 氯仿-甲醇梯度洗脱， 在 氯仿-甲醇95 5的洗脱馏分中， 可得目标转化产物异槲皮苷， 经甲醇重结晶， 得到黄色粉 末267mg。 0056 其碳谱如上所述 0057 实施例2 0058 片剂 0059 取实施例1制得的异槲皮苷100g与淀粉50g， 糊精50g混合， 用适量30乙醇作湿润 剂， 制成软材， 常规方法制粒， 加入适量硬脂酸镁混合， 制成片剂。 说明书 6/6 页 8 CN 105906676 A 8 。