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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610269745.7 (22)申请日 2016.04.27 (71)申请人 上海应用技术学院 地址 200235 上海市徐汇区漕宝路120-121 号 (72)发明人 姚志艺张晓攀 (74)专利代理机构 上海精晟知识产权代理有限 公司 31253 代理人 杨军 (51)Int.Cl. C07D 403/12(2006.01) A61K 31/513(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 潜在EZH2小分子抑制剂及其合成方法 (57)摘。
2、要 本发明公开了一种潜在EZH2小分子抑制剂 及其合成方法。 其合成方法的具体步骤如下： 将5-巯基-1-苯基四氮唑和4-氯乙酰乙酸乙酯在 强碱作用下反应得到第一中间体； 将第一中间 体在强碱作用下和盐酸胍反应得到第二中间体； 将第二中间体和异氰酸酯类或者异硫氰酸酯 类化合物反应， 生成目标化合物。 本发明分离过 程简单， 不需要柱层析分离， 步骤简单， 方便进行 工业化生产。 本发明合成的目标化合物有很好的 EZH2抑制活性， 为恶性肿瘤药物的研发提供了一 类新的小分子结构， 这类小分子结构具有多样 性， 进一步的研究有助于开它的药用价值。 权利要求书2页 说明书6页 CN 10577771。
3、8 A 2016.07.20 CN 105777718 A 1.一种潜在EZH2小分子抑制剂， 其特征在于， 其具有通式(1)所示结构： 其中： R1为氧或硫， R2选自苯基、 取代苯基、 苯甲酰基或者萘基中任一种； R2为氧或硫。 2.如权利要求1所述的潜在EZH2小分子抑制剂， 其特征在于， 式(1)中， R1为氧或硫， R2选 自苯基、 4-卤素取代苯基、 4-卤代烷基苯基、 苯甲酰基或者萘基中任一种； R2为氧或硫。 3.如权利要求1所述的潜在EZH2小分子抑制剂， 其特征在于， 其合成中间体具有通式 (2)所示结构： 4.一种潜在EZH2小分子抑制剂的合成方法， 其特征在于， 具体步。
4、骤如下： 将5-巯基-1-苯基四氮唑和4-氯乙酰乙酸乙酯在强碱作用下反应得到式(3)所示结 构的中间体； 将式(3)所示结构的中间体在强碱作用下和盐酸胍反应得到式(2)所示结构的中间 体； 将式(2)的中间体和异氰酸酯类或者异硫氰酸酯类化合物反应， 生成式(1)所示结构 的目标化合物； 其合成的化学反应方程式如下所示： 5.如权利要求4所述的合成方法， 其特征在于， 步骤中， 采用的反应溶剂选自甲醇、 乙 醇或异丙醇任一种或两种； 采用的强碱为氢氧化钾或氢氧化铯中任意一种； 反应温度在15 -75之间。 6.如权利要求4所述的合成方法， 其特征在于， 步骤中， 强碱选自氢氧化铯、 甲醇钠、 乙。
5、醇钠或LDA中任一种； 反应溶剂采用无水甲醇或无水乙醇， 反应温度在50-170之间。 7.如权利要求4所述的合成方法， 其特征在于， 步骤中， 式(3)所示结构的中间体、 盐 权利要求书 1/2 页 2 CN 105777718 A 2 酸胍和强碱的摩尔比为1:(2.05-2.15)： (2.05-2.15)。 8.如权利要求4所述的合成方法， 其特征在于， 步骤中， 反应溶剂为非质子溶剂。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105777718 A 3 潜在EZH2小分子抑制剂及其合成方法 技术领域 0001 本发明属于医药化工技术领域， 尤其涉及EZH2小分子抑制剂及其合成方法。 背景技术。
6、 0002 在过去的几年， 表观遗传修饰， 如DNA的甲基化、 组蛋白的甲基化和乙酰化已经显 示出对肿瘤的治疗有着良好的前景。 研究发现， 在血液性疾病和实体瘤中， 如霍奇金病、 非 霍奇金瘤、 前列腺癌、 乳腺癌、 咽喉癌， 都发现了EZH2的过表达， 这表明EZH2的过表达与肿瘤 的产生及恶化都有着紧密的联系。 因此， 很多研究人员将其列为一个治疗癌症的重要靶点， 开发相应的抑制剂。 这几年里， 已经有几个有效的药物被用作临床抗肿瘤新药,如5-氮杂胞 苷,5-氮-2-脱氧胞苷， 和GSK126。 进一步的研究发现， 组蛋白的甲基化是一个高度可逆的过 程， 它与多个肿瘤的发生和发展都有着紧密。
7、联系。 GSK126是第一个进入临床的组蛋白甲基 化抑制剂， 并取得了良好的效果。 所以， 对于EZH2的深入研究就变得十分的必要， 只有更全 面的了解EZH2的结构和生物功能， 才能开发出更多高效、 高选择性的抑制剂， 为恶性肿瘤的 治疗带来新的希望。 0003 在对PRC2的研究更加的深入后， 几种潜在的EZH2抑制剂正逐渐出现在人们的视野 中。 这些抑制剂中， DZNep可以通过和H3K27me3相互作用来抑制EZH2的表达， 这样通过间接 的作用就可以达到使肿瘤细胞被抑制的目的。 DZNep干扰S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶的 新陈代谢， 这样就降低了细胞的生存时间和能力， 进而间接。
8、的抑制甲基化反应。 DZNep诱导 细胞凋亡能力与抑制PRC2的途径有着紧密的关系， 虽然确切的机制尚未能够研究清楚。 此 外， 已有文献报道， DZNep和组蛋白去乙酰酶抑制剂是互相作用的。 同时， 它还与激活沉默基 因的DNA甲基转移酶抑制剂相互协作。 作为一个抗病毒化合物,DZNep在人体内的毒性很小。 同时， 它在癌细胞的表观遗传途径中也有着很重要的作用， 所以它可能是一种有前景的抗 癌候选药物。 0004 在过去几年里的测试， 发现这些小分子有很好的选择性， 并且对特定细胞的抑制 活性也很高。 不像其他类的一些小分子， 同时对很多的细胞都有抑制的效果， 没有很好的选 择性， 达不到杀。
9、死特定恶性肿瘤细胞的目的。 近期， 通过研究发现， 淋巴瘤中的EZH2都是高 度表达的,所以要抑制住EZH2的过表达,这样可以使淋巴瘤不会继续的增殖和恶化。 研究人 员在前列腺癌和骨髓癌中也观察到EZH2发生了突变和失活。 为此， 研究人员开发了一些抑 制剂,它可以与酶蛋白相互作用,占用SAM的结合位点,再来和SAM竞争,这样EZH2的高表达 就可以得到有效的抑制,通过这个理念， 从而开发出有效的高选择性竞争性抑制剂。 0005 通过PRC2复合物的高通量生物筛选实验， 来确定EZH2甲基转移酶的活性。 几个有 潜力的抑制小分子已经被筛选出来。 虽然活性位点的结构还没有确定， 但保守域SET结。
10、构显 示了两个基本的结合口袋： 一个是用于SAM的甲基供体， 另一个是用于Lys27的基质。 在人体 中已经发现了50多个SET结构域蛋白， 所以抑制剂对EZH2中的SET结构域的选择变得很重 要。 0006 在2012年年底,几个SAM的竞争型抑制剂已经被发现,化合物EPZOO5687对EZH2的 说明书 1/6 页 4 CN 105777718 A 4 选择性与另外的15个PMTs相比,超过500倍。 EPZ005687还可以抑制EZH2上的Y641和A677突 变引起的H3K27甲基化， 发现该化合物可以有选择性的杀死由EZH2突变引起的淋巴瘤细胞。 0007 EI1是Novartis发。
11、现的一个EZH2的抑制剂小分子,它表现出很高的选择性和抑制 率。 EI1可以激活PRC2的目标基因， 使EZH2失去H3K27的甲基化功能。 同时在细胞测试中， EI1 在EZH2的野生型和Y641的突变出有着很高的抑制活性。 在B细胞淋巴瘤中， 对EZH2的Y64突 变抑制可以减少细胞的扩散与凋亡， 缩短细胞的周期阻滞。 0008 在这些抑制剂中， 最有潜力的是GSK126， 它的抑制效果突出， IC50达到纳摩级别。 它对EZH2的选择性是对20多种人体含有或不含有SET结构域甲基转移酶选择性的1000多 倍， 也超过对EZH1选择性的150倍， GSK126能够有效的抑制扩散在DLBCL。
12、细胞株的EZH2突变 体。 更重要的是， 在动物实验中GSK126也有很好的细胞瘤抑制效果。 EZH2的超表达与肿瘤的 恶化密切相关， GSK126为判断EZH2的表达是否是肿瘤发展的所需条件提供了参考。 0009 总的说来， PRC2作为转录因子和基因活化子的功能被用来作为探索药物的基础。 尽管目前还没有批准临床或治疗的化合物出现， 应做出更多的努力来开发EZH2的甲基转移 酶抑制剂。 EZH2作为一个抗肿瘤的新靶点， 进一步的发现和设计EZH2的抑制剂是十分必要 的， 可以为肿瘤的治疗提供更多的方法。 发明内容 0010 为了克服现有技术的不足， 本发明的目的在于提供一类潜在EZH2小分子。
13、抑制剂及 其合成方法。 本发明通过计算机药效团模拟筛选出了好的分子结构， 合成了活性好的小分 子， 为恶性肿瘤的治疗提供一些参考。 0011 本发明提供了一种潜在EZH2小分子抑制剂结构， 进一步的设计了有效的合成路 线， 并设计提供了一种关键的中间体。 通过关键中间体的合成， 进一步合成目标分子。 0012 本发明的技术方案具体介绍如下。 0013 本发明提供一种潜在EZH2小分子抑制剂， 其具有通式(1)所示结构： 0014 0015 其中： R1为氧或硫， R2选自苯基、 取代苯基、 苯甲酰基或者萘基中任一种； R2为氧或 硫。 0016 上述式(1)中， R1为氧或硫， R2选自苯基、。
14、 4-卤素苯基、 4-卤代烷基苯基、 苯甲酰基或 者萘基中任一种； R2为氧或硫。 0017 本发明的潜在EZH2小分子抑制剂， 其合成中间体具有通式(2)所示结构： 0018 0019 本发明还提供一种潜在EZH2小分子抑制剂的合成方法， 具体步骤如下： 说明书 2/6 页 5 CN 105777718 A 5 0020 将5-巯基-1-苯基四氮唑和4-氯乙酰乙酸乙酯在强碱作用下反应得到式(3)所 示结构的中间体； 0021 将式(3)所示结构的中间体在强碱作用下和盐酸胍反应得到式(2)所示结构的 中间体； 0022 将式(2)的中间体和异氰酸酯类或者异硫氰酸酯类化合物反应， 生成式(1)所。
15、示 结构的目标化合物； 其合成的化学反应方程式如下所示： 0023 0024 上述步骤中， 采用的反应溶剂选自甲醇、 乙醇或异丙醇任一种或两种； 采用的强 碱为氢氧化钾或氢氧化铯中任意一种； 反应温度在15-75之间。 0025 上述步骤中， 强碱选自氢氧化铯、 甲醇钠、 乙醇钠或LDA中任一种； 反应溶剂采用 无水甲醇或无水乙醇， 反应温度在50-170之间。 0026 上述步骤中， 式(3)所示结构的中间体、 盐酸胍和强碱的摩尔比为1:(2.05- 2.15)： (2.05-2.15)。 0027 上述步骤中， 反应溶剂为非质子溶剂。 0028 本发明的有益效果在于： 0029 本发明合成。
16、路线简单， 分离过程简便， 有利于进行扩大生产。 本发明合成的此类小 分子抑制剂有很好的EZH2抑制活性， 为恶性肿瘤药物的研发提供了一类新的小分子结构， 这类小分子结构具有多样性， 进一步的研究有助于开它的药用价值； 具体实施方式 0030 实施例1 0031 FTCI-2362 0032 0033 取1-苯基-5-巯基1H-四氮唑1.78g(0.01mol)加入圆底烧瓶， 滴加30ml甲醇， 搅拌 至白色固体完全溶解。 搅拌下滴加4-氯乙酰乙酸乙酯1.81g(0.011mol)室温搅拌反应5h， 点 说明书 3/6 页 6 CN 105777718 A 6 板反应完全。 减压旋干甲醇， 向。
17、残留的油状物中加入5ml去离子水溶解， 再加入乙酸乙酯进 行萃取水相三次， 合并有机相， 干燥， 减压回收乙酸乙酯， 得到无色油状液体2.82g(93)。 0034 取上一步得到的油状物1.5g(4.910-3mol)， 加入适量的无水乙醇搅拌搅拌下加 入盐酸胍0.94g(9.810-3mol)， 加入含有0.53g(9.810-3mol)甲醇钠的乙醇溶液加热回 流反应8h后， 旋干乙醇， 水洗后收集有机相旋干。 加入15ml去离子水， 然后用1mol/L盐酸溶 液调节水溶液PH到9。 再向水溶液中加入二氯甲烷进行萃取， 收集有机相旋干得粗产物。 用 丙酮-正己烷重结晶， 最终得到关键中间体白。
18、色固体1.13g(77)。 0035 取中间体0.64g(2.110-3mol)溶解于30ml乙腈中， 加入2-萘基异氰酸酯， 常温反 应5h， 点板检测反应完成， 生成目标物分子0.93g(96)1HNMR(501MHz,DMSO) 10.02(s, 1H),8.06(d,J8.4Hz,1H),7.97(d,J8.2Hz,1H),7.92(d,J7.4Hz,1H),7.77(d,J 8.2Hz,1H),7.54(ddt,J24.7,14.9,7.6Hz,9H),6.18(s,1H),4.48(s,2H)。 0036 实施例2 0037 FTCI-2377 0038 0039 取1-苯基-5-。
19、巯基1H-四氮唑1.78g(0.01mol)加入圆底烧瓶， 滴加30ml甲醇， 搅拌 至白色固体完全溶解。 搅拌下滴加4-氯乙酰乙酸乙酯1.81g(0.011mol)室温搅拌反应5h， 点 板反应完全。 减压旋干甲醇， 向残留的油状物中加入5ml去离子水溶解， 再加入乙酸乙酯进 行萃取水相三次， 合并有机相， 干燥， 减压回收乙酸乙酯， 得到无色油状液体2.82g(93)。 0040 取上一步得到的油状物1.5g(4.910-3mol)， 加入适量的无水乙醇搅拌搅拌下加 入盐酸胍0.94g(9.810-3mol)， 加入含有0.53g(9.810-3mol)甲醇钠的乙醇溶液加热回 流反应8h后。
20、， 旋干乙醇， 水洗后收集有机相旋干。 加入15ml去离子水， 然后用1mol/L盐酸溶 液调节水溶液PH到9。 再向水溶液中加入二氯甲烷进行萃取， 收集有机相旋干得粗产物。 用 丙酮-正己烷重结晶， 最终得到关键中间体白色固体1.13g(77)。 0041 将0.2g(0.66mmol)中间体溶解于15ml乙腈， 加入对氯苯甲酰异硫氰酸酯0.15g (0.792mmol)， 40回流反应8h， 有白色固体析出， 为目标物分子。 1HNMR(501MHz,DMSO) 7.97(s,2H),7.60(d,J67.3Hz,7H),6.78(s,2H),5.62(s,1H),4.25(s,2H),1。
21、.22(s,2H)。 0042 实施例3 0043 FTCI-2369 0044 0045 取1-苯基-5-巯基1H-四氮唑1.78g(0.01mol)加入圆底烧瓶， 滴加30ml甲醇， 搅拌 至白色固体完全溶解。 搅拌下滴加4-氯乙酰乙酸乙酯1.81g(0.011mol)室温搅拌反应5h， 点 说明书 4/6 页 7 CN 105777718 A 7 板反应完全。 减压旋干甲醇， 向残留的油状物中加入5ml去离子水溶解， 再加入乙酸乙酯进 行萃取水相三次， 合并有机相， 干燥， 减压回收乙酸乙酯， 得到无色油状液体2.82g(93)。 0046 取上一步得到的油状物1.5g(4.910-3m。
22、ol)， 加入适量的无水乙醇搅拌搅拌下加 入盐酸胍0.94g(9.810-3mol)， 加入含有0.53g(9.810-3mol)甲醇钠的乙醇溶液加热回 流反应8h后， 旋干乙醇， 水洗后收集有机相旋干。 加入15ml去离子水， 然后用1mol/L盐酸溶 液调节水溶液PH到9。 再向水溶液中加入二氯甲烷进行萃取， 收集有机相旋干得粗产物。 用 丙酮-正己烷重结晶， 最终得到关键中间体白色固体1.13g(77)。 0047 苯甲酰氯的无水乙腈溶液(1.4058g,0.01mol)(50毫升)逐滴加入到硫氰酸钾悬浮 液(0.9718克， 0.01摩尔)无水乙腈(50毫升)中。 将反应混合物在回流下。
23、加热45分钟， 然后冷 却到室温。 过滤， 取滤液， 得到苯甲酰异硫氰酸酯的乙腈溶液。 取30ml上述溶液， 向其中加入 0.2g(0.66mmol)中间体， 回流反应8h， 有浅黄色固体析出， 过滤取滤渣， 干燥得到目标物分 子固体0.2g(71)。 1HNMR(501MHz,DMSO) 7.94(s,1H),7.60(d,J67.3Hz,9H),6.67(s, 2H),5.66(s,1H),4.25(s,2H),1.24(s,2H)。 0048 实施例4 0049 FTCI-2301 0050 0051 取1-苯基-5-巯基1H-四氮唑1.78g(0.01mol)加入圆底烧瓶， 滴加30m。
24、l甲醇， 搅拌 至白色固体完全溶解。 搅拌下滴加4-氯乙酰乙酸乙酯1.81g(0.011mol)室温搅拌反应5h， 点 板反应完全。 减压旋干甲醇， 向残留的油状物中加入5ml去离子水溶解， 再加入乙酸乙酯进 行萃取水相三次， 合并有机相， 干燥， 减压回收乙酸乙酯， 得到无色油状液体2.82g(93)。 0052 取上一步得到的油状物1.5g(4.910-3mol)， 加入适量的无水乙醇搅拌搅拌下加 入盐酸胍0.94g(9.810-3mol)， 加入含有0.53g(9.810-3mol)甲醇钠的乙醇溶液加热回 流反应8h后， 旋干乙醇， 水洗后收集有机相旋干。 加入15ml去离子水， 然后用。
25、1mol/L盐酸溶 液调节水溶液PH到9。 再向水溶液中加入二氯甲烷进行萃取， 收集有机相旋干得粗产物。 用 丙酮-正己烷重结晶， 最终得到关键中间体白色固体1.13g(77)。 0053 将0.3g(110-3mol)中间体用重蒸THF15ml溶解， 搅拌冰浴下滴加TEA0.5ml， 冰 浴下滴加含有4-氯甲基苯甲酰氯0.21g(1.110-3mol)的THF溶液滴加完毕， 室温搅拌反应 3h， 点板反应完成， 减压旋干THF， 加入饱和氯化铵溶液洗涤， 再用二氯甲烷萃取水相， 合并 有机相干燥旋干柱层析最终得到目标物分子0.2g(55)。 1HNMR(501MHz,DMSO) 8.10(d。
26、,J 8.1Hz,2H),7.67(d,J6.5Hz,7H),7.13(s,2H),6.68(s,1H),4.89(s,2H),4.58(s,2H)。 0054 应用实施例 0055 采用MTT法进行细胞抑制率检测， 测试方法如下： 0056 1.接种细胞： 用含10胎/小牛血清得培养液配成单个细胞悬液， 以每孔103-105 个细胞接种到96孔板， 每孔体积100-200 L。 0057 2.培养细胞： 同一般培养条件， 培养1-2天(原代细胞不同， 可根据试验目的和要求 决定培养时间， 神经元7-10天， 心肌细胞8-14天)。 说明书 5/6 页 8 CN 105777718 A 8 0。
27、058 3.吸去原培养基， 每孔加入以无血清培养基配制的不同浓度药物(原代细胞例 外)。 0059 4.培养24或48h后， 每孔加MTT溶液(5mg/ml， 用pH7.4的PBS配制， 避光保存)10- 20 l. (每孔培养基为100 L， 加10 l， 每孔培养基为200 L， 则加20 Ll)。 0060 5.37继续孵育4h， 终止培养， 小心吸弃孔内培养上清液(对于悬浮细胞需要离 心后再吸弃孔内培养上清液)。 0061 6.每孔加150ulDMSO， 振荡10min， 使结晶物充分融解。 0062 7.比色： 选择490nm波长， 在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值， 记录结果， 以时 间为横坐标， 吸光值为纵坐标绘制曲线。 根据方法获得的细胞抑制率结果如表1所示。 0063 表1细胞抑制率测试结果 0064 说明书 6/6 页 9 CN 105777718 A 9 。