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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410088040.6 (22)申请日 2014.03.11 (73)专利权人 中国人民解放军第三军医大学第 二附属医院 地址 400037 重庆市沙坪坝区新桥正街183 号 (72)发明人 黄博刘铭汉王海刘兰涛 周跃 (74)专利代理机构 重庆华科专利事务所 50123 代理人 康海燕 (51)Int.Cl. C12N 5/10(2006.01) C12N 15/867(2006.01) A61L 27/38(2006.01) C12R 1/91(2006.01) (56)对。
2、比文件 CN 103013910 A,2013.04.03, CN 102250841 A,2011.11.23, Lan-Tao Liu et al.Characteristics of Stem Cells Derived from the Degenerated Human Intervertebral Disc Cartilage Endplate. PLoS ONE .2011,第6卷(第10期), 审查员 王溯铭 (54)发明名称 永生化人软骨终板干细胞系的制备方法及 其用途 (57)摘要 本发明属于细胞工程技术领域， 具体涉及永 生化人软骨终板干细胞系的制备方法及其用途。 本发明。
3、要解决的技术问题是为构建永生化人软 骨终板干细胞系提供一种有效的制备方法。 本发 明的技术方案是采用慢病毒转染技术构建永生 化人软骨终板干细胞系的制备方法， 包括如下步 骤： a、 构建SV40T抗原病毒载体； b、 SV40T抗原基 因转染人终板干细胞； c、 传代并筛选得到永生化 软骨终板干细胞。 本发明还提供了由上述方法得 到的永生化人软骨终板干细胞系在制备骨组织 工程材料中的用途。 本发明可应用于组织工程骨 的制备， 为临床上一系列长骨缺损、 骨不连病人 提供一种价格低廉、 成骨能力强的骨组织工程的 种子细胞。 权利要求书1页 说明书7页 序列表7页 附图6页 CN 103865877。
4、 B 2016.08.31 CN 103865877 B 1.一种永生化人退变软骨终板干细胞系的制备方法， 所述干细胞系用在长骨修复中作 为骨组织工程材料， 其特征在于： 将外源性猴肾病毒SV40T抗原基因转染人终板软骨干细 胞而诱导获得永生化人终板软骨干细胞系； 其中， 外源性SV40T抗原基因通过构建成慢病 毒颗粒转染人终板软骨干细胞； 所述外源性SV40T抗原的核苷酸序列如序列21所示； 包 括如下步骤： a、 构建SV40T抗原病毒载体： 将表达SV40T抗原基因的逆转录病毒载体和包装载体 共转染人胚肾293细胞系HEK293， 包装出表达SV40T抗原的逆转录病毒； b、 慢病毒转染。
5、： 将人退变软骨终板原代干细胞传至第3代， 使细胞密度为3103/ ml， 按0.5ml/cm2培养面积添加含4 g/ml聚凝胺的逆转录病毒， 病毒滴度为1108 TU/ml， 感染2天后， 换液并添加2ml的0.4mg/ml的潮霉素B筛选14天， 形成筛选后 的干细胞集落； c、 传代： 将筛选后的干细胞集落扩增并进行连续传至30代以上， 即得到永生化的人 退变软骨终板干细胞系， 冻存备用； 所述步骤b中的人退变软骨终板原代干细胞采用如下方法制备： 将手术中遗弃的软骨 终板标本， 在无菌条件下去除棉絮状的髓核组织和白色的纤维状纤维环组织， 得到透明状 的软骨终板； 机械-胶原酶法获取软骨终板。
6、原代细胞。 2.如权利要求1所述的永生化人退变软骨终板干细胞系的制备方法， 其特征在于： 步 骤b中人退变软骨终板原代干细胞传至第3代的培养条件如下： 培养基为90%DMEM/ F12， 含10%的胎牛血清， 细胞长满接近培养皿80%后传代。 3.由权利要求12任一项所述的方法得到的永生化的人退变软骨终板干细胞系。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103865877 B 2 永生化人软骨终板干细胞系的制备方法及其用途 技术领域 0001 本发明属于细胞工程技术领域， 具体涉及永生化人软骨终板干细胞系的制备方法 及其用途。 背景技术 0002 临床上常由于某些原因如外伤、 感染、 肿瘤等造成开。
7、放性骨折、 骨不连以及骨缺 损， 是运动系统疾病中常见和处理困难的疾患， 也是患者丧失劳动力的重要原因。 解决长骨 缺损、 骨不连等需要大量具有良好符合人体生物学、 生物力学特性的骨移植材料。 为此， 许 多学者进行了相关的研究， 取得了一些成绩， 但是对于长骨缺损， 仍然是运动系统疾病中的 难题。 随着近年来组织工程技术的兴起， 骨缺损的修复研究进入组织工程的时代。 目前的组 织工程理论认为， 种子细胞、 支架材料、 生长因子是组织工程的三要素。 传统上一般选用骨 髓间充质干细胞作为骨组织工程的种子细胞， 但其面临诸多的局限性， 包括手术病人抽取 骨髓面临二次创伤， 细胞数量受限， 是否具备。
8、最佳的成骨能力等。 比较而言， 人软骨终板干 细胞 （CartilageEndplateStemCells,CESCs） 具有取材方便， 不会给病人带来二次创伤， 易于分离培养， 体外增殖能力强， 同时具有较强的成骨能力。 而且CESCs作为其他非组织工 程的种子细胞也具有广阔前景， 许多研究证实CESCs具有成体干细胞特性， 表现为较强的增 殖能力和向多种间充质细胞分化的潜能。 由于临床上对骨移植材料的需求量巨大， 同时组 织工程技术的发展有望实现骨缺损的理想修复。 但是分离原代培养的CESCs随着传代次数 的提高， 其活力越来越差， 最终发生凋亡， 难以存活， 因此构建永生化人退变软骨终板。
9、干细 胞系具有较强的实用价值， 同时为研究人终板干细胞的生物学行为提供标准细胞系， 为组 织工程基础研究提供平台， 为临床应用提供足量种子细胞， 并为建立人退变软骨终板干细 胞系提供一种有效、 可靠的方法。 发明内容 0003 本发明要解决的技术问题是为构建永生化人软骨终板干细胞系提供一种新选择。 0004 本发明的技术方案是永生化人退变软骨终板干细胞系的制备方法， 包括如下步 骤： 0005 将外源性猴肾病毒SV40T抗原基因转染人终板软骨干细胞而诱导获得永生化人终 板软骨干细胞系； 其中， 外源性SV40T抗原基因通过构建成慢病毒颗粒转染人终板软骨干细 胞； 所述外源性SV40T抗原的核苷。
10、酸序列如序列21所示； 包括如下步骤： 0006 a、 构建SV40T抗原病毒载体： 将表达SV40T抗原基因的逆转录病毒载体和包装载体 共转染人胚肾293细胞系HEK293， 包装出表达SV40T抗原的逆转录病毒； 0007 b、 慢病毒转染： 将人退变软骨终板原代干细胞传至第3代， 使细胞密度为3103/ ml， 按0.5ml/cm2培养面积添加含4 g/ml聚凝胺的逆转录病毒， 病毒滴度为1108TU/ml， 感 染2天后， 换液并添加2ml的0.4mg/ml的潮霉素B筛选14天， 形成筛选后的干细胞集落； 0008 c、 传代： 将筛选后的干细胞集落扩增并进行连续传至30代以上， 即得。
11、到永生化的 说明书 1/7 页 3 CN 103865877 B 3 人退变软骨终板干细胞系iCESCs， 冻存备用。 0009 其中， 步骤b中的人退变软骨终板原代干细胞采用如下方法制备： 将手术中遗弃的 软骨终板标本， 在无菌条件下去除棉絮状的髓核组织和白色的纤维状纤维环组织， 得到透 明状的软骨终板； 机械-胶原酶法获取软骨终板原代细胞。 0010 其中， 步骤b中人退变软骨终板原代干细胞传至第3代的培养条件如下： 培养基为 90%DMEM/F12， 含10%的FBS （胎牛血清） ， 细胞长满接近培养皿80%后传代。 0011 本发明还提供了由上述方法得到的永生化的人退变软骨终板干细胞。
12、系。 0012 本发明还提供了由上述方法得到的永生化的人退变软骨终板干细胞系在制备骨 组织工程材料中的用途。 0013 本发明的有益效果： 本发明方法提供一种永生化的人椎间盘软骨终板干细胞的制 备方法。 该方法得到的永生化干细胞与原代培养软骨终板干细胞具有相似的生物学特性， 能向骨、 软骨及脂肪等方向诱导分化， 而且较骨髓间充质干细胞具有更强的成骨分化能力， 且不具成瘤性。 本发明提供了永生化人软骨终板干细胞的制备方法以及在骨组织工程中的 应用， 主要可应用于组织工程骨的制备， 为临床上一系列长骨缺损、 骨不连病人提供一种价 格低廉、 成骨能力强的骨组织工程的种子细胞。 附图说明 0014 图。
13、1.琼脂糖悬浮培养筛选CESCs。 A.接种于琼脂糖中的单个细胞。 B.培养六周后的 单细胞克隆 （黑色箭头） 和单个细胞 （红色箭头） 。 C.单细胞克隆的龙胆紫染色。 D.经扩增培 养的CESCs。 0015 图2包装的SV40T抗原慢病毒孔内可见病毒空斑。 0016 图3转染后形成的单克隆细胞。 0017 图4单克隆细胞扩大培养后。 0018 图5iCESCs的干细胞标志物流式细胞术检测。 A， B为细胞流式实验的结果。 A图纵坐 标是对应CD标志物的荧光强度。 浅色线是实验组， 深色线是阴性对照组。 0019 B图的横坐标是标志物的名称， 横坐标下面的stemcellmarkers为干。
14、细胞标志 物， Percentageofmarkers为标志物百分比。 0020 图6iCESCs的体外成骨、 成脂及成软骨诱导的组织学及分化相关基因表达的检测。 A:正常培养基， 茜素红染色， 阴性； B:诱导成骨培养基， 茜素红， 阳性； C： PCR检测成骨相关 基因表达情况； D： 正常培养基， 油红O染色， 阴性； E： 诱导成脂肪培养基， 油红O染色， 阳性； F： PCR检测成脂肪相关基因表达情况； G： 成软骨诱导培养基， 微球培养后成软骨情况； H： 成软 骨诱导培养基， 微球培养后经阿尔新蓝染色； I： PCR检测成软骨相关基因情况； J： 第三代 iCESCs倒置显微镜图。
15、片； K： 成软骨诱导培养基， 微球培养后经阿尔新蓝染色后行石蜡包埋 切片。 0021 图7.A图为永生化后第1代。 B图为永生化后第10代。 C图为永生化后第30代。 D图为 永生化后第50代。 0022 图8植入3个月后动物体内L2-L3横突间干细胞-羟基灰石复合物， 箭头所示为BM- MSCs-羟基灰石复合物， 三角所示为iCESCs-羟基灰石复合物。 A:解剖标本， B:标本固定后。 0023 图9通过Micro-CT分别选取BM-MSCs组和iCESCs组对应解剖位置的相同大小组织 说明书 2/7 页 4 CN 103865877 B 4 块。 Micro-CT照片显示如图， 图A为。
16、MSC成骨， 图B为iCESC成骨。 其中蓝色代表羟基灰石支架, 橙黄色代表新生骨。 0024 图10BM-MSCs组和iCESCs组的TMD值。（*： P0.05） 具体实施方式 0025 本发明永生化人终板软骨干细胞体系制备方法及体内植骨实验的实施例， 通过目 的基因克隆、 真核表达质粒中目的基因序列测定、 目的基因慢病毒构建、 转染SV40T抗原基 因 （SV40TAg） ， 成功转然软骨终板干细胞稳定表达SV40T抗原基因， 从而获得永生化软骨终 板干细胞体系， 并通过体内植骨实验证实其具有较强的成骨能力。 0026 外源性SV40T抗原的核苷酸序列 （SEQIDNo.21） ： 00。
17、27 ATGGATAAAGTTTTAAACGGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTAGGTCTTGAAAGGAGTGCCTGGGGGAA TATTCCTCTGATGAGAAAGGCATATTTAAAAAAATGCAAGGAGTTTCATCCTGATAAAGGAGGAGATGAAGAAAAAA TGAAGAAAATGAATACTCTGTACAAGAAAATGGAAGATGGAGTAAAATATGCTCATCAACCTGACTTTGGAGGCTTC TGGGATGCAACTGAGATTCCAACCTATGGAACTGATGAATGGGAGCAGTGGTGGAATGCCTTT。
18、AATGAGGAAAACCT GTTTTGCTCAGAAGAAATGCCATCTAGTGATGATGAGGCTACTGCTGACTCTCAACATTCTACTCCTCCAAAAAAGA AGAGAAAGGTAGAAGACCCCAAGGACTTTCCTTCAGAATTGCTAAGTTTTTTGAGTCATGCTGTGTTTAGTAATAGA ACTCTTGCTTGCTTTGCTATTTACACCACAAAGGAAAAAGCTGCACTGCTATACAAGAAAATTATGGAAAAATATTC TGTAACCTTTATAAGTAGGCATAACAGTTATAATCATAACATACTGTTTTT。
19、TCTTACTCCACACAGGCATAGAGTGT CTGCTATTAATAACTATGCTCAAAAATTGTGTACCTTTAGCTTTTTAATTTGTAAAGGGGTTAATAAGGAATATTTG A T G T A T A G T G C C T T G A C T A G A G A T C C A T T T T C T G T T A T T G A G G A AAGTTTGCCAGGTGGGTTAAAGGAGCATGATTTTAATCCAGAAGAAGCAGAGGAAACTAAACAAGTGTCCTGGAAGC TTGTAACAGAGTATGCAATGGAAACAAAA。
20、TGTGATGATGTGTTGTTATTGCTTGGGATGTACTTGGAATTTCAGTAC AGTTTTGAAATGTGTTTAAAATGTATTAAAAAAGAACAGCCCAGCCACTATAAGTACCATGAAAAGCATTATGCAAA TGCTGCTATATTTGCTGACAGCAAAAACCAAAAAACCATATGCCAACAGGCTGTTGATACTGTTTTAGCTAAAAAGC GGGTTGATAGCCTACAATTAACTAGAGAACAAATGTTAACAAACAGATTTAATGATCTTTTGGATAGGATGGATATA ATGTTTGGTTCTACAGG。
21、CTCTGCTGACATAGAAGAATGGATGGCTGGAGTTGCTTGGCTACACTGTTTGTTGCCCAA AATGGATTCAGTGGTGTATGACTTTTTAAAATGCATGGTGTACAACATTCCTAAAAAAAGATACTGGCTGTTTAAAG GACCAATTGATAGTGGTAAAACTACATTAGCAGCTGCTTTGCTTGAATTATGTGGGGGGAAAGCTTTAAATGTTAAT TTGCCCTTGGACAGGCTGAACTTTGAGCTAGGAGTAGCTATTGACCAGTTTTTAGTAGTTTTTGAGGATGTAAAGGG CACTG。
22、GAGGGGAGTCCAGAGATTTGCCTTCAGGTCAGGGAATTAATAACCTGGACAATTTAAGGGATTATTTGGATG GCAGTGTTAAGGTAAACTTAGAAAAGAAACACCTAAATAAAAGAACTCAAATATTTCCCCCTGGAATAGTCACCATG AATGAGTACAGTGTGCCTAAAACACTGCAGGCCAGATTTGTAAAACAAATAGATTTTAGGCCCAAAGATTATTTAAA GCATTGCCTGGAACGCAGTGAGTTTTTGTTAGAAAAGAGAATAATTCAAAGTGGCATTGCTTTGCTTCTTA。
23、TGTTAA TTTGGTACAGACCTGTGGCTGAGTTTGCTCAAAGTATTCAGAGCAGAATTGTGGAGTGGAAAGAGAGATTGGACAAA GAGTTTAGTTTGTCAGTGTATCAAAAAATGAAGTTTAATGTGGCTATGGGAATTGGAGTTTTAGATTGGCTAAGAAA CAGTGATGATGATGATGAAGACAGCCAGGAAAATGCTGATAAAAATGAAGATGGTGGGGAGAAGAACATGGAAGACT CAGGGCATGAAACAGGCATTGATTCACAGTCCCAAGGCTCATTTCAGGCCCCTCAGTCC。
24、TCACAGTCTGTTCATGAT CATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAAC 说明书 3/7 页 5 CN 103865877 B 5 A 0028 实施例1CESCs的获取、 分离和鉴定 0029 制定标本来源的病例纳入标准： 经患者知情同意， 年龄小于65岁， 大于30岁； 无结 核、 肝炎、 肿瘤、 糖尿病等传染性疾病及自身免疫性疾病； 行颈椎、 胸椎和腰椎融合手术。 0030 将手术中遗弃的软骨终板标本， 在无菌条件下用解剖显微镜对软骨终板标本进行 分离， 去除棉絮状的髓。
25、核组织和白色的纤维状纤维环组织， 用尖刀仔细刮除粘附于软骨终 板上的髓核， 剩下透明状的软骨终板， 并经苏木精-伊红染色法确认(HuangB,LiuLT,Li CQ ,etal .Studytodeterminethepresenceofprogenitorcellsinthe degeneratedhumancartilageendplates.EurSpineJ,2012,21:613-622)。 机械-胶原酶 法获取软骨终板原代细胞， 并以台盼蓝测定细胞活力。 将获取到的原代细胞置于37、 5% CO2、 95%湿度条件下孵箱培养， 倒置相差显微镜每天观察细胞生长情况， 每3天换液1次。。
26、 0031 机械-胶原酶法具体操作如下： 将手术中获取的椎间盘标本， 无菌状态下在超净台 紫外灯照射30分钟， 以含1%庆大霉素的磷酸盐缓冲液漂洗标本组织直到无血迹， 在解剖显 微镜下对椎间盘标本组织进行分离， 去除棉絮状的髓核组织和白色的纤维状纤维环组织， 用尖刀仔细刮除粘附于软骨终板上的髓核组织， 剩下透明状的软骨终板。 眼科剪将剩下的 软骨终板剪至1mm1mm1mm大小， 将剪碎的组织用0.25%型胶原酶于37消化6小时或 先于摇床1小时， 再于37消化4小时。 将软骨终板组织消化液经孔径为100 m或200目的滤 网过滤， 滤液在1000转/分钟条件下离心5分钟， 所得沉淀用含10%胎。
27、牛血清的Dulbecco改良 Eagle培养基洗涤遍， 再以该培养基悬浮细胞， 吹打使其成为单细胞悬液， 然后铺板于细胞 培养瓶或培养皿上。 0032 将长满近90%培养瓶的软骨终板干细胞用胰蛋白酶消化传代时， 以琼脂糖筛选系 统筛选干细胞， 如图1所示， A图为接种于琼脂糖中的单个细胞。 B图为培养六周后的单细胞 克隆 （黑色箭头） 和单个细胞 （红色箭头） ， C图为单细胞克隆的龙胆紫染色。 挑选细胞克隆， 置于培养瓶于37、 5%CO2孵箱培养扩增、 传代， 如图1D所示为经扩增培养的CESCs。 0033 实施例2构建编码SV40T抗原的慢病毒载体以及病毒颗粒包装 0034 构建编码S。
28、V40T抗原慢病毒载体： 将慢病毒载体质粒pWPT-GFP （上海吉凯基因化学 技术有限公司） 用NEB公司的BamH 和Sal 酶进行双酶切释放出GFP， 酶切条件为50 l反应体 系中BamH 和Sal 的量分别加入1 l， 37孵育30min。 最后将酶切产物进行1%低熔点琼脂糖 凝胶电泳， 用德国Qiagen公司凝胶回收试剂盒回收载体pWPT片段。 将质粒Plox-Ttag- iresTK （上海吉凯基因化学技术有限公司） 和质粒Plox-SV40-iresTK （上海吉凯基因化学技 术有限公司） 用Sal 和EcoRI进行双酶切， 酶切条件为3730min， 6520min使酶灭活；。
29、 然后 将两端抹平， 方法是在上述反应结束后向反应体系加入1 lKlenow酶和2mMdNTP,室温放置 15min， 75,25min， 最后再加入0.25 lcip酶于37孵育30min。 最后将酶切产物进行1%低 熔点琼脂糖凝胶电泳， 用德国Qiagen公司凝胶回收试剂盒回收SV40T抗原片段。 将该片段测 序后进行基因序列比对证实： SV40T抗原片段与GenebankNo.J02400的nt2691-5163序列相 同。 随后将得到的目的基因片段 （SV40T抗原片段） 与回收的载体片段连接， 连接反应条件 为： 使用T4连接酶， 16过夜。 如此得到编码SV40T抗原基因的pWPT。
30、-SV40Tag载体。 0035 慢病毒颗粒的包装： 将293T细胞培养在含10%FCS、 100 g/ml青/链霉素的DMEM中， 转染前24h将其以3106细胞/皿接种在100mm的培养皿中。 转染前2h更新新鲜培养基。 每个 说明书 4/7 页 6 CN 103865877 B 6 培养皿转染20 g质粒DNA， 其中包括： 10 g转染质粒 （pWPT-SV40Tag） ， 3.5 g衣壳编码质粒和 6.5 g包装质粒。 将此20 g质粒载体用0.1TE溶液 （1mMTris-HCl和0.1mMEDTA)重悬至体 积450 l， 再加入50 l的2.5MCaCl2溶液， 轻轻混匀。 然。
31、后一边漩涡混匀一边逐滴加入500 l 的2HEPES缓冲盐溶液(0.1MHEPES,0.281MNaCl， 和1.5mMNa2HPO4室温放置30min,然后 将混合物加到人胚肾293细胞系(HEK293)上， 慢慢加入悬液， 边加边轻轻震动皿中的培养 基。 然后将培养皿放入37培养箱培养。 16h后更新10ml新鲜培养基。 以后每隔24h收集并更 换一次培养基， 收集的上清通过900g离心10min以去除细胞碎片， 用0.2 m孔径的针头滤器 过滤。 通过上述方法包装具有感染能力但复制缺陷的带SV40T抗原基因的慢病毒颗粒， 然 后直接使用或冻存在-80备用。 如图2可见包装的SV40T抗原。
32、慢病毒孔内也可见病毒空斑。 0036 实施例3慢病毒颗粒感染人软骨终板干细胞 0037 将传至第3代的CESCs细胞种植于T25细胞培养瓶并加入2ml含4 g/ml聚凝胺的慢 病毒颗粒， 转染后的软骨终板干细胞如图3所示。 感染2天后， 应用0.4mg/ml的潮霉素B筛选 14天， 形成筛选后的细胞集落， 如图4所示。 将筛选后的干细胞集落扩增并进行连续传至30 代以上， 即得到永生化的人退变软骨终板干细胞系iCESCs， 冻存备用。 0038 实施例4永生化终板干细胞的安全性评价 0039 取对数生长期的实施例3中获得的永生化终板干细胞(immortalizedCESCs， iCESCs)，。
33、 用Hank s液(137.93mMNaCl， 5.33mMKCl， 4.17mMNaHCO3,1.26mMCaCl2， 0.493mMMgCl2,0.441mMKH2PO4,0.338mNa2HPO4,5.56MmD-葡萄糖)洗涤2次后重悬于DMEM/ F12基础培养基中， 将细胞接种于5只BALB/c裸鼠(第三军医大学动物实验中心)皮下， 每个 点接种5106个细胞。 另一组裸鼠同时于皮下相同部位接种肝癌细胞株BEL-7402(ATCC， 美 国)作为阳性对照， 每个点接种5106个细胞作为阳性对照。 接种后连续观察6个月， 结果在 接种iCESCs的裸鼠的皮下无肿瘤形成， 而在相同部位接。
34、种同样数量的肝癌细胞BEL-7402裸 鼠皮下在移植1个月后均有肿瘤形成。 0040 实施例5永生化终板干细胞表面标志物检测 0041 iCESCs经体外培养扩增后， 运用流式分析检测iCESCs的表面抗原， 结果如图5所 示， CD105,CD73,CD90,CD44,CD166和STRO1为阳性， 单个核细胞标志CD14， 造血干细胞标志 CD34， B细胞标志CD19， 血细胞标志CD105， 2型HLA抗原HLA-DR均为阴性。 流式检测结果提示 iCESCs符合间充质干细胞表面标志物标准。 0042 实施例6iCESCs体外成骨、 成脂及成软骨诱导实验 0043 iCESCs体外成骨。
35、组织学及PCR： 0044 在24孔板中， 每孔铺上1.5104细胞的iCESCs。 分别在正常生长培养基中和成骨 诱导培养基中培养3周后， 正常培养组茜素红染色为阴性， 如图6(A)。 诱导培养基组茜素红 染色为阳性， 如图6 （B） ， 可见大量钙结节形成。 PCR检测成骨相关基因表达情况如图6 （C） ， OC， ALP， RUNX2在正常培养基组 （G） 表达为阴性， 在成骨诱导组 （O） 表达为阳性， GAPDH为内 参。 证实iCESCs在成骨诱导培养基中具有成骨能力。 0045 所用到的引物序列如下： 0046 OC： 0047 上游引物： AGGGCAGCGAGGTAGTGAA。
36、GA （SEQIDNo.1） 0048 下游引物： CTAGACCGGGCCGTAGAAGC （SEQIDNo.2） 说明书 5/7 页 7 CN 103865877 B 7 0049 ALP： 0050 上游引物： CTTGACCTCCTCGGAAGACACT （SEQIDNo.3） 0051 下游引物： ACCTTGTAGCCAGGCCCATT （SEQIDNo.4） 0052 RUNX2： 0053 上游引物： CTTCCAGACCAGCAGCACTCC （SEQIDNo.5） 0054 下游引物： GCTTCCATCAGCGTCAACACC （SEQIDNo.6） 0055 GAPDH。
37、: 0056 上游引物:TGGGGTGATGCTGGTGCTGAGT （SEQIDNo.7） 0057 下游引物:AGGTTTCTCCAGGCGGCATGT （SEQIDNo.8） 0058 iCESCs体外成脂组织学及PCR： 0059 在24孔板中， 每孔铺上5103细胞的iCESCs。 分别在正常生长培养基中和成脂诱 导培养基中培养3周后， 正常培养组油红O为阴性， 如图6 （D） 。 诱导培养基组茜素红染色为阳 性， 如图6 （E） ， 可见大量脂肪空泡形成。 PCR检测成脂相关基因表达情况如图6 （F） ， LPL,APP, PPAR2在正常培养基组 （G） 表达为阴性， 在成骨诱导。
38、组 （A） 表达为阳性， GAPDH为内参。 证实 iCESCs在成脂诱导培养基中具有成脂能力。 0060 所用到的引物序列如下： 0061 LPL: 0062 上游引物:TTGAGAAAGGGCTCTGCTTGA （SEQIDNo.9） 0063 下游引物:TTGTAGGGCATCTGAGAACGA （SEQIDNo.10） 0064 APP: 0065 上游引物:CAAGCAGTGCAAGACCCATC （SEQIDNo.11） 0066 下游引物:AGAAGGGCATCACTTACAAACTC （SEQIDNo.12） 0067 PPAR2: 0068 上游引物:GAGTTCGCCAAG。
39、AGCATCCC （SEQIDNo.13） 0069 下游引物:CCCGTCCTTGTTGACGATAGAG （SEQIDNo.14） 0070 iCESCs体外成软骨组织学及PCR： 0071 在24孔板中， 每孔铺上3105细胞的iCESCs， 如图6 （G） 。 消化悬浮离心成球后分别 在正常生长培养基中和成软骨诱导培养基中行微球培养 （MicropalletsCulture） 3周后， 显示正常培养组阿尔新蓝染色为阴性， 如图6 （G） 。 诱导培养基阿尔新蓝染色为阳性， 如图6 （K） ， 可见细胞外基质形成 （蓝色） 。 将诱导组行石蜡包埋切片染色， 如图6 （K） ， 证实阿尔新。
40、蓝 染色阳性。 PCR检测成软骨相关基因表达情况如图6 （I） ， COL-2， AGG,SOX-9在正常培养基组 （G） 表达为阴性， 在成软骨诱导组 （C） 表达为阳性， GAPDH为内参。 证实iCESCs在成软骨诱导 培养基中具有成软骨能力。 0072 所用到的引物序列如下： 0073 COL-2: 0074 上游引物:CCTTCCTACGCCTGCTGTCC （SEQIDNo.15） 0075 下游引物:GAACCTGCTATTGCCCTCTGC （SEQIDNo.16） 0076 AGG: 0077 上游引物:GTGCGGGTCAACAGTGCCTAT （SEQIDNo.17） 说。
41、明书 6/7 页 8 CN 103865877 B 8 0078 下游引物:GCCTTTCACCACGACTTCCAG （SEQIDNo.18） 0079 SOX-9: 0080 上游引物:TGAAGATGACCGACGAGCAGG （SEQIDNo.19） 0081 下游引物:GCGTCCAGTCGTAGCCTTTGAG （SEQIDNo.20） 0082 实施例7iCESCs体外连续传代扩增 0083 在T25细胞培养瓶中加入DMEM/F12， 10%FCS行连续体外扩增培养 （培养条件是37 ， 5%CO2细胞培养箱。 传代操作为： 将长满近90%的细胞培养瓶或培养皿吸弃培养基， 加入 。
42、磷酸盐缓冲液漂洗2遍， 加入胰蛋白酶消化细胞约1-2分钟， 显微镜下观察见少量细胞脱落 时加入1ml含10%胎牛血清的培养基终止消化， 轻轻吹打细胞， 使细胞脱离瓶底， 将细胞吸取 移入离心管以1000转/分钟， 离心5分钟， 弃上清， 磷酸缓冲液漂洗2遍， 用含10%胎牛血清培 养基轻轻吹打使细胞变成单细胞悬液， 取10 l悬液进行细胞计数， 用培养基调整为3104/ ml， 并铺细胞于新的培养瓶或培养皿上。 如图7 （A） 为永生化后第1代。 图7 （B） 为永生化后 第10代。 图7 （C） 为永生化后第30代。 图7 （D） 为永生化后第50代。 观察可发现连续体外传代 扩增后， 细胞。
43、外形变化不明显， 细胞增殖速度固定。 0084 实施例8iCESCs与骨髓间充质干细胞复合生物材料后横突间植骨实验 0085 将iCESCs与骨髓间充质干细胞分别在体外复合羟基灰石支架 （包含其他相关生物 复合材料） ， 于新西兰大白兔L2-L3横突间植骨,如图8。 3个月后观察成骨差异， 以BM-MSCs （骨髓间充质干细胞） 为对照组， 该细胞是目前最常用的骨组织工程的种子细胞。 行MicroCT （microcomputedtomography， 微计算机断层扫描技术） ， 如图9所示， 经MicroCT中软件测定 BMD （骨矿物质密度， Bonemineraldensity） ， T。
44、MD （组织矿物质密度， Tissuemineraldensity） 值 （见表1） ， 经统计后得到TMD值差异具有统计学意义， 见图10， 提示永生化终板干细胞具有 明显强于骨髓间充质干细胞的体内成骨能力。 0086 表1MicroCT结果 0087 说明书 7/7 页 9 CN 103865877 B 9 0001 序列表 1/7 页 10 CN 103865877 B 10 0002 序列表 2/7 页 11 CN 103865877 B 11 0003 序列表 3/7 页 12 CN 103865877 B 12 0004 序列表 4/7 页 13 CN 103865877 B 13。
45、 0005 序列表 5/7 页 14 CN 103865877 B 14 0006 序列表 6/7 页 15 CN 103865877 B 15 0007 序列表 7/7 页 16 CN 103865877 B 16 图1 图2 说明书附图 1/6 页 17 CN 103865877 B 17 图3 图4 说明书附图 2/6 页 18 CN 103865877 B 18 图5 说明书附图 3/6 页 19 CN 103865877 B 19 图6 图7 说明书附图 4/6 页 20 CN 103865877 B 20 图8 图9 说明书附图 5/6 页 21 CN 103865877 B 21 图10 说明书附图 6/6 页 22 CN 103865877 B 22 。