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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410124438.0 (22)申请日 2014.03.28 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 103898038 A (43)申请公布日 2014.07.02 (83)生物保藏信息 CGMCC No. 8906 2014.03.11 CGMCC No. 8907 2014.03.11 (73)专利权人 清华大学 地址 100084 北京市海淀区100084-82信箱 (72)发明人 于慧敏李煦杨欢李雪 沈忠耀 (74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理 。
2、有限公司 11246 代理人 陈波 (51)Int.Cl. C12N 1/21(2006.01) C12P 21/02(2006.01) C12R 1/125(2006.01) C12R 1/085(2006.01) C12R 1/38(2006.01) (56)对比文件 WO 2012116230 A1,2012.08.30, CN 1554747 A,2004.12.15, Milton H. Saier, Jr. et al.Transport Capabilities Encoded Within the Bacillus subtilis Genome. J. Mol. Microb。
3、iol. Biotechnol. .2002,第4卷(第1期), Xu Li er al.Overexpression of specific proton motive force-dependent. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology .2014,第42卷(第1期), 审查员 王子晔 (54)发明名称 一种高表达脂肽类生物表面活性剂的工程 菌及其应用 (57)摘要 本发明公开了属于生物技术和生物化工领 域的一种高表达脂肽类生物表面活性剂的工程 菌及其应用。 本发明采用基因工程技术构建过表 达跨膜蛋白YcxA的工程菌， 强化。
4、了脂肽由细胞内 向细胞外的跨膜运输， 从而显著提高了脂肽的产 量。 本发明所得过表达脂肽载体蛋白YcxA的基因 工程菌与出发菌株相比， 表面活性素产量提高 97， 可用于脂肽类生物表面活性剂的生产， 具 有良好的工业应用前景， 发酵所得发酵液中脂肽 产量平均为1-5g/L。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图2页 CN 103898038 B 2016.10.26 CN 103898038 B 1.一种高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌， 其是将脂肽载体蛋白YcxA基因转化至 原始菌株构建而成， 其过表达脂肽载体蛋白YcxA； 所述脂肽载体蛋白YcxA基因ycxA为SEQIDNO:1。
5、所示DNA序列； 所述原始菌株为枯草芽 孢杆菌。 2.根据权利要求1所述的工程菌， 其特征在于， 所述脂肽类生物表面活性剂为表面活性 素。 3.根据权利要求1所述的工程菌， 其特征在于， 该工程菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TS589， 保藏号为CGMCCNo.8907， 其是将脂肽载体蛋白YcxA基因转化至原始菌株 构建而成， 所述原始菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)THY-7， 保藏号为CGMCC No.8906。 4.权利要求1-3任一权利要求所述的工程菌在制备脂肽类生物表面活性剂中的应用。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 利用。
6、权利要求1-3任一权利要求所述工程 菌生产脂肽类生物表面活性剂， 步骤如下： 1)将工程菌接入LB液体培养基中， 在35-40、 摇床转速为150-250rpm的条件下培养 10-20小时， 得到工程菌菌液； 2)按照1-20的体积百分比将步骤1)得到的工程菌菌液接入发酵培养基中， 在35-40 、 摇床转速为150-250rpm的条件下培养20-40小时， 得到含有脂肽的发酵液； 所述发酵培 养基的组成为： 糖类30-100g/L， 无机氮源10-50g/L， 有机氮源0.5-3g/L， KH2PO40.1-1g/L， Na2HPO412H2O0.5-3g/L， MgSO47H2O0.05-。
7、0.3g/L， CaCl20.002-0.01g/L， MnSO4H2O 0.002-0.01g/L， FeSO47H2O0.002-0.01g/L， pH6.5-7.5。 6.权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述糖类为葡萄糖、 蔗糖、 果糖、 麦芽糖、 淀粉或 淀粉水解液。 7.权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述无机氮源为硫酸铵、 氯化铵、 硝酸铵、 硝酸 钠或硝酸钾； 所述有机氮源为蛋白胨、 酵母膏、 牛肉膏或大豆粉。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103898038 B 2 一种高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术和生物化工。
8、领域， 具体涉及一种高表达脂肽类生物表面活性 剂的工程菌及其应用。 背景技术 0002 脂肽(lipopeptide)类生物表面活性剂是一种主要由芽孢杆菌、 链霉菌等微生物 合成的两性物质， 由亲水的环状寡肽与疏水的脂肪酸碳链组成。 不同的芽孢杆菌菌株合成 脂肽的种类也不同， 根据脂肽的分子结构主要可分为表面活性素(surfactin)、 芬芥素 (fengycin、 plipastatin)伊枯草菌素(iturin、 bacillomycin、 mycosubtilin)等。 不同种类 的脂肽的区别主要在于氨基酸组成与成环方式。 例如， 非极性的缬氨酸与亮氨酸， 以及极性 的谷氨酸与天冬氨酸。
9、组成的7肽构成了表面活性素的环状寡肽部分； 而芬芥素A则含有酪氨 酸、 脯氨酸、 鸟氨酸等氨基酸。 脂肽， 尤其是表面活性素具有良好的表面活性与生物相容性， 在生物防治、 环境保护以及石油开采领域有着广阔的应用前景。 但由于芽孢杆菌的脂肽合 成水平低， 与目前使用的化学表面活性剂相比成本劣势明显， 因此脂肽的规模化生产和广 泛应用还都没有实现。 0003 目前， 提高微生物脂肽生产水平的方法主要是通过优化培养条件与对菌株进行诱 变。 在培养条件方面， 王德培等对发酵培养基成分、 接种量、 培养温度、 通气量等因素进行了 优化， 枯草芽孢杆菌CGMCCMo.3412抗菌脂肽的产量达到12g/L(。
10、CN101892176)。 牟伯中等 通过向培养基中添加特定种类的氨基酸 ， 实现了枯草芽孢杆菌脂肽产量的提高 (CN101775427)。 Yoneda等分别以麦芽糖与黄豆粉为主要的碳氮源， 培养20-90小时， 使表面 活性素的产量提高至50g/L(WO2002026961)。 Fahim等分析了不同的发酵供氧条件对脂肽产 量以及产物选择性的影响， 其结果表明， kLa在0.040.08s-1时表面活性素的产量最高(2g/ L)， 而kLa在0.01s-1时芬芥素的产量可达最高(0.3g/L)(BioresourceTechnology,2012, 126:1-6)。 在菌种诱变方面， 对。
11、玫瑰孢链霉菌ATCC31568进行紫外诱变， 脂肽A21978C的产 量提高了185(CN101928677)。 Carrera等使用亚硝基甲替尿烷(nitrosomethyl urethane， NMU)对枯草芽孢杆菌ATCC21332进行化学诱变， 得到的突变菌株经过40到90小 时的发酵后， 发酵液中表面活性素的浓度为2.0-4.0g/L(US5227294)。 Liu等(Plasma ScienceandTechnology,2006,8(4):491)使用低能氮离子束注入进行了菌株诱变， 突变 菌株发酵液50与100倍稀释后的表面活性分别是出发菌株的5.6倍与17.4倍。 0004 。
12、除优化培养条件与菌株诱变外， 利用基因工程手段对生产菌株进行遗传改造从而 提高脂肽产量也有部分报道。 顾晓波等在枯草芽孢杆菌细胞中表达comA基因， 脂肽产量提 高了50(CN1554747)。 卢兆新等在ATCC9943菌株中通过质粒超量表达脂肽抗性基因 yerP， 表面活性素与芬芥素产量分别是出发菌株的1.6与1.8倍(CN102220367)。 通过将脂肽 mycosubtilin合成酶的启动子进行替换， mycosubtilin的产量发生了8-10倍的提升 (BioresourceTechnology,2013,145:264-270)。 0005 表面活性素在枯草芽孢杆菌细胞内合成，。
13、 并被分泌到细胞外。 脂肽跨膜运输载体 说明书 1/6 页 3 CN 103898038 B 3 蛋白则以主动运输的方式将细胞内合成并积累的表面活性素转移至细胞外。 蛋白YcxA的基 因ycxA在枯草芽孢杆菌基因组上位于表面活性素合成基因srfA下游， 其表达产物根据二级 结构预测分析为MFS家族跨膜蛋白 ， 可能具有跨膜运输脂肽的功能( Molecular Microbiology ,1993 ,8:821-831； JournalofMolecularMicrobiologyand Biotechnology,2002,4:37-67)。 未见有关于YcxA功能及其影响脂肽生产的研究结果。。
14、 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌。 0007 本发明的目的还在于提供上述高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌在制备脂 肽类生物表面活性剂中的应用。 0008 本发明的技术方案如下： 0009 一种高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌， 其是将脂肽载体蛋白YcxA基因转化 至原始菌株构建而成， 其过表达脂肽载体蛋白YcxA。 0010 所述脂肽类生物表面活性剂为表面活性素。 0011 所述原始菌株为具有产脂肽类生物表面活性剂能力的野生菌及其诱变株、 突变株 或基因工程改造菌株。 0012 所述原始菌株为枯草芽孢杆菌、 蜡状芽孢杆菌或假单胞菌。 0013。
15、 优选的， 所述原始菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)THY-7， 保藏号为 CGMCCNo.8906。 0014 所述高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌， 优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TS589， 保藏号为CGMCCNo.8907， 其是将脂肽载体蛋白YcxA基因转化至原始菌株 构建而成， 所述原始菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)THY-7， 保藏号为CGMCC No.8906。 0015 上述工程菌在制备脂肽类生物表面活性剂中的应用。 0016 利用采用上述工程菌生产脂肽类生物表面活性剂， 步骤如下： 0017 1)将工程。
16、菌接入LB液体培养基中， 在35-40、 摇床转速为150-250rpm的条件下培 养10-20小时， 得到基因工程菌菌液； 0018 2)按照1-20的体积百分比将步骤1得到的工程菌菌液接入发酵培养基中， 在35- 40、 摇床转速为150-250rpm的条件下培养20-40小时， 得到含有脂肽的发酵液； 所述发酵 培养基的组成为： 糖类30-100g/L， 无机氮源10-50g/L， 有机氮源0.5-3g/L， KH2PO40.1-1g/ L， Na2HPO412H2O0.5-3g/L， MgSO47H2O0.05-0.3g/L， CaCl20.002-0.01g/L， MnSO4H2O 。
17、0.002-0.01g/L， FeSO47H2O0.002-0.01g/L， pH6.5-7.5。 0019 所述糖类为葡萄糖、 蔗糖、 果糖、 麦芽糖、 淀粉或淀粉水解液。 0020 所述无机氮源为硫酸铵、 氯化铵、 硝酸铵、 硝酸钠或硝酸钾。 0021 所述有机氮源为蛋白胨、 酵母膏、 牛肉膏或大豆粉。 0022 一种本发明的高表达脂肽类生物表面活性剂的工程菌的构建方法： 0023 利用穿梭质粒， 将脂肽载体蛋白YcxA基因ycxA在大肠杆菌中进行ycxA基因过表达 载体的构建， 然后转化至原始菌株中表达， 最终获得脂肽产量提高的基因工程菌。 0024 所述脂肽载体蛋白YcxA基因ycxA。
18、具有SEQIDNO:1所示DNA序列。 说明书 2/6 页 4 CN 103898038 B 4 0025 所述穿梭质粒可为pHT系列质粒。 0026 构建的具体方法如下： 0027 1.以ycxAFB和ycxARS为上下游引物， 以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板， 进行聚合 酶链式反应， 获得ycxA基因序列， 如SEQIDNo:1所示。 所述上游引物ycxAFB的碱基序列如 SEQIDNo:2所示， 所述下游引物ycxARS的碱基序列如SEQIDNo:3所示。 0028 2.将ycxA基因以及枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒分别进行BamHI与SmaI双 酶切， 27-33反应过夜； 然后将。
19、酶切产物纯化， 使用T4DNA连接酶将两种酶切产物进行连 接， 反应温度15-25， 反应时间12-16h， 得到连接产物。 0029 3.将连接产物转化E.coli宿主菌TOP10感受态细胞， 涂布LB平板(含氨苄青霉素)， 挑取抗性克隆进行培养， 提取质粒进行PCR及酶切验证， 得到带有ycxA基因的重组质粒pHT- ycxA。 0030 4.将重组质粒pHT-ycxA使用电转化方法转入枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) THY-7(于2014年3月11日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心， 保藏登记号为CGMCC No.8906)中， 涂布LB平板(含氯霉素)， 挑取抗性。
20、克隆进行培养， 进行PCR验证， 获得转化有 pHT-ycxA质粒的基因工程菌TS589(于2014年3月11日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理 中心， 菌种保藏登记号为CGMCCNo.8907)。 0031 步骤1中所述的枯草芽孢杆菌可以选择枯草芽孢杆菌1012wt(MoBiTec)、 枯草芽孢 杆菌TU2(JournalofMicrobiologyandBiotechnology,2013,23:390-396)、 THY-7(生物 工程学报,2013,29(4):1-6)、 THY-8(化工进展,2013,32:2952-2956)或携带YcxA基因的芽 孢杆菌菌株。 0032 步骤2中。
21、所述的枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒可以选择购自MoBiTec公司的 pHT系列衍生质粒pHT01、 pHT08或pHT10等。 0033 所述宿主菌的原始菌株是具有产脂肽类生物表面活性剂能力的野生菌及其诱变 株、 突变株或基因工程改造菌株， 如枯草芽孢杆菌、 蜡状芽孢杆菌、 假单胞菌或其它产脂肽 的微生物， 优选指枯草芽孢杆菌。 0034 其中原始菌株优选为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)THY-7CGMCCNo.8906。 0035 本发明的优点和有益效果： 本发明采用分子生物学方法和技术， 在产脂肽枯草芽 孢杆菌细胞中扩增并过表达了跨膜蛋白YcxA， 强化了脂肽由细胞内向。
22、细胞外的跨膜运输， 从而显著提高了脂肽的产量。 本发明所得过表达脂肽载体蛋白YcxA的基因工程菌与出发菌 株相比， 表面活性素产量提高97， 可用于脂肽类生物表面活性剂的生产， 具有良好的工业 应用前景， 发酵所得发酵液中脂肽产量平均为1-5g/L。 0036 生物材料保藏说明 0037 分类命名： 枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) 0038 菌株编号： THY-7 0039 保藏机构： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 0040 保藏机构简称： CGMCC 0041 地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号 0042 保藏日期： 2014年3月11日 0043 保藏中。
23、心登记入册编号： CGMCCNo.8906。 说明书 3/6 页 5 CN 103898038 B 5 0044 分类命名： 枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) 0045 菌株编号： TS589 0046 保藏机构： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 0047 保藏机构简称： CGMCC 0048 地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号 0049 保藏日期： 2014年3月11日 0050 保藏中心登记入册编号： CGMCCNo.8907。 附图说明 0051 图1为携带脂肽载体蛋白基因ycxA的枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pHT-ycxA 的构建示意图。 0052 。
24、图2为含有ycxA基因的重组质粒pHT-ycxA的PCR与酶切验证图； 泳道1为DNA分子量 标准， 由上至下第四条带为1.2kb； 泳道2为重组质粒pHT-ycxA使用引物ycxAFB与ycxARS进 行PCR扩增的结果， 可得到约1.2kb的条带； 泳道3为重组质粒pHT-ycxA进行BamHI/SmaI双 酶切的结果， 可得到约8kb+1.2kb的条带； 泳道4为DNA分子量标准， 由上至下第三条带为 7.5kb。 0053 图3为过表达脂肽载体蛋白YcxA基因工程菌TS589的PCR验证图； 泳道1为DNA分子 量标准， 由上至下第四条带为1.2kb； 泳道2为TS589使用引物ycx。
25、AFB与ycxARS进行PCR扩增 的结果， 可得到约1.2kb的条带。 0054 图4为出发菌株THY-7与基因工程菌TS589发酵产物中表面活性素浓度的比较结 果。 具体实施方式 0055 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。 如为特别指明， 实施例中所 用的生化试剂均为市售试剂， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员书中的常规手 段。 0056 实施例1 0057 携带脂肽载体蛋白基因ycxA的枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒的构建 0058 挑取枯草芽孢杆菌1012wt(购自MoBiTec公司)单菌落， 接种于LB液体培养基中， 在 温度为37、 摇床转速为200rpm的条件。
26、下培养16小时， 12000rpm离心5min收集菌体沉淀， 使 用Omega公司的细菌基因组提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌1012wt基因组DNA。 以上述所得枯 草芽孢杆菌1012wt基因组DNA为模板， 使用上游引物ycxAFB(序列如SEQIDNo:2所示)与下 游引物ycxARS(序列如SEQIDNo:3所示)进行PCR基因扩增。 引物由铂尚生物技术(上海)有 限公司合成， 用无菌水溶解， 并稀释至10 M备用。 PCR扩增所用聚合酶、 缓冲液、 dNTP购自 TaKaRa公司。 PCR扩增反应体系为： 说明书 4/6 页 6 CN 103898038 B 6 0059 0060 热循环。
27、条件为943min； 9430s， 5230s， 722min， 35个循环； 72， 10min。 扩 增产物经测序验证为枯草芽孢杆菌ycxA基因(序列如SEQIDNo:1所示)。 扩增产物与枯草 芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pHT08(Biomega公司)进行BamHI/SmaI(TaKaRa公司)双酶 切， 37下反应过夜； 所得酶切产物通过DNA纯化试剂盒(Biomega公司)进行纯化， 然后使用 T4DNA连接酶(TaKaRa公司)在16下连接过夜； 连接产物转化E.coli宿主菌TOP10感受态细 胞(TianGen)， 涂布LB固体平板(含50mg/L卡那霉素)； 挑选抗性克隆， 。
28、小量提取质粒， 得到含 有ycxA基因的重组质粒pHT-ycxA， 构建过程如图1所示。 进行PCR验证与酶切验证(使用上游 引物ycxAFB与下游引物ycxARS可扩增出约1.2kb条带， BamHI/SmaI双酶切可得到约8kb+ 1.2kb条带)， 验证结果如图2所示。 0061 实施例2 0062 过表达脂肽载体蛋白YcxA基因工程菌的构建 0063 将实施例1中构建的携带脂肽载体蛋白基因ycxA的枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭 质粒pHT-ycxA以电穿孔法转化枯草芽孢杆菌THY-7的感受态细胞， 可得过表达脂肽载体蛋 白YcxA的基因工程菌TS589。 其中， 枯草芽孢杆菌THY-7感。
29、受态细胞的制备采用Xue等 (JournalofMicrobiologicalMethods,1999,34:183-191)的方法。 向一个1.5mL离心管 中加入2.5 L重组质粒pHT-ycxA以及50 L枯草芽孢杆菌THY-7感受态细胞， 混匀后加入 0.1cm电转杯， 冰浴30min； 调节电转仪电压为1.25kV， 将电转杯装入电转仪， 按下电击键； 电 击结束后， 向电转杯内加入1mL复苏培养基(配方见Xue等， JournalofMicrobiological Methods,1999,34:183-191)， 重悬细胞， 转入1.5mL离心管， 37、 200rpm震荡培养4。
30、h； 取100 L菌液涂布于LB固体培养基(含5 g/mL氯霉素)， 置入37培养箱中倒置培养12小时， 挑取 单菌落， 使用上游引物ycxAFB与下游引物ycxARS进行PCR验证， 可扩增出约1.2kb条带， 验证 结果如图3所示， 即获得过表达脂肽载体蛋白YcxA基因工程菌TS589。 0064 实施例3 0065 使用基因工程菌TS589生产脂肽类表面活性剂表面活性素 0066 将实施例2所得过表达脂肽载体蛋白ycxA基因工程菌TS589接种于LB液体培养基 (含5 g/mL氯霉素)中， 37、 200rpm下培养16小时， 以5的比例接入发酵培养基中， 37、 200rpm下培养4h。
31、， 加入IPTG(终浓度1mM)， 继续培养至24h， 即得含脂肽的发酵液。 取步骤1所 得发酵液100 L， 加入900 L去离子水， 混匀， 经0.22 m滤膜过滤， 上样进行HPLC分析。 采用 ShimadzuLC20A色谱系统， 色谱柱为ODS-SP2504.6mm(GLSciences)， 流动相为乙腈: 说明书 5/6 页 7 CN 103898038 B 7 水:三氟乙酸93:7:0.1， 流速0.8mL/min， 上样量20 L。 HPLC分析结果表明， 出发菌株THY-7 表面活性素的产量为0.515g/L， 过表达脂肽载体蛋白ycxA的基因工程菌TS589表面活性素 的产量为1.014g/L， 是出发菌株的1.97倍(如图4)。 说明书 6/6 页 8 CN 103898038 B 8 0001 序列表 1/2 页 9 CN 103898038 B 9 0002 序列表 2/2 页 10 CN 103898038 B 10 图1 图2 说明书附图 1/2 页 11 CN 103898038 B 11 图3 图4 说明书附图 2/2 页 12 CN 103898038 B 12 。