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1、10申请公布号CN104122240A43申请公布日20141029CN104122240A21申请号201410203032122申请日20140514G01N21/64200601C09K11/06200601C12Q1/18200601C12R1/445200601C12R1/385200601C12R1/1920060171申请人中国科学院海洋研究所地址266071山东省青岛市南海路7号72发明人万逸张盾74专利代理机构沈阳科苑专利商标代理有限公司21002代理人周秀梅李颖54发明名称一种多功能的基于活性功能小分子标记半导体聚合物信号系统和应用57摘要本发明涉及生物化学物质的检测和分析。
2、领域，具体的说是一种基于活性功能小分子标记半导体聚合物信号系统和应用。信号系统为结合有特异性的功能小分子的半导体聚合物。所述多功能的基于活性功能小分子标记半导体聚合物信号系统作为信号探针用于生物分析领域中对生物分子进行检测。本发明利用活性功能小分子标记半导体聚合物信号系统来快速检测和分析生物分子，用其检测检测控制生物分子浓度的变化，能够快速检测对生物分子、微生物和细胞。相对于传统的酶联免疫反应吸附的测量，利用多巴胺放大信号系统来快速检测和分析生物分子具有显著的特异性，同时准确性高。具有稳定性好、灵敏度高，不容易失活，价格便宜等优势。51INTCL权利要求书1页说明书7页附图13页19中华人民共。
3、和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图13页10申请公布号CN104122240ACN104122240A1/1页21一种多功能的基于活性功能小分子标记半导体聚合物信号系统，其特征在于信号系统为结合有特异性的功能小分子的半导体聚合物。2按权利要求1所述的多功能的基于活性功能小分子标记半导体聚合物信号系统，其特征在于所述半导体聚合物为带有氨基末端或羧基末端的半导体聚合物。3按权利要求1所述的多功能的基于活性功能小分子标记半导体聚合物信号系统，其特征在于所述特异性的功能小分子为抗生素、寡糖或D型氨基酸。4按权利要求3所述的多功能的基于活性功能小分子标记半导体聚合物信号系统，。
4、其特征在于所述抗生素分子为万古霉素、多粘菌素、达托霉素或枯草杆菌肽。5按权利要求3所述的多功能的基于活性功能小分子标记半导体聚合物信号系统，其特征在于所述寡糖分子为棉籽糖、水苏糖、麦芽寡糖或大豆寡糖。6按权利要求3所述的多功能的基于活性功能小分子标记半导体聚合物信号系统，其特征在于所述D型氨基酸分子为丙氨酸或谷氨酸。7一种权利要求1所述多功能的基于活性功能小分子标记半导体聚合物信号系统的应用，其特征在于所述多功能的基于活性功能小分子标记半导体聚合物信号系统作为信号探针用于生物分析领域中对生物分子进行检测。权利要求书CN104122240A1/7页3一种多功能的基于活性功能小分子标记半导体聚合物。
5、信号系统和应用技术领域0001本发明涉及生物化学物质的检测和分析领域，具体的说是一种基于活性功能小分子标记半导体聚合物信号系统和应用。背景技术0002在环境安全检测和人体健康的监控中，许多生物靶点分子的含量非常低。很多生物信号分子、有害微生物或肿瘤细胞在初期浓度非常低，需要对靶点物质进行信号放大才可以检测分析。目前，研究者们已经发现了集中几种信号放大的技术来检测低丰度靶点，包括银增加强反应、酪氨酸信号放大、酶金属矿化和滚环放大报告系统。银增强反应基于纳米金催化沉淀银，从而来检测核酸、蛋白质和微生物等有害物质WAN,Y,WANG,Y,WU,J,ZHANG,D,2011BANALYTICALCHE。
6、MISTRY833,648653；TATON,TA,MIRKIN,CA,LETSINGER,RL,2000SCIENCE2895485,17571760。相对银增强的技术来说，替代的方案用过氧化物酶来催化银的沉淀，这种方法叫酶矿化技术,R,POWELL,RD,HAINFELD,JF,FRITZSCHE,W,2005NANOLETTERS57,14751482。最近出现一种超灵敏的技术，结合氢化酶标记的酶联免疫反应来控制纳米金生成过程，产生肉眼可见的信号DELARICA,R,STEVENS,MM,2012NATURENANOTECHNOLOGYDOI101038/NNANO2012186，来分析。
7、生物靶点物质。酪氨酸信号放大系统结合生物沉淀和荧光标记来增强标准免疫反应的灵敏度CLUTTER,MR,HEFFNER,GC,KRUTZIK,PO,SACHEN,KL,NOLAN,GP,2010CYTOMETRYPARTA77A11,10201031。滚环放大技术是一种恒温核酸扩增方法，在RCA反应中，DNA目标链可沿环形探针顶替扩增，实现高灵敏度的检测；同时环形探针的链接成环对DNA单碱基错配有很高的特异性，适合单核苷酸突变的分析检测。0003聚合物信号标记也得到了广泛的应用和发展。比如，CHAN等报道一种聚合物与半导体量子点杂合的信号标记物，再用亲和素修饰得到相应的标记物来标记肿瘤细胞CHA。
8、N,YH；YE,F；GALLINA,ME；ZHANG,X；JIN,Y；WU,IC；CHIU,DT,HYBRIDSEMICONDUCTINGPOLYMERDOTQUANTUMDOTWITHNARROWBANDEMISSION,NEARINFRAREDFLUORESCENCE,ANDHIGHBRIGHTNESSJOURNALOFTHEAMERICANCHEMICALSOCIETY2012,134,73097312。相对于无机半导体量子点来说，水溶性聚合物量子点具有便于功能化，化学淬灭弱。相对于有机小分子染料来说，水溶性聚合物量子点荧光性能问题，便于长期的实验。发明内容0004本发明目的在于提供一种。
9、多功能的基于活性功能小分子标记半导体聚合物信号系统和应用。0005为实现上述目的，本发明采用的技术方案为说明书CN104122240A2/7页40006一种多功能的基于活性功能小分子标记半导体聚合物信号系统，信号系统为结合有特异性的功能小分子的半导体聚合物。0007所述半导体聚合物为带有氨基末端或羧基末端的半导体聚合物。0008所述特异性的功能小分子为抗生素、寡糖或D型氨基酸。0009所述抗生素分子为万古霉素、多粘菌素、达托霉素或枯草杆菌肽。0010所述寡糖分子为棉籽糖、水苏糖、麦芽寡糖或大豆寡糖。0011所述D型氨基酸分子为丙氨酸或谷氨酸。0012一种多功能的基于活性功能小分子标记半导体聚合。
10、物信号系统的应用，所述多功能的基于活性功能小分子标记半导体聚合物信号系统作为信号探针用于生物分析领域中对生物分子进行检测。0013本发明所具有的优点0014本发明利用活性小分子抗生素、棉籽糖、水苏糖和D型氨基酸标记的半导体聚合物量子点系统来快速检测和分析生物分子,比如蛋白因子、核酸、微生物、病毒等，用其检测检测控制生物分子浓度的变化，能够快速检测对生物分子、微生物和细胞。相对于传统的酶联免疫反应吸附的测量，利用信号标记系统来快速检测和分析生物分子具有显著的特异性，同时准确性高。利用活性功能小分子标记信号系统来快速检测和分析生物分子，具有稳定性好、灵敏度高，不容易失活，价格便宜等优势。附图说明0。
11、015图1为本发明实施例提供的27DIBROMO9,9BIS3TERTBUTYLPROPANOATEFLUORINEPFBTA和聚合物PFBTB的1HNMR数据0016图2为本发明实施例提供的聚合物PFBT带有羧基B和不带羧基A的FTIR谱图。0017图3为本发明实施例提供的聚合物量子点的UVVIS谱图A和荧光谱图B。0018图4为本发明实施例提供的聚合物量子点PDOTSA、VANPDOTSB和PBPDOTSC的ZETA电势。0019图5为本发明实施例提供的万古霉素A修饰和多粘菌素B修饰的聚合物量子点PDOTS的透射电子显微镜左和动力学光散射仪右0020图6为本发明实施例提供的活性功能分子特异。
12、性识别微生物示意图0021图7为本发明实施例提供的金黄色葡萄球菌A,B和铜绿假单胞菌C,D标记VANPDOTSA,C或PBPDOTSB,D的荧光显微镜照片。0022图8为本发明实施例提供的金黄色葡萄球菌A,B和铜绿假单胞菌C,D标记VANPDOTSA,C或PBPDOTSB,D的场发射扫描电镜照片0023图9为本发明实施例提供的用PBPDOTSA和VANPDOTSB分别检测金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，及八种不同微生物金黄色葡萄球菌SAUREUS,铜绿假单胞菌PAERUGINOSA,大肠杆菌ECOLI,费氏弧菌VSCHERI,谷草芽孢杆菌BCEREUS,坚强芽孢杆菌BRMUS,爱德华菌ETARD。
13、A和鳗弧菌VALGINOLYTICUS。0024图10为本发明实施例提供的抗生素分子和抗生素分子标记的聚合物量子点的竞争性实验。说明书CN104122240A3/7页50025图11为本发明实施例提供的在光照条件下，VANPDOTSA和PBPDOTSB对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抗菌性能。0026图12为本发明实施例提供的在光照条件下，VANPDOTSA，25MOLL1和PBPDOTSB，25MOLL1对八种微生物的抗菌性能。0027图13为本发明实施例提供的在光照条件下，低浓度VANPDOTSA和PBPDOTSB对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抗菌性能。具体实施方式0028下面通过实施例。
14、对本发明做进一步说明。0029实施例10030万古霉素功能化的半导体聚合物量子点VANPDOTS对微生物的检测、成像和杀菌功能0031VANPDOTS的制备01ML聚乙二醇5和01ML4羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲液1MOLL1先后加入到5ML半导体聚合物量子点溶液PFBT中。而后再加入05ML万古霉素5MGML1，搅拌混合体系30MIN。然后，再将新鲜配置的01ML的1乙基3二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐EDC5MGML1加入混合液中搅拌2小时。反应的混合物在透析袋截留分子量300中透析2天，移除未交联的分子。再加入50LTRITONX100聚乙二醇辛基苯基醚20WT，即得到万古霉素功能化。
15、的半导体聚合物参见表1。0032微生物标记检测金黄色葡萄球菌用PBS缓冲液清洗两次。再与VANPDOTS5GML1室温下培育05小时。过量未结合的VANPDOTS用PBS清洗两次。用荧光光谱仪测量标记的荧光强度。金黄色葡萄球菌的检测线为15103CFUML1,线性范围为45104CFUML145106CFUML1。0033光催化抗菌性能VANPDOTS与革兰氏阳性微生物在室温下黑暗中培育20MIN。然后500W白光照射20MIN。用PBS缓冲液清洗微生物细胞。用平板计数法测量细菌的存活率见图11，该材料的杀菌效率可达980034表100350036说明书CN104122240A4/7页6003。
16、7实施例20038多粘菌素功能化的半导体聚合物量子点PBPDOTS对微生物的检测、成像和杀菌功能0039PBPDOTS的制备01ML聚乙二醇5和01MLHEPES缓冲液1MOLL1先后加入到5MLPDOTS溶液中。05ML多粘菌素5MGML1接着加入，搅拌混合体系30MIN。然后，01ML新鲜配置的1乙基3二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐EDC5MGML1加入混合液中搅拌2小时。反应的混合物在透析袋截留分子量300中透析2天，移除未交联的分子。再加入50LTRITONX100聚乙二醇辛基苯基醚20WT，即得到多粘菌素功能化的半导体聚合物参见表1。0040微生物标记检测铜绿假单胞菌用PBS缓冲液清。
17、洗两次。再与PBPDOTS5GML1室温下培育05小时。过量未结合的PBPDOTS用PBS清洗两次。用荧光光谱仪测量标记的荧光强度图9。铜绿假单胞菌的检测线为25104CFUML1,线性范围为27104CFUML127106CFUML1。0041光催化抗菌性能PBPDOTS与铜绿假单胞菌在室温下黑暗中培育20MIN。然后500W白光照射20MIN。用PBS缓冲液清洗微生物细胞。用平板计数法测量细菌的存活率图11。这种材料的杀菌效率为93。0042实施例30043棉籽糖功能化的半导体聚合物量子点RFPDOTS对微生物的检测、成像和杀菌功能0044RFPDOTS的制备01ML聚乙二醇5和01MLH。
18、EPES缓冲液1MOLL1先后加入到5MLPDOTS溶液中。05MLRF5MGML1接着加入，搅拌混合体系30MIN。然后，01ML新鲜配置的1乙基3二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐EDC5MGML1加入混合液中搅拌2小时。反应的混合物在透析袋截留分子量300中透析2天，移除未交联的分子。再加入50LTRITONX10020WT。0045微生物标记检测大肠杆菌用PBS缓冲液清洗两次。再与RFPDOTS5GML1室温下培育05小时。过量未结合的RFPDOTS用PBS清洗两次。用荧光光谱仪测量标记的荧光强度。大肠杆菌的检测线为10103CFUML1,线性范围为25104CFUML125106CFUM。
19、L1。0046光催化抗菌性能RFPDOTS与大肠杆菌在室温下黑暗中培育20MIN。然后500W白光照射20MIN。用PBS缓冲液清洗微生物细胞。用平板计数法测量细菌的存活率。这种材料的杀菌效率可达95。0047实施例40048水苏糖功能化的半导体聚合物量子点SSPDOTS对微生物的检测、成像和杀菌功能0049SSPDOTS的制备01ML聚乙二醇5和01MLHEPES缓冲液1MOLL1先后加入到5MLPDOTS溶液中。05MLRF5MGML1接着加入，搅拌混合体系30MIN。然后，01ML新鲜配置的1乙基3二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐EDC5MGML1加入混合液中搅拌2小时。反应的混合物在透析。
20、袋截留分子量300中透析2天，移除未交联的分子。再加入50LTRITONX10020WT。说明书CN104122240A5/7页70050微生物标记检测金黄色葡萄球菌用PBS缓冲液清洗两次。再与SSPDOTS5GML1室温下培育05小时。过量未结合的SSPDOTS用PBS清洗两次。用荧光光谱仪测量标记的荧光强度。金黄色葡萄球菌的检测线为30103CFUML1,线性范围为75104CFUML175106CFUML1。0051光催化抗菌性能SSPDOTS与金黄色葡萄球菌在室温下黑暗中培育20MIN。然后500W白光照射20MIN。用PBS缓冲液清洗微生物细胞。用平板计数法测量细菌的存活率。这种材料。
21、杀菌效率可达91。0052实施例50053D型谷氨酸功能化的半导体聚合物量子点DGPDOTS对微生物的检测、成像和杀菌功能0054DGPDOTS的制备01ML聚乙二醇5和01MLHEPES缓冲液1MOLL1先后加入到5MLPDOTS溶液中。05MLRF5MGML1接着加入，搅拌混合体系30MIN。然后，01ML新鲜配置的1乙基3二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐EDC5MGML1加入混合液中搅拌2小时。反应的混合物在透析袋截留分子量300中透析2天，移除未交联的分子。再加入50LTRITONX10020WT。0055微生物标记检测大肠杆菌用PBS缓冲液清洗两次。再与DGPDOTS5GML1室温下培。
22、育05小时。过量未结合的DGPDOTS用PBS清洗两次。用荧光光谱仪测量标记的荧光强度。大肠杆菌的检测线为10103CFUML1,线性范围为15104CFUML115106CFUML1。0056光催化抗菌性能DGPDOTS与微生物在室温下黑暗中培育20MIN。然后500W白光照射20MIN。用PBS缓冲液清洗微生物细胞。用平板计数法测量细菌的存活率。这种材料的杀菌效率可达89。0057实施例60058D型丙氨酸功能化的半导体聚合物量子点DBPDOTS对微生物的检测、成像和杀菌功能0059DBPDOTS的制备01ML聚乙二醇5和01MLHEPES缓冲液1MOLL1先后加入到5MLPDOTS溶液中。
23、。05MLRF5MGML1接着加入，搅拌混合体系30MIN。然后，01ML新鲜配置的1乙基3二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐EDC5MGML1加入混合液中搅拌2小时。反应的混合物在透析袋截留分子量300中透析2天，移除未交联的分子。再加入50LTRITONX10020WT。0060微生物标记检测金黄色葡萄球菌用PBS缓冲液清洗两次。再与DBPDOTS5GML1室温下培育05小时。过量未结合的DBPDOTS用PBS清洗两次。用荧光光谱仪测量标记的荧光强度。金黄色葡萄球菌的检测线为30103CFUML1,线性范围为75104CFUML175106CFUML1。0061光催化抗菌性能DBPDOTS与金。
24、黄色葡萄球菌在室温下黑暗中培育20MIN。然后500W白光照射20MIN。用PBS缓冲液清洗微生物细胞。用平板计数法测量细菌的存活率。这种材料的杀菌效率为89。0062实施例70063达托霉素功能化的半导体聚合物量子点DTPDOTS对微生物的检测、成像和杀说明书CN104122240A6/7页8菌功能0064DTPDOTS的制备01ML聚乙二醇5和01MLHEPES缓冲液1MOLL1先后加入到5MLPDOTS溶液中。05ML万古霉素5MGML1接着加入，搅拌混合体系30MIN。然后，01ML新鲜配置的1乙基3二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐EDC5MGML1加入混合液中搅拌2小时。反应的混合物在。
25、透析袋截留分子量300中透析2天，移除未交联的分子。再加入50LTRITONX10020WT。0065微生物标记检测铜绿假单胞菌用PBS缓冲液清洗两次。再与DTPDOTS5GML1室温下培育05小时。过量未结合的DTPDOTS用PBS清洗两次。用荧光光谱仪测量标记的荧光强度。铜绿假单胞菌的检测线为20103CFUML1,线性范围为30104CFUML130106CFUML1。0066光催化抗菌性能DTPDOTS与铜绿假单胞菌在室温下黑暗中培育20MIN。然后500W白光照射20MIN。用PBS缓冲液清洗微生物细胞。用平板计数法测量细菌的存活率。这种材料的杀菌效率为91。0067实施例80068。
26、枯草杆菌肽功能化的半导体聚合物量子点GCPDOTS对微生物的检测、成像和杀菌功能0069GCPDOTS的制备01ML聚乙二醇5和01MLHEPES缓冲液1MOLL1先后加入到5MLPDOTS溶液中。05ML万古霉素5MGML1接着加入，搅拌混合体系30MIN。然后，01ML新鲜配置的1乙基3二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐EDC5MGML1加入混合液中搅拌2小时。反应的混合物在透析袋截留分子量300中透析2天，移除未交联的分子。再加入50LTRITONX10020WT。0070微生物标记检测大肠杆菌用PBS缓冲液清洗两次。再与GCPDOTS5GML1室温下培育05小时。过量未结合的GCPDOTS。
27、用PBS清洗两次。用荧光光谱仪测量标记的荧光强度。大肠杆菌的检测线为20103CFUML1,线性范围为30104CFUML130106CFUML1。0071光催化抗菌性能GCPDOTS与微生物在室温下黑暗中培育20MIN。然后500W白光照射20MIN。用PBS缓冲液清洗微生物细胞。用平板计数法测量细菌的存活率。这种材料的杀菌效率为97。0072实施例90073麦芽寡糖功能化的半导体聚合物量子点MYPDOTS对微生物的检测、成像和杀菌功能0074MYPDOTS的制备01ML聚乙二醇5和01MLHEPES缓冲液1MOLL1先后加入到5MLPDOTS溶液中。05ML万古霉素5MGML1接着加入，搅。
28、拌混合体系30MIN。然后，01ML新鲜配置的1乙基3二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐EDC5MGML1加入混合液中搅拌2小时。反应的混合物在透析袋截留分子量300中透析2天，移除未交联的分子。再加入50LTRITONX10020WT。0075微生物标记检测金黄色葡萄球菌用PBS缓冲液清洗两次。再与MYPDOTS5GML1室温下培育05小时。过量未结合的MYPDOTS用PBS清洗两次。用荧光光谱仪测量标记的荧光强度。金黄色葡萄球菌的检测线为10103CFUML1,线性范围为30104CFU说明书CN104122240A7/7页9ML130106CFUML1。0076光催化抗菌性能MYPDOTS与。
29、金黄色葡萄球菌在室温下黑暗中培育20MIN。然后500W白光照射20MIN。用PBS缓冲液清洗微生物细胞。用平板计数法测量细菌的存活率。这种材料的杀菌效率为89。0077实施例100078大豆寡糖功能化的半导体聚合物量子点DDPDOTS对微生物的检测、成像和杀菌功能0079DDPDOTS的制备01ML聚乙二醇5和01MLHEPES缓冲液1MOLL1先后加入到5MLPDOTS溶液中。05ML万古霉素5MGML1接着加入，搅拌混合体系30MIN。然后，01ML新鲜配置的1乙基3二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐EDC5MGML1加入混合液中搅拌2小时。反应的混合物在透析袋截留分子量300中透析2天，移。
30、除未交联的分子。再加入50LTRITONX10020WT。0080微生物标记检测微生物用PBS缓冲液清洗两次。再与DDPDOTS5GML1室温下培育05小时。过量未结合的DDPDOTS用PBS清洗两次。用荧光光谱仪测量标记的荧光强度。金黄色葡萄球菌的检测线为10103CFUML1,线性范围为30104CFUML130106CFUML1。0081光催化抗菌性能DDPDOTS与微生物在室温下黑暗中培育20MIN。然后500W白光照射20MIN。用PBS缓冲液清洗微生物细胞。用平板计数法测量细菌的存活率。这种材料的杀菌效率为91。说明书CN104122240A1/13页10图1说明书附图CN1041。
31、22240A102/13页11图2说明书附图CN104122240A113/13页12图3说明书附图CN104122240A124/13页13说明书附图CN104122240A135/13页14图4说明书附图CN104122240A146/13页15图5说明书附图CN104122240A157/13页16图6说明书附图CN104122240A168/13页17图7图8说明书附图CN104122240A179/13页18图9说明书附图CN104122240A1810/13页19图10说明书附图CN104122240A1911/13页20图11说明书附图CN104122240A2012/13页21图12说明书附图CN104122240A2113/13页22图13说明书附图CN104122240A22。