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1、(10)申请公布号 CN 103451281 A (43)申请公布日 2013.12.18 CN 103451281 A *CN103451281A* (21)申请号 201310361163.8 (22)申请日 2013.08.19 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 苏州市外来有害生物防控技术中心 地址 215121 江苏省苏州市苏州工业园区胜 浦路 288 号国检大厅 (72)发明人 詹国辉 陈景云 郑斯竹 高渊 陈云芳 邓海娟 赵毓郎 葛华林 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人 邱兴天 (54) 发明名称 一种快速检测美。
2、国白蛾的试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了一种快速检测美国白蛾的 试剂盒， 至少包括 1 次用量以上的特异性引物 COI01/02 或 SpmR01/02 试 剂 ； 所 述 的 特 异 性 引 物 COI01/02 与 SpmR01/02 序 列 如 下 ： COI01 序列 ： 5-CAGGAACTGGATGAACA-3， COI02 序 列 ： 5-CCTACTGCTCATACGAA-3， SpmR01 序列 ： 5-ACGCTGTTGTCCGTATTT-3， SpmR02 序列 ： 5-CTGATTTCTTCGGTGTTG-3。本发明的试剂盒是 一种高效、 准确、 便捷的美国白蛾分子。
3、检测技术， 可在分子水平将美国白蛾与灯蛾科其他种类进行 区分， 能满足使用需求， 具有很好的实用性， 能产 生较好的经济效益和社会效应。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103451281 A CN 103451281 A *CN103451281A* 1/1 页 2 1. 一种快速检测美国白蛾的试剂盒， 其特征在于， 至少包括 1 次用量以上的特异性引 物 COI01 /02 或 SpmR01/02 。
4、试剂 ； 所述的特异性引物 COI01 /02 与 SpmR01/02 序列如下 ： COI01 序列 ： 5-CAGGAACTGGATGAACA-3， COI02 序列 ： 5-CCTACTGCTCATACGAA-3， SpmR01 序列 ： 5-ACGCTGTTGTCCGTATTT-3， SpmR02 序列 ： 5-CTGATTTCTTCGGTGTTG-3。 2.根据权利要求1所述的快速检测美国白蛾的试剂盒， 其特征在于， 由1次用量以上的 下列试剂组成 ： Taq buffer， MgCl2， dNTP mix， Taq DNA 聚合酶， 特异性引物 COI01 /02 或 SpmR01。
5、/02， ddH2O。 3. 权利要求 1 所述的快速检测美国白蛾的试剂盒的检测方法， 其特征在于， 包括以下 步骤 ： 1） DNA 的制备 ： 采用 GenMagBio 动物细胞组织 / 细胞基因组 DNA 磁珠提取试剂盒提取 待检测样品和美国白蛾标准对照样的 DNA ； 2） PCR 反应体系与反应条件 50L 反应体系组成 ： 5L 10Taq buffer、 2 mmol/L MgCl2、 200 mol/L dNTP mix、 2U Taq DNA 聚合酶、 3L DNA模板、 特异性引物COI01 /02或SpmR01/02各1 mol/L， ddH2O补 齐 ； 反应程序为 ：。
6、 94预变性 2 min ； 94变性 1 min、 52复性 30 s， 72延伸 30 s， 进行 30 个循环 ； 72延伸 5 min ； 4保存 ； 3） PCR 结果判定 混合 8 LPCR 产物与 2 L 6Glycerol DNA loading Buffer 上样， 以 DNA Marker DL100为分子量标记， 室温下恒压120 V， 用3 %琼脂糖凝胶电泳45 min， 0.5% mol/L的EB 染色， 凝胶成像系统检测样品， 拍照 ； 照片显示美国白蛾标准对照样有清晰的扩增条带， 待 检测样品也具有相同条带即为美国白蛾， 否则不是美国白蛾。 4. 根据权利要求 3。
7、 所述的快速检测美国白蛾的试剂盒的检测方法， 其特征在于 ： 步骤 1） 中， DNA 提取的具体过程如下 ： 直接剪取供试标本足和胸部 30mg 放入 2mL 试管， 无水乙醇浸泡保存标本用无菌蒸馏 水冲洗浸泡 45 次， 弃水 ； 干标本无菌蒸馏水浸泡 3h 后吸干水分 ； 置于 2mL 离心管， MM400 球磨仪中震荡碾磨 （30 次 /s） 30s， 加入 180L Lysis Buffer、 20L Proteinase K， 震荡 混匀， 常温过夜， 55震荡温浴 3-5h， 12000rpm 离心 10min， 取上清， 加入 200L Binding Buffer 和 200。
8、L 无水乙醇， 充分混匀， 加入 20L 磁珠， 轻柔颠倒混匀 10min ； 离心管置于 磁力架， 吸弃管内液体， 保留磁珠， Wash Buffer 500uL 颠倒混匀 2min 置于磁力架， 弃去 管内液体， Wash Buffer 同样洗涤两次， 离心管仍置于磁力架上， 缓慢加入 Wash Buffer ， 1min后移走管内液体 ； 加入20L Elution Buffer， 55水浴10min洗脱磁珠上吸附的 DNA， 4储存备用。 权 利 要 求 书 CN 103451281 A 2 1/4 页 3 一种快速检测美国白蛾的试剂盒 技术领域 0001 本发明属于美国白蛾检测技术领。
9、域， 具体涉及一种快速检测美国白蛾的试剂盒。 背景技术 0002 美国白蛾 Hyphantria cunea (Drury) 又名秋幕毛虫、 秋幕蛾， 属鳞翅目 （Lepidortera） 、 灯蛾科 （Arctiidae） 、 灯蛾亚科 （Arctiinae） ， 是世界著名的检疫性有害生 物。原产于北美洲， 分布于美国、 加拿大、 墨西哥等地区， 1940 年传入欧洲， 1945 年传入日 本， 1958 年传入韩国， 1979 年传入我国辽宁丹东。目前， 国内公布的疫区有北京、 天津、 河 北、 山东、 辽宁、 陕西、 江苏等省市。国务院办公厅曾多次下发文件， 要求大力加强美国白蛾 查防。
10、治理工作。2007 年美国白蛾被纳入 中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录 。 0003 在美国， 美国白蛾有 2 个种， 分别是黑头种和红头种， 而我国主要分布的是黑头 型。由于该虫繁殖力强大， 传播途径广泛， 寄主种类繁多， 食性庞杂， 食量巨大， 生态适应性 强， 危害程度严重， 是我国农、 林、 果、 蔬业的重要害虫。据赵铁珍等人于 2004 年研究评估全 国美国白蛾疫区的非经济损失 （环境功能损失、 景观美学损失、 生产生活损失、 心理影响损 失、 生态系内部失衡损失、 区域声誉损失） 合计为 140.35 亿元。所以说， 准确的种类鉴定是 防止美国白蛾侵入非疫区， 保护非疫区生。
11、态环境的重要手段。 0004 美国白蛾成幼虫与灯蛾科其他种类在形态上极难区分， 尤其是口岸检疫时截获美 国白蛾的卵或不完整的虫体， 利用传统的形态分类更难做出快速准确的鉴定。因此需要开 发出精准的美国白蛾检测方法。 发明内容 0005 发明目的 ： 针对现有技术中存在的不足， 本发明的目的是提供一种快速检测美国 白蛾的试剂盒， 使其具有准确稳定、 操作方便、 特异性强等特点， 满足使用需求。 0006 技术方案 ： 为了实现上述发明目的， 本发明采用的技术方案如下 ： 一种快速检测美国白蛾的试剂盒， 至少包括 1 次用量以上的特异性引物 COI01 /02 或 SpmR01/02 试剂 ； 所。
12、述的特异性引物 COI01 /02 与 SpmR01/02 序列如下 ： COI01 序列 ： 5-CAGGAACTGGATGAACA-3， COI02 序列 ： 5-CCTACTGCTCATACGAA-3， SpmR01 序列 ： 5-ACGCTGTTGTCCGTATTT-3， SpmR02 序列 ： 5-CTGATTTCTTCGGTGTTG-3。 0007 所述的快速检测美国白蛾的试剂盒， 由 1 次用量以上的下列试剂组成 ： Taq buffer， MgCl2， dNTP mix， Taq DNA 聚合酶， 特异性引物 COI01 /02 或 SpmR01/02， ddH2O。 0008。
13、 所述的快速检测美国白蛾的试剂盒的检测方法， 包括以下步骤 ： 1） DNA 的制备 ： 采用 GenMagBio 动物细胞组织 / 细胞基因组 DNA 磁珠提取试剂盒提取 待检测样品和美国白蛾标准对照样的 DNA ； 说 明 书 CN 103451281 A 3 2/4 页 4 2） PCR 反应体系与反应条件 50L 反应体系组成 ： 5L 10Taq buffer、 2 mmol/L MgCl2、 200 mol/L dNTP mix、 2U Taq DNA 聚合酶、 3L DNA 模板、 特异性引物 COI01 /02 和 / 或 SpmR01/02 各 1 mol/L， ddH2O 。
14、补齐 ； 反应程序为 ： 94预变性 2 min ； 94变性 1 min、 52复性 30 s， 72延伸 30 s， 进行 30 个循环 ； 72延伸 5 min ； 4保存 ； 3） PCR 结果判定 混合 8 LPCR 产物与 2 L 6Glycerol DNA loading Buffer 上样， 以 DNA Marker DL100为分子量标记， 室温下恒压120 V， 用3 %琼脂糖凝胶电泳45 min， 0.5% mol/L的EB 染色， 凝胶成像系统检测样品， 拍照 ； 照片显示美国白蛾标准对照样有清晰的扩增条带， 待 检测样品也具有相同条带即为美国白蛾， 否则不是美国白蛾。。
15、 0009 步骤 1） 中， DNA 提取的具体过程如下 ： 直接剪取供试标本足和胸部 30mg 放入 2mL 试管， 无水乙醇浸泡保存标本用无菌蒸馏 水冲洗浸泡 45 次， 弃水 ； 干标本无菌蒸馏水浸泡 3h 后吸干水分。置于 2mL 离心管， MM400 球磨仪中震荡碾磨 （30 次 /s） 30s， 加入 180L Lysis Buffer、 20L Proteinase K， 震荡 混匀， 常温过夜， 55震荡温浴 3-5h， 12000rpm 离心 10min， 取上清， 加入 200L Binding Buffer 和 200L 无水乙醇， 充分混匀， 加入 20L 磁珠， 轻柔。
16、颠倒混匀 10min。离心管置于 磁力架， 吸弃管内液体， 保留磁珠， Wash Buffer 500uL 颠倒混匀 2min 置于磁力架， 弃去 管内液体， Wash Buffer 同样洗涤两次， 离心管仍置于磁力架上， 缓慢加入 Wash Buffer ， 1min 后移走管内液体。加入 20L Elution Buffer， 55水浴 10min 洗脱磁珠上吸附 的 DNA， 4储存备用。 0010 本发明的快速检测美国白蛾的方法， 普通 PCR 检测方法以昆虫线粒 DNA 基因和其 它已公布的基因片段为模板， 设计并筛选出灵敏度高， 特异性强的美国白蛾特异 PCR 扩增 引物。开发出高。
17、效、 准确、 便捷的美国白蛾分子检测技术。该技术可在分子水平将美国白蛾 与灯蛾科其他种类进行区分。 0011 有益效果 ： 与现有技术相比， 本发明的快速检测美国白蛾的试剂盒， 具有准确稳 定、 操作方便、 特异性强等特点， 能满足使用需求， 具有很好的实用性， 能产生较好的经济效 益和社会效应。 附图说明 0012 图 1 是特异引物 COI01 /02 对样本 1-16 的扩增效果 ； 图 2 是特异引物 SpmR01/02 对样本 1-16 的扩增效果。 具体实施方式 0013 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。 0014 实施例 1 快速检测美国白蛾的方法的试剂盒， 至少包括 。
18、1 次用量以上的特异性引物 COI01 /02 或 SpmR01/02 试剂。在使用时， 可以另外补充购买 ： Taq buffer， MgCl2， dNTP mix， Taq DNA 聚合酶， ddH2O， 一起配合使用即可。其中， ddH2O 可以自己制备。 说 明 书 CN 103451281 A 4 3/4 页 5 0015 同时， 该快速检测美国白蛾的方法的试剂盒， 可以直接配齐所有溶液， 具体由 1 次 用量以上的下列试剂组成 ： 10Taq buffer， 2 mmol/L MgCl2， 200 mol/L dNTP mix， Taq DNA 聚合酶， 特异性引物 COI01 /。
19、02 或 SpmR01/02， ddH2O。 0016 其中， 特异性引物 COI01 /02 与 SpmR01/02 序列如下 ： COI01 序列 ： 5-CAGGAACTGGATGAACA-3， COI02 序列 ： 5-CCTACTGCTCATACGAA-3， SpmR01 序列 ： 5-ACGCTGTTGTCCGTATTT-3， SpmR02 序列 ： 5-CTGATTTCTTCGGTGTTG-3。 0017 在选取溶液浓度时， 根据需要进行配备即可， 在用量配备上， 优选 10 次以上用量。 0018 该特异性引物 COI01 /02 与 SpmR01/02， 以美国白蛾基因片段为。
20、模板， 综合考虑引 物的长度、 GC 含量、 目标基因大小和 Tm 值进行设计的， 这 2 对引物不受供试昆虫虫态限制， 可准确鉴定美国白蛾的成幼虫、 蛹、 卵及残体。 0019 使用该试剂盒对待测样品直接进行检测， 具体如下 ： 以包括美国白蛾在内的 16 种灯蛾科昆虫作为供试标本， 这 16 种灯蛾科昆虫成幼虫在 外部形态上都与美国白蛾难以区分。供试标本详见表 1。 0020 表 1 供试标本 1） DNA 的制备 ： DNA 的提取采用 GenMagBio 动物细胞组织 / 细胞基因组 DNA 磁珠提取 试剂盒进行提取。具体过程如下 ： 直接剪取供试标本足和胸部 30mg 放入 2mL 。
21、试管， 无水乙醇浸泡保存标本用无菌蒸馏 说 明 书 CN 103451281 A 5 4/4 页 6 水冲洗浸泡 45 次， 弃水 ； 干标本无菌蒸馏水浸泡 3h 后吸干水分。置于 2mL 离心管， MM400 球磨仪中震荡碾磨 （30 次 /s） 30s， 加入 180L Lysis Buffer、 20L Proteinase K， 震荡 混匀， 常温过夜， 55震荡温浴 3-5h， 12000rpm 离心 10min， 取上清， 加入 200L Binding Buffer 和 200L 无水乙醇， 充分混匀， 加入 20L 磁珠， 轻柔颠倒混匀 10min。离心管置于 磁力架， 吸弃管。
22、内液体， 保留磁珠， Wash Buffer 500uL 颠倒混匀 2min 置于磁力架， 弃去 管内液体， Wash Buffer 同样洗涤两次， 离心管仍置于磁力架上， 缓慢加入 Wash Buffer ， 1min 后移走管内液体。加入 20L Elution Buffer， 55水浴 10min 洗脱磁珠上吸附 的 DNA， 4储存备用。 0021 2） PCR 反应体系与反应条件 总体积为50 L， 其中含5 L 10Taq buffer （不含Mg2+） 、 2 mmol/L MgCl2、 200 mol/ L dNTP mix、 2 U Taq DNA 聚合酶、 3 L DNA 。
23、模板、 引物各 1 mol/L。 0022 反应程序为 ： 94预变性 2 min ； 94变性 1 min、 52复性 30 s， 72延伸 30 s， 进行 30 个循环 ； 72延伸 5 min ； 4保存。 0023 3） PCR 结果判定 混合 8 L 待测样品与 2 L 6Glycerol DNA loading Buffer 上样， 以 DNA Marker DL100为分子量标记， 室温下恒压120 V， 用3 %琼脂糖凝胶电泳45 min， 0.5% mol/L的EB 染色， 凝胶成像系统检测样品， 拍照。照片显示 16 号美国白蛾有清晰的扩增条带， 而其他样 品无扩增条带，。
24、 证明设计引物为美国白蛾特异性引物。 0024 电泳图， 如图1和2所示， 图上只有16号样品美国白蛾扩增出明显特异性条带。 说 明美国白蛾普通 PCR 检测方法可在分子水平准确鉴定美国白蛾。 说 明 书 CN 103451281 A 6 1/2 页 7 SEQUENCE LISTING 苏州市外来有害生物防控技术中心 一种快速检测美国白蛾的试剂盒 100 4 PatentIn version 3.3 1 17 DNA Artificial COI01 序列 1 caggaactgg atgaaca 17 2 17 DNA Artificial COI02 序列 2 cctactgctc atacgaa 17 3 18 序 列 表 CN 103451281 A 7 2/2 页 8 DNA Artificial SpmR01 序列 3 acgctgttgt ccgtattt 18 4 18 DNA Artificial SpmR02 序列 4 ctgatttctt cggtgttg 18 序 列 表 CN 103451281 A 8 1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103451281 A 9 。