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1、(10)申请公布号 CN 103461322 A (43)申请公布日 2013.12.25 CN 103461322 A *CN103461322A* (21)申请号 201210187672.9 (22)申请日 2012.06.07 A01N 1/02(2006.01) C12N 5/0789(2010.01) (71)申请人 臻景生物技术 （上海） 有限公司 地址 200233 上海市徐汇区桂平路 333 号 1 号楼 5 楼 申请人 臻景生物技术 （无锡） 有限公司 (72)发明人 张炳强 赵敬敬 徐栋 王飞 张丽 曹卫 (74)专利代理机构 上海一平知识产权代理有限 公司 31266 。
2、代理人 祝莲君 雷芳 (54) 发明名称 用于冻存复苏后的细胞的保存液 (57) 摘要 本发明提供了一种用于冻存复苏后的细胞 的保存液， 包括以下组分 ： 生理盐水、 KCl 以及 MgSO4。本发明还公开了保存液的用途， 以及包含 该保存液和脐带干细胞的脐带干细胞混合物。采 用本发明的保存液可以长时间保存冻存复苏后的 用于临床回输的细胞， 细胞活力较传统的生理盐 水保存要高， 更符合临床回输要求。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)申请公布号 CN。
3、 103461322 A CN 103461322 A *CN103461322A* 1/1 页 2 1. 一种细胞保存液， 其特征在于， 包括以下组分 ： 生理盐水、 KCl 和 MgSO4。 2.如权利要求1所述的细胞保存液， 其特征在于， 所述KCl的浓度为0.3-0.4g/l， MgSO4 的浓度为 0.02-0.1g/l。 3. 如权利要求 2 所述的细胞保存液， 其特征在于， 所述 KCl 的浓度为 0.32-0.36g/l， MgSO4的浓度为 0.04-0.06g/l。 4. 权利要求 1 所述的细胞保存液的用途， 其特征在于， 所述用途选自下组 ： (a) 用于保存细胞 ； 。
4、(b) 用于建立干细胞库 ； (c) 用于保持细胞的活率。 5. 如权利要求 4 所述的用途， 其特征在于， 所述细胞为冻存复苏后的细胞。 6. 如权利要求 4 所述的用途， 其特征在于， 所述干细胞为脐带干细胞。 7. 如权利要求 4 所述的用途， 其特征在于， 所述保存是指在 26进行保存。 8. 如权利要求 4 所述的用途， 其特征在于， 所述保存是指在 3.5-4.5进行保存。 9. 一种脐带干细胞混合物， 其特征在于， 所述混合物包括以下组分 ： 脐带干细胞， 和 权利要求 1 所述的细胞保存液。 10. 一种脐带干细胞库， 其特征在于， 所述细胞库含有权利要求 8 所述的脐带干细胞。
5、混 合物。 权 利 要 求 书 CN 103461322 A 2 1/5 页 3 用于冻存复苏后的细胞的保存液 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体地， 本发明涉及一种用于冻存复苏后的用于临床 回输的细胞的保存液。 背景技术 0002 细胞治疗， 又称活细胞治疗， 包括活细胞修复损伤的组织。 用于临床回输的细胞为 多干细胞或免疫细胞。脐带含有大量上皮干细胞和间充质细胞。两种干细胞均具有巨大潜 能帮助修复缺损的组织或器官， 因此协助治疗各种疾病。 上皮干细胞形成连接、 支撑或覆盖 身体某些结构和器官的软组织， 这些结构和器官包括角膜， 皮肤和肝脏 ； 而间质干细胞则是 结构性组织 。
6、（如骨骼、 软骨、 肌肉、 纤维性组织及脂肪等） 的构成要素。 0003 间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜 能的多能干细胞， 广泛存在于全身多种组织中， 可在体外培养扩增， 并能在特定条件控制下 分化为神经细胞、 成骨细胞、 肌肉细胞、 脂肪细胞等， 在细胞替代治疗及组织工程方面有极 大的应用价值。目前， 间充质干细胞 MSC(Mesenchymal stem cells,MSC) 主要来源于骨髓， 但由于骨髓源性 MSC 存在高度病毒污染的可能， 且随着年龄增长其细胞数量和扩增、 分化 能力出现明显下降趋势， 故寻找一种能替代骨髓并可弥补其缺陷的间充质干细。
7、胞来源， 已 越来越受到各国学者的关注。脐带间充质干细胞作为一种多潜能干细胞， 成功避开了胚胎 干细胞来源缺乏、 异体排斥、 道德伦理等诸多限制， 成为干细胞领域的研究热点。 0004 脐带 MSC 目前已可稳定地在体外分离， 且扩增迅速， 由于其具有低免疫原性、 支持 造血及多向分化潜能的特点， 它在多项医学组织工程方面具有广泛的临床应用前景。 0005 人脐带间充质干细胞是组织工程理想的种子细胞。因为其除具有取材方便， 来源 广， 数量充足， 增殖能力强， 长期传代不改变， 分泌具有合适构成的细胞外基质等特点。 此外 还具有以下优点 ： 1、 采集脐带对产妇和新生儿没有任何危害及损伤 ； 。
8、2、 干 / 祖细胞更原始， 有更强的增殖分化能力 ； 3、 免疫细胞较为幼稚， 功能活性低， 免疫功能不够成熟， 处于一种 缄默状态， 不会触发免疫反应及引起移植物抗宿主病 ； 4、 不会有肿瘤细胞， 病毒和病原微生 物的感染及传播几率也相对较低 ； 5、 不涉及社会、 伦理及法律方面的更多争议。 0006 人脐带间充质干细胞不仅具有多向分化潜能， 还易于外源基因的转染和表达， 且 MSC 所携带的外源基因表达具有明显的组织特异性， 因此人脐带 MSCs 有可能成为一种新型 的基因治疗的靶细胞。通过转基因的方法， 可以将利于定向分化的生长因子基因转入间充 质干细胞， 促进定向分化， 加快体内。
9、组织修复的进程。 0007 但是， 冻存复苏后的细胞， 细胞膜较为脆弱， 此时若选用常规的临床回输试剂生理 盐水作为细胞的回输保存液， 细胞在长时间运输时， 细胞容易坏死而使活性降低。因此， 尚 需提供一种细胞的保存液， 以保证冻存复苏后的细胞在运输途中保持其生物活性， 可以更 好的获得高活性的细胞。 发明内容 说 明 书 CN 103461322 A 3 2/5 页 4 0008 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷， 提供一种新型的冻存复苏后的细胞保存 液及其用途， 以及包含该保存液和脐带干细胞的脐带干细胞混合物。 0009 本发明的第一方面， 提供一种细胞保存液， 包括以下组分 ： 生理盐。
10、水、 KCl和MgSO4。 0010 在另一优选例中， 所述 KCl 的浓度为 0.3-0.4g/l， MgSO4的浓度为 0.02-0.1g/l。 0011 在另一优选例中， 所述 KCl 的浓度为 0.32-0.36g/l， MgSO4的浓度为 0.04-0.06g/ l。 0012 本发明的第二方面， 提供第一方面所述的细胞保存液的用途， 所述用途选自下 组 ： 0013 (a) 用于保存干细胞 ； 0014 (b) 用于建立干细胞库 ； 0015 (c) 用于保持干细胞的活力 0016 在另一优选例中， 所述干细胞为冻存复苏后的细胞。 0017 在另一优选例中， 所述干细胞为脐带干细胞。
11、。 0018 在另一优选例中， 所述干细胞为冻存复苏后的脐带干细胞。 0019 在另一优选例中， 所述保存是指在 26进行保存。 0020 在另一优选例中， 所述保存是指在 3.5-4.5进行保存。 0021 本发明的第三方面， 提供一种脐带干细胞混合物， 所述混合物包括以下组分 ： 0022 脐带干细胞， 和 0023 第一方面所述的细胞保存液。 0024 本发明的第四方面， 提供一种脐带干细胞库， 其特征在于， 所述细胞库含有第三方 面所述的脐带干细胞混合物。 0025 采用本发明的保存液可以长时间保存冻存复苏后的细胞， 细胞活力较传统的生理 盐水保存要高， 更符合临床回输要求。 0026。
12、 应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅， 在 此不再一一累述。 附图说明 0027 图 1 为实验 a 组和对照 a 组在不同培养时间的细胞形态图。 具体实施方式 0028 本申请的发明人经过广泛而深入地研究， 首次发现， 采用包含生理盐水、 KCl 和 MgSO4的保存液保存细胞， 如脐带干细胞， 经过长时间保存后， 脐带干细胞不易坏死， 仍具有 良好的活性和生殖能力。在此基础上， 完成了本发明。 0029 细胞保存液 0030 本发明的细胞保存液， 包括以下组分 ： 生。
13、理盐水、 KCl 和 MgSO4。 0031 在另一优选例中， 所述 KCl 的浓度为 0.3-0.4g/l， MgSO4的浓度为 0.02-0.1g/l。 0032 在另一优选例中， 所述 KCl 的浓度为 0.32-0.36g/l， MgSO4的浓度为 0.04-0.06g/ l。 说 明 书 CN 103461322 A 4 3/5 页 5 0033 钾离子和钠离子一起作用， 可以维持体内水分的平衡和心律的正常 （其中， 钾在细 胞内起作用， 钠只在细胞外起作用） ； 钾和钠平衡失调时会损害神经和肌肉的机能。钾参与 多种物质代谢， 影响细胞内酶的活性， 调节细胞内、 外液的渗透压和酸碱平。
14、衡。镁是生物机 体内重要的阳离子， 是调节细胞外钙， 钾， 钠平衡的重要离子， 是多种酶的激活剂。在钙、 维 生素 C、 磷、 钠、 钾等的代谢上， 镁是必要的物质， 在神经肌肉的机能正常运作、 血糖转化等过 程中扮演着重要的角色。 0034 发明人意外发现， 在生理盐水中添加了钾离子、 镁离子制成细胞保存液， 可以长时 间保存细胞， 如冻存复苏后的脐带干细胞， 可以维持和 / 或提高脐带干细胞的活性， 适用于 细胞的保存运输。 0035 本发明的干细胞保存液， 可以用于 ： 0036 (a) 保存干细胞 ； 0037 (b) 建立细胞库 ； 或 0038 (c) 保持干细胞的活力。 0039。
15、 在另一优选例中， 所述干细胞为冻存复苏后的细胞。 0040 在另一优选例中， 所述干细胞为脐带干细胞。 0041 在另一优选例中， 所述干细胞为冻存复苏后的脐带干细胞。 0042 在另一优选例中， 所述保存是指在 26进行保存， 较佳地， 所述保存是指在 3.5-4.5进行保存。 0043 在本发明中， 术语 “生理盐水” ， 是指生理学实验或临床上常用的渗透压与动物或 人体血浆的渗透压相等的氯化钠溶液， 浓度为 0.850.9w/v%。 0044 本发明的脐带干细胞的分离、 培养、 冻存均可以采用本领域常规的方法。 0045 脐带干细胞混合物 0046 本发明的脐带干细胞混合物， 包含以下。
16、组分 ： 0047 (a) 脐带干细胞 ； 以及 0048 (b) 细胞保存液， 包括以下组分 ： 生理盐水、 KCl 和 MgSO4。 0049 在另一优选例中， 所述 KCl 的浓度为 0.3-0.4g/l， MgSO4的浓度为 0.02-0.1g/l。 0050 在另一优选例中， 所述 KCl 的浓度为 0.32-0.36g/l， MgSO4的浓度为 0.04-0.06g/ l。 0051 本发明的细胞保存液主要优点包括 ： 0052 (1) 保存液成分清晰， 不含对细胞有害的成分 ； 0053 (2) 可以长时间保存脐带干细胞， 保持干细胞的活性 ； 0054 (3) 脐带干细胞成活率。
17、高， 增殖能力强。 0055 本发明提到的上述特征， 或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示 的所有特征可与任何组合物形式并用， 说明书中所揭示的各个特征， 可以被任何提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明， 所揭示的特征仅为均等或相似特 征的一般性例子。 0056 除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文 中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。 说 明 书 CN 103461322 A 5 4/5 页 6 0057 下面结合具体实施例， 进一步阐。
18、述本发明。应理解， 这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照 常规条件， 例如 Sambrook 等人， 分子克隆 ： 实验室手册 (New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明， 否 则百分比和份数是重量百分比和重量份数。 0058 实施例 1 0059 细胞保存液的配制 0060 将 KCl、 MgSO4溶于生理盐水中， 使 KCl 的终浓度为 0.37g/l， MgSO4的终浓度为 0.05g/l。 0061 实施。
19、例 2 0062 人脐带间充质干细胞的保存 0063 材料试剂 ： 0064 1、 移液管、 离心管、 冻存管、 转移袋、 人脐带间充质干细胞 （HUC-MSC） 、 疫苗箱 0065 2、 DMEM 培养基、 生理盐水、 干细胞保存液 （实施例 1 配制） 0066 实验分组 ： 0067 对照 a 组 ： 30ml 生理盐水 +1.2107个人脐带间充质干细胞 0068 对照 b 组 ： 1ml 生理盐水 +0.5107个人脐带间充质干细胞 0069 实验 a 组 ： 30ml 保存液 +1.2107个人脐带间充质干细胞 0070 实验 b 组 ： 1ml 保存液 +0.5107个人脐带间。
20、充质干细胞 0071 实验方法 ： 0072 取出同一批次冻存的人脐带间充质干细胞 （HUCMSC） ， 加入已提前预热的 DMEM 培 养基中， 充分混匀， 并平均分成两份。 0073 每份细胞分别用生理盐水、 保存液洗涤两次， 洗涤后， 按照实验分组条件， 制备对 照 a 组、 对照 b 组、 实验 a 组以及实验 b 组。其中， 对照 a 组和实验 a 组的细胞和保存液放入 50ml 转移袋中， 各装三袋， 用热合机密封， 对照 b 组和实验 b 组的细胞和保存液放入 1.5ml 冻存管中， 各装三管。 0074 将转移袋和冻存管放入已装有冰袋的疫苗箱中保存， 并保持疫苗箱中温度在 2 。
21、6。 0075 分别在 6h、 8h、 10h、 24h 后取出计数并计算活率、 相对提高率， 计算公式如下 ： 0076 细胞活率 = 保存后细胞数 / 初始细胞数 100% 0077 相对提高率 =（实验组细胞活率 - 对照组细胞活率） / 对照组细胞活率 100% 0078 表 1 人脐带间充质干细胞在两种保存液保存下的细胞活率 0079 说 明 书 CN 103461322 A 6 5/5 页 7 0080 结果如表 1 所示。 0081 此外， 将保存 6h、 8h、 10h、 24h 后的细胞接种在培养瓶里培养 24h， 显微观察形貌， 结果如图 1 所示。 0082 表 1 以及。
22、图 1 的实验结果表明， 在相同保存温度下， 随着时间的变化， 用保存液洗 涤及保存的细胞活率要高于生理盐水。本发明采用的保存液用于回输细胞的运输保存， 细 胞活力较传统的生理盐水保存要高， 更符合临床回输要求， 且可以进行长时间运输。 0083 本发明上述实施例以脐带干细胞为例， 说明本发明的保存液可以长时间保存脐带 干细胞， 维持和 / 或提高脐带干细胞的活性， 适用于细胞的保存运输。此外， 本发明的保存 液还可以长时间保存其他类型的细胞， 如脂肪干细胞、 脊髓干细胞等间充质干细胞， 能够维 持或提高细胞的活性， 适用于保存运输过程。 0084 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。 说 明 书 CN 103461322 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 103461322 A 8 。