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1、(10)申请公布号 CN 104263652 A (43)申请公布日 2015.01.07 CN 104263652 A (21)申请号 201410392298.5 (22)申请日 2014.08.11 CGMCC No.9230 2014.05.23 C12N 1/14(2006.01) C12N 13/00(2006.01) C12N 1/02(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 北京东方红航天生物技术股份有限 公司 地址 100089 北京市海淀区知春路 61 号院 康拓科技大厦 3 层东区 309 (72)发明人 邱斌 齐文武 谢瑶 路子佳 (7。
2、4)专利代理机构 北京同辉知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 11357 代理人 刘洪勋 (54) 发明名称 一株产洛伐他汀的紫红曲霉突变菌株及其诱 变和筛选方法 (57) 摘要 本发明公开了一株高产洛伐他汀的紫红曲霉 突变菌株， 其命名为红曲霉Monascus sp.， 保藏编 号为 CGMCC No.9230。其诱变方法为先采用地面 模拟诱变， 然后进行空间诱变的联合诱变方法。 其 筛选方法为通过含有红曲产洛伐他汀的代谢抑制 剂的培养基进行筛选。该突变菌株比出发菌株发 酵单位提高 10-40， 诱变及筛选方法效率高。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说。
3、明书 7 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104263652 A CN 104263652 A 1/2 页 2 1. 一株产洛伐他汀的紫红曲霉突变菌株， 其命名为红曲霉 Monascus sp.， 保藏编号为 CGMCC No.9230。 2. 根据权利要求 1 所述的一株产洛伐他汀的紫红曲霉突变菌株， 其特征在于， 在麦芽 汁琼脂培养平板上， 其菌株的形态特征为 ： 菌落表面绒毛状， 平坦， 边缘完整 ； 菌丝体最初 呈白色， 随菌落的生长、 发育而变化， 逐渐呈现橘色至橘红色 ； 。
4、背面边缘浅褐色， 中央渐呈 褐色 ； 该菌株的生理生化特点为 ： 生长温度范围比出发菌株更广， 耐高温， 45仍可正常生 长， 最适生长温度为 25-30 ； 生长的最适 pH 值 3.5-5， 可耐浓度高达 10的乙醇， 耐高渗 透压， 在甘油含量 25的平板上仍可正常生长。 3.一种权利要求1或2中产洛伐他汀紫红曲霉突变菌株的诱变方法， 其特征在于， 是先 采用地面模拟诱变， 然后进行空间诱变的的联合诱变方法。 4. 根据权利要求 3 所述的产洛伐他汀紫红曲霉突变菌株的诱变方法， 其特征在于， 所 述地面模拟诱变按如下步骤进行 ： (1) 将出发菌株接种在含有固体培养基的平板上进行培养， 。
5、当菌株长满整个平板后待 用 ； (2) 对平板上的菌株进行以下一组或几组筛选试验， 筛选出生长速度更快、 颜色加深的 菌株 ： a) 振动试验 ： 将长满菌株的平板固定在双振动台上， 在 0-400kN 下振动 1h， 其中前 0.5 小时为低频正弦振动试验， 后 0.5 小时为随机振动试验 ； b) 真空低能粒子辐照试验 ： 将长满菌株的平板放入空间低能综合辐照实验设备中， 在 10-3-10-6Pa 真空度下辐照 30-180 分钟后回收， 辐射剂量为 11014eV41014eV。 5. 根据权利要求 3 所述的产洛伐他汀紫红曲霉突变菌株的诱变方法， 其特征在于， 所述空间诱变是将地面模。
6、拟诱变中筛选出的菌株转移到搭载管中， 置于太空舱内， 然后 将太空舱送入空间环境诱变， 所述空间环境为 ： 微重力 10-3-10-6g， 振动 0-400kN ； 真空度 10-3-10-6Pa， 太空舱内辐射剂量 0.1-0.9mGy。 6.一种权利要求1或2中产洛伐他汀紫红曲霉突变菌株的筛选方法， 其特征在于， 依次 按如下步骤进行 ： (1) 在市售的麦芽琼脂培养基中加入红曲产洛伐他汀的代谢抑制剂， 组成筛选培养 基 ； (2) 将筛选培养基灭菌并倒在直径为 90mm 的平板中， 冷凝后就可用于筛选高产洛伐他 汀的菌株 ； (3) 将经地面模拟空间诱变与空间诱变过的菌株、 或在生产中长。
7、期使用发生退化变异 的菌株均匀涂布在筛选平板上 ； (4) 常规培养， 依照生产速度、 菌落大小筛选生长较快、 菌落形态变化较大、 颜色较深的 菌株作为备选菌株， 进入发酵流程， 最终依靠菌株产洛伐他汀的含量确定高产菌株。 7. 根据权利要求 6 所述产洛伐他汀红曲霉突变菌株的筛选方法， 其特征在于， 所述红 曲产洛伐他汀的代谢抑制剂为乙酰辅酶 A、 二氢莫纳可林 (DihydromonacolinL)、 莫纳可林 L(monacolinL)、 莫纳可林J(monacolin J)和莫纳可林K(monacolin K)其中的一种或几种 的混合物。 8. 根据权利要求 7 所述产洛伐他汀红曲霉突。
8、变菌株的筛选方法， 其特征在于， 所述代 权 利 要 求 书 CN 104263652 A 2 2/2 页 3 谢抑制剂的混合浓度为 10-6g/L10-1g/L。 权 利 要 求 书 CN 104263652 A 3 1/7 页 4 一株产洛伐他汀的紫红曲霉突变菌株及其诱变和筛选方法 技术领域 0001 本发明涉及微生物技术领域， 特别涉及一株高产洛伐他汀的紫红曲霉突变菌株及 其诱变和筛选方法。 背景技术 0002 经查证， 红曲发明在汉代， 是传统的食品和中药材。五代人陶谷在 清异录 中有 “红曲煮肉” 的记载。历代多种本草， 如 本草经解 、本草从新 、本草衍义补遗 、本草纲 目 、本草。
9、备药 及 中药大辞典 对红曲均有记载。尤其明代李时珍 本草纲目 中对红曲的 记载最为完整。 综合历代本草， 红曲性味甘温， 无毒。 归心、 肝、 脾、 大肠经。 具有活体化瘀， 健 脾消食、 除湿祛痰功能， 主治头晕、 头痛、 体胖多痰， 心腹作痛、 跌打损伤， 妇女产后恶露不净 等症状。 红曲类产品已成为目前保健食品中辅助降血脂功能的主要产品。 如CN103284060A 就公开了一种含红曲霉菌和酒酿酵母的杂粮食品及其制备方法， 可促进人体对营养物质的 全面消化吸收， 具有改善营养构成、 平衡营养， 益血补气、 清理肠胃、 清热解毒、 利水消肿及 促进消化等功效。 0003 红曲霉属于真菌界。
10、 (Fungi)、 真菌门 (Eumycota)、 子囊菌亚门 (Ascomycotina)、 不整囊菌纲 (Plectomyhcetes)、 散囊菌目 (Eurtoitales)、 红曲科 (Monascaceae)、 红曲 菌属 (Monascus Van.tiegh.)。中科院微生物菌种保藏管理委员会正式收集编目的红曲 霉有 10 个种 58 个菌株。主要有 ： 紫红红曲霉 (M.purpureus)、 安卡红曲霉 (M.anka)、 红 色红曲霉 (M.ruber)、 巴克红曲霉 (M.barken)、 烟色红曲霉 (W.uliginosus)、 发白红曲霉 (M.albidus)、 。
11、锈色红曲霉 (M.rubiginosus)、 变红红曲霉 (M.serorubesens)、 橙色红曲霉 (M.aurantiacus)、 丛毛红曲霉 (M.pilosus) 等。 0004 红曲菌是腐生菌， 嗜酸， 特别是乳酸， 因此常出现在乳酸自然发酵的物质中， 如腐 败的谷物， 大曲等都是他们繁殖的场所。此外， 在树枝上以及河流的淤积物中也有其出现。 0005 红曲生长适应的温度范围很广， 一般温度 15-42， 最适温度为 25-30， 生长的 最适 pH 值 3.5-5， 可耐浓度高达 10的乙醇。 0006 20 世纪 70 年代， 日本科学家 Endo 等人首次从红色红曲霉 M.。
12、rubber van Tieghem 中分离出活性物质红曲可林(monacolin K)以来， 日本、 美国、 韩国、 中国等众多专家学者对 红曲进行了广泛而深入的研究， 取得了令人瞩目的成果。尤其是通过红曲霉代谢产物的成 分分析及其活性研究， 不断挖掘出生物活性物质及新化合物。 0007 微生物发酵生产功能性物质， 首要的影响因素就是菌株产目标物质的能力。由于 微生物变异快， 因此微生物发酵工程一直受到制药人士的亲睐。但高效的诱变方法以及从 众多的突变菌株中筛选出高产目的产物的菌株， 一直是微生物诱变工作的难点。空间诱变 技术作为紫红曲霉菌新的诱变手段具有诱变有益突变率高等显著特点， 高效的。
13、筛选平台将 大大提高筛选效率， 缩短获得目的菌株的时间， 对降低生产成本意义重大。 发明内容 说 明 书 CN 104263652 A 4 2/7 页 5 0008 针对上述现有技术中存在的不足， 本发明的目的在于提供一种高产洛伐他汀的紫 红曲霉突变菌株 , 命名为红曲霉 Monascus sp.， 提供的菌株其发酵单位与出发株相比提高 了 40。相应地还提供了上述突变菌株的诱变方法和筛选方法。 0009 一株产洛伐他汀的紫红曲霉突变菌株， 其命名为红曲霉 Monascus sp.， 保藏编号 为 CGMCC No.9230。 0010 上述菌株在麦芽汁琼脂培养平板上， 形态特征为 ： 菌落表。
14、面绒毛状， 平坦， 边缘完 整 ； 菌丝体最初呈白色， 随菌落的生长、 发育而变化， 逐渐呈现橘色至橘红色 ； 背面边缘浅 褐色， 中央渐呈褐色 ； 该菌株的生理生化特点为 ： 生长温度范围比出发菌株更广， 耐高温， 45仍可正常生长， 最适生长温度为 25-30； 生长的最适 pH 值 3.5-5， 可耐浓度高达 10 的乙醇， 耐高渗透压， 在甘油含量 25的平板上仍可正常生长。 0011 一种上述产洛伐他汀紫红曲霉突变菌株的诱变方法， 是先采用地面模拟诱变， 然 后进行空间诱变的的联合诱变方法。 0012 所述地面模拟诱变按如下步骤进行 ： 0013 (1) 将出发菌株在接种在含有固体培。
15、养基的平板上进行培养， 当菌株长满整个平 板后待用 ； 菌株平板的制作方式如下 ： 1) 准备麦芽汁琼脂 20-80g ； 琼脂 2-6g ； 水 1000ml 进 行混合 ； 2) 在 125下灭菌 25min ； 3) 每个平皿倒培养基 20-30ml， 30-33培养 24 小时无 菌可以使用 ； 4) 将菌株接种上在 28-35恒温培养， 5-10 天筛选出生长速度更快、 颜色更深 的菌株待用。 0014 (2) 对平板上的菌株进行以下一组或几组筛选试验， 筛选出生长速度更快、 颜色加 深的菌株 ： 0015 a)振动试验 ： 将长满菌株的平板固定在双振动台上， 在0-400kN下振动。
16、1h， 其中前 0.5 小时为低频正弦振动试验， 后 0.5 小时为随机振动试验 ； 0016 b) 真空低能粒子辐照试验 ： 将长满菌株的平板放入空间低能综合辐照实验设备 中， 在 10-3-10-6Pa 真空度下辐照 30-180 分钟后回收， 辐射剂量为 11014eV41014eV。 0017 筛选出的菌株经过 3-10 代的传代工作， 将菌株接种在籼米上， 4冰箱保存， 待发 射计划确定后， 再进行复壮， 进行空间诱变。 0018 所述空间诱变是将地面模拟诱变中筛选出的菌株转移到搭载管中， 置于太空舱 内， 然后将太空舱送入空间环境诱变， 所述空间环境为 ： 微重力10-3-10-6。
17、g， 振动0-400kN ； 真 空度 10-3-10-6Pa， 太空舱内辐射剂量 0.1-0.9mGy。 0019 所述的空间诱变试验具体为 ： 将从地面模拟实验中挑选出的生长更迅速、 颜色更 深的菌株(实验室编号SBL-HQ-21)接种在红曲大米上， 以便于进行空间诱变试验。 首先， 将 平板上的菌株接种在种子液中进行发酵， 种子液发酵液按重量比由以下组分组成 ： 食用甘 油 5-10 ； 牛肉膏 3-5 ； 葡萄糖 2-3 ； 大豆蛋白胨 0.2-1.0 ； 磷酸二氢钾 0.01-0.5 ； 硫酸镁 0.01-0.5； 氯化钾 0.01-0.5； 硝酸钠 0.01-0.5； 将上述组分用。
18、 10Brix 的麦芽 汁溶解。每 500mL 三角瓶装培养基 200-300mL， 25-35培养 3-7 天。其次， 将种子液中长好 菌种接种在灭菌的籼米上， 并加入营养液进行培养。所述的营养液按重量百分比由以下组 分组成 ： 葡萄糖 2-8； 酵母粉 1-3； 冰乙酸 0.5-1.25； 硝酸钠 0.01-0.1； 磷酸二氢钾 0.01-0.1； 磷酸氢二钾 0.01-0.1， 用 10Brix 的麦芽汁溶解。最后， 在 25-35条件下培 养至大米完全变红， 在无菌条件下， 将红曲米加入 2mL 搭载小管中， 封口膜封口， 再将搭载 说 明 书 CN 104263652 A 5 3/7。
19、 页 6 小管装入溶剂 30-50mL 的搭载大管中。将搭载大管交给发射基地有关人员， 安装在神舟八 号飞船上， 随飞船进行空间诱变试验， 最后得到了一株洛伐他汀产生量比出发菌株高 40 的突变菌株红曲霉 Monascus sp.。 0020 一种产洛伐他汀紫红曲霉突变菌株的筛选方法， 其特征在于， 依次按如下步骤进 行 ： 0021 (1) 在市售的麦芽琼脂培养基中加入红曲产洛伐他汀的代谢抑制剂， 组成筛选培 养基 ； 0022 (2) 将筛选培养基灭菌并倒在直径为 90mm 的平板中， 冷凝后就可用于筛选高产洛 伐他汀的菌株 ； 具体方法可采用划线法、 涂布法或点种法 ； 0023 (3)。
20、 将经地面模拟空间诱变与空间诱变过的菌株、 或在生产中长期使用发生退化 变异的菌株均匀涂布在筛选平板上。 0024 (4) 常规培养 (24-37恒温培养 5-15 天。)， 依照生产速度、 菌落大小筛选生长较 快、 菌落形态变化较大、 颜色较深的菌株作为备选菌株， 进入发酵流程， 最终依靠菌株产洛 伐他汀的含量确定高产菌株。 0025 所 述 红 曲 产 洛 伐 他 汀 的 代 谢 抑 制 剂 为 乙 酰 辅 酶 A、 二 氢 莫 纳 可 林 (DihydromonacolinL)、 莫纳可林 L(monacolinL)、 莫纳可林 J(monacolin J) 和莫纳可林 K(monaco。
21、lin K) 其中的一种或几种的混合物。 0026 所述筛选平板由以下组分组成 ： 麦芽汁琼脂， 含量为 2 -8， 琼脂 1-4g， 水 1000ml， 筛选剂 1ml， pH6-8。并经过 121-125灭菌 25min。 0027 所述代谢抑制剂的混合浓度为 10-6g/L10-1g/L。 0028 本发明将出发菌株紫红曲霉菌 (Monascus purpureus)SBL-HQ-11( 实验室编 号 ) 在地面经过模拟实验后， 随 “神舟八号” 在太空飞行 397 小时进行空间诱变， 从回收样 品中筛选得到了一株紫红曲霉突变株， 达到了本发明的目的。 0029 目前对红曲产洛伐他汀菌株。
22、的筛选只能通过菌落生长速度和颜色进行判断， 相对 比较盲目。 本发明提供的一种洛伐他汀生产菌株的简便、 高效的筛选方法， 不仅可有效剔除 发酵能力退化的菌株， 而且大大提高菌株筛选的效率， 对降低洛伐他汀的生产成本， 保证生 产的正常进行具有十分明确的效果。 0030 具体的有益效果为 ： 0031 (1) 本方法基于微生物代谢途径中代谢产物反馈抑制原理， 将代谢抑制剂加入到 普通培养平板中， 在这样平板中生长状况良好的菌株， 通常都是高产洛伐他汀的菌株。 因此 只要挑出在这种平板上生长良好的但菌落， 一般就是高产洛伐他汀的菌株， 因此这是一种 高效、 简便的优良菌株平板筛选方法。 0032 。
23、(2) 本方法实现了高产菌株的单独培养平板筛选， 和传统筛选方法比较， 降低了工 作量 50 -100， 并大大降低了筛选的盲目性。 0033 (3) 本方法操作过程简单， 所需试剂和材料均为实验室常见的普通试剂。 0034 该菌种已于 2014 年 5 月 23 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心， 保藏编号为CGMCC No.9230， 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微 生物研究所， 邮政编码 100101。 说 明 书 CN 104263652 A 6 4/7 页 7 附图说明 0035 图 1 为本发明所提供产洛伐他汀紫红曲霉突变菌株在麦芽培养基上。
24、的特征形态 示意图 ； 具体实施方式 0036 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案， 下面结合附图和具体实施方式 对本发明作进一步的详细说明。 产洛伐他汀紫红曲霉突变菌株在麦芽培养基上的特征形态 特征请参考图 1。 0037 实施例 1 0038 将出发菌株在接种在含有固体培养基的平板上进行培养， 当菌株长满整个平板后 待用 ； 菌株平板的制作方式如下 ： 1) 准备麦芽汁琼脂 20-80g ； 琼脂 2-6g ； 水 1000ml 进行混 合 ； 2) 在 125下灭菌 25min ； 3) 每个平皿倒培养基 20-30ml， 30-33培养 24 小时无菌可 以使用 ； 4) 将菌。
25、株接种上在 28-35恒温培养， 5-10 天筛选出生长速度更快、 颜色更深的菌 株待用。 0039 1、 模拟空间诱变 0040 (1) 真空低能粒子诱变 ： 将培养好的红曲菌放入空间低能综合辐照实验设备中进 行真空低能粒子辐照试验。1 小时后回收， 将试验后菌株加入种子液中进行扩增培养。辐 射剂量为 ： 51010e/cm2S 和 101010e/cm2S 辐照 时间为 1 小时， 辐照一个小时总剂量 为 ： 1.81014eV 和 3.61014eV。 0041 (2) 培养 ： 在无菌条件下取培养面积为 0.5 平方厘米的模拟样品， 用 5 毫升无菌水 洗脱菌体到无菌离心管中， 用移液。
26、器吸打均匀菌体洗脱液， 取0.5毫升该菌液到4.5毫升无 菌水中， 吸打均匀， 以此类推， 做倍比稀释。取 10-4 和 10-5 稀释液涂布到平板培养基， 每块 平板上涂 50-250 微升稀释菌液， 每个稀释梯度涂多块平板。待菌液被培养基吸收后于培养 箱中 28-45倒置培养 2-7 天。 0042 (3) 筛选 ： 选取生长迅速、 单菌落大、 颜色深的菌株继续培养、 保存， 进行下一步空 间诱变试验。 0043 2、 空间诱变试验 0044 (1) 神舟八号搭载样品准备 0045 将模拟空间诱变筛选出的菌株接种在红曲大米上， 以便于进行空间诱变试验。 首先， 将平板上的菌株接种在种子液中。
27、进行发酵， 种子液发酵液按重量比由以下组分组 成 ： 食用甘油 5-10 ； 牛肉膏 3-5 ； 葡萄糖 2-3 ； 大豆蛋白胨 0.2-1.0 ； 磷酸二氢钾 0.01-0.5 ； 硫酸镁 0.01-0.5 ； 氯化钾 0.01-0.5 ； 硝酸钠 0.01-0.5 ； 余量为 10Brix 的麦芽汁。每 500mL 三角瓶装培养基 200-300mL， 25-35培养 3-7 天。然后， 将种子液中长 好菌种接种在灭菌的籼米上， 并加入营养液进行培养。所述的营养液按重量百分比由以下 组分组成 ： 葡萄糖 2-8； 酵母粉 1-3； 冰乙酸 0.5-1.25； 硝酸钠 0.01-0.1； 磷。
28、酸二氢 钾 0.01-0.1 ； 磷酸氢二钾 0.01-0.1， 余量用 10Brix 的麦芽汁补充。最后， 在 25-35 条件下培养至大米完全变红， 在无菌条件下， 将红曲米加入 2mL 搭载小管中， 封口膜封口， 再将搭载小管装入溶剂 30-50mL 的搭载大管中。将搭载大管交给发射基地有关人员， 安装 在神舟八号飞船上， 随飞船进行空间诱变试验取经过初步筛选的、 生长良好的菌体培养物 说 明 书 CN 104263652 A 7 5/7 页 8 在无菌条件下转移到搭载专用管中， 拧紧管盖， 接口处用封口膜封口后装入搭载用大管， 送 交搭载前于 4保存。此搭载管放入 “神舟八号” 飞船中。
29、， 在太空中随飞船飞行 397 小时后 回收。 0046 (2) 搭载的空间环境 0047 神舟八号飞行过程中， 空间环境的相关数据为 ： 飞船轨道为椭圆形倾斜轨道， 近地点高度 200 千米， 远地点高度 329.8 千米。飞船飞行 397 小时 ； 微重力水平 ： 10-3 10-6g ； 辐射剂量测试结果表明， 本次飞行平均日剂量在 0.5mGy。飞船在轨期间的温度范围 ： 17-25。 0048 (3) 培养 ： 回收搭载管。在无菌条件下取培养面积为 0.5 平方厘米的搭载回收样 品， 用 5 毫升无菌水洗脱菌体到无菌离心管中， 用移液器吸打均匀菌体洗脱液， 取 0.5 毫升 该菌液到。
30、 4.5 毫升无菌水中， 吸打均匀， 以此类推， 做倍比稀释。取 10-4和 10-5倍的稀释液 涂布到平板培养基， 每块平板上涂 50-250 微升稀释菌液， 每个稀释梯度涂多块平板。待菌 液被培养基吸收后于培养箱中 28-45倒置培养 2-7 天。 0049 3、 筛选 0050 (1) 筛选平板的制作 0051 1) 筛选平板由以下几种物质组成 ： 麦芽汁琼脂， 含量为 5， 琼脂 2g， 水 1000ml， 1ml“monacolin J:monacolin L 1:1” 的混合液， 混合浓度为 10-3g/L， 自然 pH。 0052 2)121灭菌 25min 0053 3) 取灭。
31、好菌的直径为 90mm 的培养皿， 每个培养皿倒培养基 30ml， 37培养 24 小 时， 选取无菌平板进入下一个工作环节， 污染平板灭菌销毁。 0054 (2) 接种 0055 挑选经空间诱变后生长迅速、 颜色较深的单菌落， 划线法接种于预先制备好的筛 选平板上。 0056 (3) 培养 0057 将接种好的平板于霉菌培养箱中， 32恒温培养 10 天。 0058 (4) 菌落挑选 0059 将平板上生长速度快、 颜色深的单菌落挑出。划线法接种到普通红曲菌株生产平 板上， 即可进入生产环节。 0060 该菌株经生产验证， 洛伐他汀的产量由出发菌株的 13mg/g 提高到 18.2mg/g，。
32、 比出 发菌株提高了 40， 效果十分显著。 0061 实施例 2 ： 0062 模拟空间诱变前的菌株培养方法同实施例 1。 0063 1、 模拟空间诱变 0064 (1) 模拟空间飞行的振动试验 ： 将培养好的红曲菌平板 (9cm) 固定在 400kN 双 振动台上， 试验 1h， 开始 0.5 小时为低频正弦振动试验， 后 0.5 小时为随机振动试验。本试 验模拟飞行器发射和返回时所受振动的情况。 0065 (2) 培养 ： 在无菌条件下取培养面积为 0.5 平方厘米的模拟样品， 用 5 毫升无菌水 洗脱菌体到无菌离心管中， 用移液器吸打均匀菌体洗脱液， 取0.5毫升该菌液到4.5毫升无 。
33、菌水中， 吸打均匀， 以此类推， 做倍比稀释。 取10-4和10-5倍的稀释液涂布到平板培养基， 每 说 明 书 CN 104263652 A 8 6/7 页 9 块平板上涂 50-250 微升稀释菌液， 每个稀释梯度涂多块平板。待菌液被培养基吸收后于培 养箱中 28-45倒置培养 2-7 天。 0066 (3) 筛选 ： 选取生长迅速、 单菌落大、 颜色深的菌株继续培养、 保存， 进行下一步空 间诱变试验。 0067 2、 空间诱变与实施例 1 相同。 0068 3、 筛选 0069 (1) 筛选平板的制作 0070 1) 筛选平板由以下几种物质组成 ： 麦芽汁琼脂， 含量为 5， 琼脂 2。
34、g， 水 1000ml， 1ml“monacolinL ： monacolin J ： monacolin K 1 ： 1 ： 2” 的混合液， 混合浓度为 10-4g/L， 自 然 pH。 0071 2)121灭菌 25min 0072 3) 取灭好菌的直径为 90mm 的培养皿， 每个培养皿倒培养基 30ml， 37培养 24 小 时， 选取无菌平板进入下一个工作环节， 污染平板灭菌销毁。 0073 (2) 接种 0074 挑选经空间诱变后生长迅速、 颜色较深的单菌落， 划线法接种于预先制 备好的筛 选平板上。 0075 (3) 培养 0076 将接种好的平板于霉菌培养箱中， 32恒温培养。
35、 10 天。 0077 (4) 菌落挑选 0078 将平板上生长速度快、 颜色深的单菌落挑出。划线法接种到普通红曲菌株生产平 板上， 即可进入生产环节。 0079 该菌株经生产验证， 洛伐他汀的产量由出发菌株的 14mg/g 提高到 16.8mg/g， 比出 发菌株提高了 20， 效果十分显著。 0080 实施例 3 ： 0081 1、 模拟空间诱变和空间诱变与实施例 1 相同。 0082 2、 筛选 0083 (1) 筛选平板的制作 0084 1) 筛选平板由以下几种物质组成 ： 麦芽汁琼脂， 含量为 5， 琼脂 2g， 水 1000ml， 1ml 浓度为 10-4g/L 的 monacol。
36、inL， 混合， 自然 pH。 0085 2)121灭菌 25min 0086 3) 取灭好菌的直径为 90mm 的培养皿， 每个培养皿倒培养基 30ml， 37培养 24 小 时， 选取无菌平板进入下一个工作环节， 污染平板灭菌销毁。 0087 (2) 接种 0088 挑选经空间诱变后生长迅速、 颜色较深的单菌落， 划线法接种于预先制备好的筛 选平板上。 0089 (3) 培养 0090 将接种好的平板于霉菌培养箱中， 32恒温培养 10 天。 0091 (4) 菌落挑选 0092 将平板上生长速度快、 颜色深的单菌落挑出。划线法接种到普通红曲菌株生产平 说 明 书 CN 104263652。
37、 A 9 7/7 页 10 板上， 即可进入生产环节。 0093 该菌株经生产验证， 洛伐他汀的产量由出发菌株的 15mg/g 提高到 16.5mg/g， 比 出发菌株提高了 10， 效果十分显著。 0094 实施例 4 ： 0095 模拟空间诱变前的菌株培养方法同实施例 1。 0096 1、 模拟空间飞行振动试验 0097 (1) 模拟空间飞行振动试验 ： 试验同实施例 2 中 1、 的 (1) 模拟空间飞行的振动试 验。 0098 (2) 培养 ： 模拟后的培养试验同实施例 2 的 1、 (2) 培养。 0099 (3) 筛选 ： 同实施例 2 的 1、 (3) 筛选。 0100 选取生长。
38、迅速、 单菌落大、 颜色深的菌株进行模拟辐射试验。 0101 2、 真空低能粒子诱变实验 0102 (1) 真空低能粒子诱变 ： 同实施例 1 中的 1、 (1) 0103 (2) 培养 ： 同实施例 1 中的 1、 (2) 0104 (3) 筛选 ： 同实施例 1 中的 1、 (3) 0105 3、 筛选 0106 (1) 筛选平板的制作 0107 1) 筛选平板由以下几种物质组成 ： 麦芽汁琼脂， 含量为 5， 琼脂 2g， 水 1000ml， 1ml、 浓度为 10-3g/L 的 monacolin J 溶液， 自然 pH。 0108 2)121灭菌 25min 0109 3) 取灭好菌。
39、的直径为 90mm 的培养皿， 每个培养皿倒培养基 30ml， 37培养 24 小 时， 选取无菌平板进入下一个工作环节， 污染平板灭菌销毁。 0110 (2) 接种 0111 挑选经空间诱变后生长迅速、 颜色较深的单菌落， 划线法接种于预先制备好的筛 选平板上。 0112 (3) 培养 0113 将接种好的平板于霉菌培养箱中， 32恒温培养 10 天。 0114 (4) 菌落挑选 0115 将平板上生长速度快、 颜色深的单菌落挑出。划线法接种到普通红曲菌株生产平 板上， 即可进入生产环节。 0116 该菌株经生产验证， 洛伐他汀的产量由出发菌株的 11mg/g 提高到 12.1mg/g， 比出 发菌株提高了 10， 效果十分显著。 0117 以上对本发明所提供的一株高产洛伐他汀的紫红曲霉突变菌株及其诱变和筛选 方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述， 以 上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出， 对于本技术领域的普通 技术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以对本发明进行若干改进和修饰， 这些 改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。 说 明 书 CN 104263652 A 10 1/1 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 104263652 A 11 。