《一种利用人参端粒长度鉴别人参年限的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种利用人参端粒长度鉴别人参年限的方法.pdf（8页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 104293955 A (43)申请公布日 2015.01.21 CN 104293955 A (21)申请号 201410538757.6 (22)申请日 2014.10.13 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 中国中医科学院中药研究所 地址 100700 北京市东城区东直门内南小街 16 号 (72)发明人 黄璐琦 蒋超 袁媛 王尧龙 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 一种利用人参端粒长度鉴别人参年限的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种利用人参端粒长度鉴 别人参年限的方法。该。
2、方法包括如下步骤 ： 1) 取待测人参位于芦头以下 1 2cm 处的样品， 提取总 DNA ； 2) 取总 DNA， 用能够识别并切割 5 -TCGA-3 所示双链 DNA 的内切酶进行酶切 ； 3) 以 5 -CCCTAAA-3 所示的单链 DNA 为探针， 对酶 切产物进行 Southern 印记杂交或点杂交 ； 4) 根 据杂交结果， 对杂交产物的限制性片段长度进行 测定， 得到所述待测人参的端粒限制性片段长度， 记为 TRF待测； 5) 将 TRF待测作为 y 值代入公式 y 0.827x+8.231， 所得 x 值即为所述待测人参的年 限。 实验证明， 该方法测定的人参年限与实际年限。
3、 吻合度极高， 而且该方法所需样品量极少， 对人参 损害极小， 可谓一种无损鉴定方法。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104293955 A CN 104293955 A 1/1 页 2 1. 一种鉴别人参年限的方法， 包括如下步骤 ： (1) 取待测人参位于芦头以下 1 2cm 处的样品， 提取总 DNA ； (2) 取步骤 (1) 提取的总 DNA， 用能够识别并切割 5 -TCGA-3 所示双链 DNA 的内切酶 进行酶切。
4、 ； (3)以5 -CCCTAAA-3 所示的单链DNA为探针， 对步骤(2)所得酶切产物进行Southern 印记杂交或点杂交 ； (4) 根据步骤 (3) 的杂交结果， 对杂交产物的限制性片段长度进行测定， 得到所述待测 人参的端粒限制性片段长度， 记为 TRF待测； (5) 将步骤 (4) 获得的 TRF待测作为 y 值代入公式 I， 所得 x 值即为所述待测人参的年 限 ； y 0.827x+8.231 公式 I 式中， x 代表人参年限， y 代表端粒限制性片段长度。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 (1) 中， 所取的所述样品的量为干重 0.1 1g。 。
5、3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 (2) 中， 所取的所述总 DNA 的量 为 1 20g。 4. 根据权利要求 1-3 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 (2) 中， 所述能够识别并切 割 5 -TCGA-3 所示双链 DNA 的内切酶为限制性内切酶 TaqaI 或所述限制性内切酶 TaqaI 的 同裂酶。 5. 根据权利要求 1-4 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 (3) 中， 所述探针带有荧光 标记或非放射性标记 ； 所述荧光标记为荧光素、 德克萨斯红、 Cy5 或 Cy3 ； 所述非放射性标记为地高辛或生物 素。 6. 根据权利要求 。
6、1-5 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 (4) 中， 所述根据步骤 (3) 的杂交结果， 对杂交产物的限制性片段长度进行测定， 得到所述待测人参的端粒限制性片 段长度， 为 ： 将步骤 (3) 杂交所得的显影结果用端粒长度分析软件根据公式 II 计算出对应 的限制性片段长度 TRF ； TRF Ai/ (Ai/Li) 公式 II 式中， Ai 为 i 点的吸光度值， Li 为 i 点的 Marker 长度。 7. 根据权利要求 1-6 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述待测人参为年限在 3 年以 上的人参。 权 利 要 求 书 CN 104293955 A 2 1/5 页 3 。
7、一种利用人参端粒长度鉴别人参年限的方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及一种利用人参端粒长度鉴别人参年限的方法， 特 别涉及一种利用人参端粒限制性片段长度 (TRF 值 ) 鉴别人参年限的方法。 背景技术 0002 药材人参， 为五加科植物人参的根部， 在中国传统医药中作为滋补强壮药已经使 用了近千年。人参于种植后第四年开花， 其根部在 4-6 年间逐渐成熟且能成活数百年。研 究表明， 人参根部年限越长、 人参皂苷含量越高， 使其具有更高的药用价值和商业价值。 0003 人参年限的传统鉴别方法为性状鉴定， 即通过观察人参芦碗的数量判断人参的年 限， 但部分芦碗融合较难观察， 。
8、且机械破损也会导致人参年限无法断定， 更有甚者用移栽的 方式增加芦碗数量以次充好。化学分析也常常作为人参年限鉴别的方法之一， 但该方法往 往需要数克人参粉末样品， 难以保证人参外形的完整性， 大大损坏了人参的价值。因此， 为 了保护消费者权益、 保证人参价值， 必须探索到一种误差小、 可操作、 可量化、 基本实现无损 鉴定的年限鉴定技术。 0004 近年来， 随着分子生物学的发展， 通过分子手段用来检测人参的年限已成为了一 个突破口。 端粒是由一组串联的重复DNA序列(TTAGGG in all vertebrates)组成的， 处于 染色体两端所必不可少的核糖核蛋白复合体， 在染色体上起着维。
9、护基因组稳定性的作用。 2009 年诺贝尔生理学奖科学家揭示端粒长度随着体细胞的分裂而逐渐缩短这一特性， 每一 轮的细胞分裂都会导致端粒的缩短， 这决定了它可以作为 DNA 的 “年轮” 和分子钟， 在一定 程度上反映生物个体的年龄水平。 0005 Southern 印迹杂交 (Southern blot) 是进行基因组 DNA 特定序列定位的通用方 法。 其基本原理是 ： 具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下， 可按碱基互补的原则 特异性地杂交形成双链。利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的 DNA 片段， 将胶 上的 DNA 变性并在原位将单链 DNA 片段转移至尼龙膜或其他固相。
10、支持物上， 经干烤或者紫 外线照射固定， 再与相对应结构的标记探针进行杂交， 用放射自显影或酶反应显色， 从而检 测特定 DNA 分子的含量。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种利用人参端粒限制性片段长度 (TRF 值 ) 鉴别人参年限 的方法。 0007 本发明所提供的鉴别人参年限的方法， 具体可包括如下步骤 ： 0008 (1) 取待测人参位于芦头以下 1 2cm 处的样品， 提取基因组 DNA ； 0009 (2) 取步骤 (1) 提取的基因组 DNA， 用能够识别并切割 5 -TCGA-3 所示双链 DNA 的内切酶进行酶切 ； 0010 (3) 以 5 -CCCTAAA-3所。
11、示的单链 DNA 为探针， 对步骤 (2) 所得酶切产物进行 Southern 印记杂交或点杂交 ； 说 明 书 CN 104293955 A 3 2/5 页 4 0011 (4) 根据步骤 (3) 的杂交结果， 对杂交产物的限制性片段长度 (TRF) 进行测定， 得 到所述待测人参的端粒限制性片段长度， 记为 TRF待测； 0012 (5) 将步骤 (4) 获得的 TRF待测作为 y 值代入公式 I， 所得 x 值即为所述待测人参的 年限 ； 0013 y 0.827x+8.231 公式 I 0014 式中， x 代表人参年限， y 代表端粒限制性片段长度。 0015 在所述方法的步骤 (1。
12、) 中， 所取的所述样品的量可为干重 0.1 1g( 如 0.1g)。 0016 在本发明的一个实施例中， 所述基因组 DNA 的提取方法具体为 CTAB 法。 0017 在所述方法的步骤(2)中， 所取的所述基因组DNA的量可为120g(如10g)。 0018 在所述方法的步骤 (2) 中， 所述能够识别并切割 5 -TCGA-3 所示双链 DNA 的内切 酶可为限制性内切酶 TaqaI 或所述限制性内切酶 TaqaI 的同裂酶。在本发明的一个实施例 中所述能够识别并切割 5 -TCGA-3 所示双链 DNA 的内切酶具体为 NEB 公司生产的限制性 内切酶 TaqaI。 0019 在所述方。
13、法的步骤 (3) 中， 所述探针需带有荧光标记或非放射性标记 ； 0020 所述荧光标记可为荧光素、 德克萨斯红、 Cy5 或 Cy3 ； 所述非放射性标记可为地高 辛或生物素。在本发明的一个实施例中， 所述探针携带的标记具体为地高辛。 0021 在本发明的一个实施例中， 在所述步骤(3)中， 对步骤(2)所得酶切产物具体进行 的 Southern 印记杂交。 0022 在所述方法的步骤 (4) 中， 所述 “根据步骤 (3) 的杂交结果， 对杂交产物的限制性 片段长度 (TRF) 进行测定， 得到所述待测人参的端粒限制性片段长度” 具体为 ： 将步骤 (3) 杂交所得的显影结果用端粒长度分析。
14、软件 ( 如 Telomeric.2 软件 ) 根据公式 II 计算出对 应的限制性片段长度 TRF ； 0023 TRF Ai/ (Ai/Li) 公式 II 0024 式中， Ai 为 i 点的吸光度值， Li 为 i 点的 Marker 长度。 0025 对于本发明所提供的方法， 所述待测人参需为年限在 3 年以上的人参。 0026 实验证明， 本发明利用人参端粒 5 -TTTAGGG-3重复序列， 使用 TaqaI 内切酶对 人参 DNA 酶切， 而后以 5 -CCCTAAA-3 为探针， 进行 Southern 印迹杂交， 得到端粒特异性杂 交条带， 结合 TRF 值建立数学模型得出人。
15、参年限计算公式， 对人参年限进行评估。结果表明 该方法测定的人参年限与实际年限吻合度极高， 而且该方法所需样品量极少， 对人参损害 极小， 可谓一种无损鉴定方法。 附图说明 0027 图 1 为人参 Southern 杂交图及人参年限和 TRF 值的数学模型。其中， A 为人参 Southern 杂交图 (2、 3、 4、 5、 6、 8 表示对应人参样品的年限， M 为 DNA Molecular Weight Marker III) ； B 为人参年限和 TRF 值的数学模型。 具体实施方式 0028 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0029 下述实施例中所用的。
16、材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 说 明 书 CN 104293955 A 4 3/5 页 5 0030 台 式 高 速 离 心 机 (Eppendorf 公 司 )、 Olympms 荧 光 显 微 镜、 WFJ Unic 7200 spectrophotometer、 BS2202S 型电子天平 (Startorius 公司 )、 SIM-F124 型制冰机 (SANYO 公司 )、 4KBTXL-75 型真空冷冻干燥机 (Virtis 公司 ) ； 680X 凝胶成像分析系统 ( 基因有限 公司 )、 PAGE 凝胶电泳仪、 CS101-2A 电热干燥箱、 SHZ-。
17、D 循环水式真空泵 ( 巩义市予化仪器 有限公司 ) ； Retsch MM400 磨样机、 5810R 型低温冷冻离心机。 0031 UNIQ-10 柱式 DNA 纯化试剂盒 ( 上海生工 )、 NEB 限制性内切酶 TaqaI、 DNA Molecular Weight Marker III、 Digoxigenin labeled、 Blocking Reagent、 地高辛抗体 Anti-Digoxigenin-AP( 罗氏 )、 CDP-Star( 罗氏 ) ； 地高辛杂交探针标记 5 -CCCTAAA-3 由 上海生工合成。 0032 实施例 1、 利用人参端粒长度鉴别人参年限的方。
18、法的建立 0033 供试人参 ： 来自两个地区不同年限的人参样品， 详见表 1。 0034 表 1 两个地区不同年限的人参样品 0035 0036 一、 人参基因组 DNA 的提取 0037 采用 CTAB 法提取各供试人参的基因组 DNA。具体如下 ： 0038 取待测人参位于芦头以下 1 2cm 处的样品 0.1g 干重 ( 无霉变 )， 置于粉碎机 中研磨粉碎， 过 40 目筛。将粉末转移到 2.0mL 的 Eppendorf 管中， 加入 900L 已灭菌的 CTAB 提取液 ( 配方 ： 2 (2g/100ml)CTAB， 100mmol/L Tris-HCl pH 8.0， 20m。
19、mol/LEDTA， 1.4mol/L NaCl)、 0.02g PVP 40000、 10L- 巯基乙醇充分振荡混匀， 65水浴 1.5h-2h， 期间轻摇 2-3 次。结束后取出冷却至室温， 加入 900L 氯仿 - 异戊醇 ( 体积比 24 ： 1)， 充 分振荡混匀， 12000g 离心 10min。取上清， 加入等体积氯仿 - 异戊醇 ( 体积比 24 ： 1)， 充分 振荡混匀， 12000g 离心 10min。取上清， 加入 2/3 体积预冷的异丙醇溶液， -20放置 2h 以 上。取出， 12000g 离心 10min， 弃上清， 沉淀用 70 ( 体积分数 ) 乙醇洗涤两次，。
20、 37挥干乙 醇， 加入 100L ddH2O、 1 RNaseA(10mg/ml)( 即加入 1体积浓度为 10mg/ml 的 RNAaseA 溶液)37温育30min后加入1蛋白酶K(5mg/ml)(即加入1体积浓度为5mg/ml的蛋白 酶 K 溶液 )， 37温育 1h ； 根据需要再重新用氯仿 - 异戊醇、 70 ( 体积分数 ) 乙醇参照以 上步骤抽提、 纯化 DNA， 用适量 ddH2O 溶解， -20保存。 0039 二、 人参基因组 DNA 的酶切 0040 酶切体系按照如下表 2 进行配比。 0041 表 2 人参基因组 DNA 的酶切体系 0042 说 明 书 CN 104。
21、293955 A 5 4/5 页 6 0043 65酶切过夜(12小时)， 检测结果显示弥散状， 酶切完全后加水600l再加等体 积氯仿 ： 异戊醇(体积比24:1)纯化， 1200rmp离心15min， 取水相加入1/10体积的3M NaAc， 2.5 倍体积无水乙醇， -20沉淀 3h 以上， 12500rpm 离心 25min， 70乙醇洗 3 次， 烘干。 0044 三、 Southern blots 0045 1、 转膜 0046 40l ddH2O 溶解步骤二获得的基因组 DNA， 65温育 10min， 立即放置于冰上， 加 入 loading buffer， 混匀。经 1琼脂糖。
22、凝胶， 恒压 80V 电泳 6 8 小时， 溴酚蓝跑至凝胶 2/3 处停止电泳。去离子水漂洗后， 放入 0.25M HCl 中脱嘌呤处理 10min ； 取出凝胶， ddH2O 漂洗， 倒入变形液 ( 配方 ： 0.5M NaOH、 1.5M NaCl)， 摇床震荡 ( 震荡 2 次， 每次 15min) ； 取出 凝胶， ddH2O 漂洗， 倒入中和液 ( 配方 ： 0.5mol/l Tris-Cl、 1.5mol/lNaCl)， 摇床震荡 ( 震荡 2 次， 每次 15min) ； 使用 20SSC 毛细管转移法转膜过夜 (12 小时 ) 至尼龙膜， 取出 100 烘箱中放置 2 小时， 。
23、固定 DNA。 0047 2、 杂交 0048 将 步 骤 1 转 好 的 尼 龙 膜 放 入 10ml 的 预 杂 交 液 ( 配 方 ： 5SSC、 0.02 (0.02g/100ml)SDS、 0.1 (0.1g/100ml) 十二烷基肌氨酸钠、 1 (1g/100ml)Blocking Reagent 中预杂交 2h， DNA 探针 ( 地高辛杂交探针标记 5 -CCCTAAA-3 )100变性后， 和杂 交液 ( 配方 ： 5SSC、 1 (1g/100ml)Blocking Reagent、 0.1 (0.1g/100ml) 十二烷基肌 氨酸钠、 0.02(0.02g/100ml)。
24、SDS、 50(50ml/100ml)甲酰胺)在杂交瓶中混匀后， 42杂 交过夜 (14h 16h) 后回收杂交液。 0049 3、 检测 0050 在洗膜液 1( 配方 ： 2SSC、 0.1 (0.1g/100ml)SDS) 中室温 (25 ) 洗涤 2 次， 每 次 10min。洗涤后， 放在洗膜瓶中用洗膜液 2( 配方 ： 20SSC、 0.1 (0.1g/100ml)SDS) 于 42洗膜2次， 每次15min。 洗膜后ddH2O润洗两遍， 用buffer1(配方 ： 100mM马来酸、 150mM NaCl， pH 7.5) 浸膜 1min。buffer2( 配方 ： 100mM 。
25、马来酸、 150mM NaCl、 1 (1g/100ml) Blocking Reagent， pH 7.5) 中封闭 2h 以上以后， 用 bufffer2( 配方同上 ) 稀释地高辛 抗体Anti-Digoxigenin-AP(稀释体积比1:5000)在水平摇床上洗膜28min。 将膜转入行的 方盒， buffer3( 配方 ： 100mM Tris-Cl、 100mM NaCl、 50mMMgCl2， pH 9.5) 平衡 2min。在膜 上均匀地滴上CDP-Star， 孵育5min后放置于X光片暗盒中显影。 数据采用端粒长度分析软 件 (Telomeric.2 软件 ) 计算限制性片段。
26、 (TRF) 的平均长度 ( 即对应供试人参的端粒限制 性片段长度 )， TRF Ai/ (Ai/Li)， Ai 为 i 点的吸光度值， Li 为 i 点的 Marker 长度。 0051 4、 结果 0052 人参 Southern 杂交结果图如图 1 中 A 所示。经过 Telomeric.2 软件对显影结果 说 明 书 CN 104293955 A 6 5/5 页 7 进行数据采集运算后得到了各供试人参样品的端粒限制性片段长度， 发现人参样品的端粒 限制性片段长度整体上随着年限的增加而增长， 进而以各供试人参样品的年限数值为横坐 标 (x)， 以对应的端粒限制性片段长度 (TRF 值 )。
27、 为纵坐标 (y)， 制作标准曲线， 所得标准曲 线如图 1 中 B 所示。 0053 TRF 长度与三年生及以后的人参年限呈显著正相关， 建立相关数学模型 ( 即如下 式 I 所示标准曲线方程 )， 进而可采用端粒限制性片段长度 (TRF 值 ) 预测人参的年限 ： 0054 y 0.827x+8.231 式 I 0055 式中， x 代表人参年限， y 代表端粒限制性片段长度。 0056 实施例 2、 利用人参端粒长度鉴别人参年限的方法的应用 0057 为了进一步验证， 实施例 1 建立的利用人参端粒长度鉴别人参年限的方法的准确 性， 本发明的发明人采集了不同年限的栽培人参样品， 利用上述建立的评价公式进行人参 年限预测双盲实验。 0058 参照实施例 1 中步骤一至三对已知年限的各人参样品进行端粒限制性片段长度 的测定。将测定结果代入 y 0.827x+8.231， 所得 x 值即为预测年限。 0059 结果如表 3 所示， 表明利用该公式预测人参年限与实际年限相附。 0060 表 3 人参年限预测结果 0061 说 明 书 CN 104293955 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 104293955 A 8 。