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1、(10)申请公布号 CN 104293954 A (43)申请公布日 2015.01.21 CN 104293954 A (21)申请号 201410538032.7 (22)申请日 2014.10.13 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/14(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 河北省食品检验研究院 地址 050091 河北省石家庄市桥西区中华南 大街 537 号 (72)发明人 周巍 张岩 杨岚 李永波 马超峰 李月华 刘涛 刘红冉 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 11350 代理人 汤东凤 (5。
2、4) 发明名称 一种金黄色葡萄球菌的 LAMP 引物及其应用 方法 (57) 摘要 本发明公开了一种金黄色葡萄球菌 LAMP 引 物， 包括两条内引物 (FIP 和 BIP) 和两条外引物 (F3和B3)， 分别为 ： F3 ： 如SEQ ID NO ： 1所示 ； B3 ： 如SEQ ID NO ： 2所示 ； FIP ： 如SEQ ID NO ： 3所示 ； BIP ： 如 SEQ ID NO ： 4 所示。本发明针对金黄色 葡萄球菌特异性的 nuc 基因， 设计了一组引物， 并 应用该引物建立了敏感、 特异的金黄色葡萄球菌 LAMP 检测方法。实验证明， 本发明的 LAMP 检测方 法的。
3、检测灵敏度和检出限是 PCR 方法的 100 倍 ； 可以通过肉眼观察是否产生绿色荧光确定反应是 否发生， 使结果判定简便易行 ； 与 PCR 技术比较省 时省力， 不需要昂贵的仪器和繁琐的电泳分析， 更 适合在基层应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104293954 A CN 104293954 A 1/1 页 2 1. 一种金黄色葡萄球菌的 LAMP 引物， 其特征在于 ： 所述引物为 ： F。
4、3 ： 如 SEQ ID NO ： 1 所示 ； B3 ： 如 SEQ ID NO ： 2 所示 ； FIP ： 如 SEQ ID NO ： 3 所示 ； BIP ： 如 SEQ ID NO ： 4 所示。 2. 一种利用如权利要求 1 所述 LAMP 引物的金黄色葡萄球菌的 LAMP 检测方法， 其特征 在于 ： 所述LAMP检测方法使用的25L反应体系包括 ： 按终浓度计， 20mmol/L的Tris-HCl， pH8.8， 10mmol/L 的氯化钾、 10mmol/L 的硫酸铵、 8mmol/L 的硫酸镁、 0.1 v/v 的 Tween20、 1mol/L 的甜菜碱、 FIP 和 B。
5、IP 各 1.6mol/L、 F3 与 B3 各 0.2mol/L， 1.4mmol/L 的 dNTP ； 8U 的 Bst 大片断 DNA 聚合酶和 1L 的 DNA 模板 ； 将上述反应体系在 62.5恒温反应 45min， 最后在 80下保持 10min 后结束反应。 3. 根据权利要求 2 所述的金黄色葡萄球菌的 LAMP 检测方法， 其特征在于 ： 每次反应设 阴性对照， 用灭菌双蒸水代替 DNA 模板。 4. 根据权利要求 2 所述的金黄色葡萄球菌的 LAMP 检测方法， 其特征在于 ： 反应结束 后， 向各反应小管中加入1L的SYBRGreenI荧光染料， 在自然光下肉眼观察反应。
6、小管混合 液的外观变化， 如果染料颜色由开始的橙色变为绿色， 则检测结果为阳性， 如果保持染料原 有的橙红色， 则检测结果为阴性。 5. 根据权利要求 2 所述的金黄色葡萄球菌的 LAMP 检测方法， 其特征在于 ： 反应结束 后， 产物在1.5琼脂糖凝胶上80V电泳分离50min， 加样量为7L/上样孔 ； 凝胶置于溴化 乙锭中染色 10min， 在凝胶成像系统下检测、 照像， 如出现梯型条带则判断为阳性， 没有出现 梯型条带则判断为阴性。 权 利 要 求 书 CN 104293954 A 2 1/4 页 3 一种金黄色葡萄球菌的 LAMP 引物及其应用方法 技术领域 0001 本发明涉及一。
7、种金黄色葡萄球菌的 LAMP 引物及其应用方法， 用于金黄色葡萄球 菌的检测。 背景技术 0002 金黄色葡萄球菌的实验室检测方法有 ： 传统分离培养及生化鉴定、 免疫检测技术、 分子检测技术等。传统检测方法操作繁琐， 检测时间长， 且灵敏度较低 ； 免疫学方法的特异 性和灵敏度都比较低 ； PCR 方法敏感、 准确、 快速， 但由于该检测方法需要昂贵的仪器设备 和繁琐的电泳操作， 对检测人员有较高的技术要求， 使其难以在基层和检测设备较薄弱的 地区应用， 限制了该方法的普及和推广。 0003 环介导等温扩增 (LAMP) 是一种新的核酸扩增方法， 能够在等温条件下高效扩增 靶基因， 灵敏度和。
8、特异性高。而且， 相比 PCR 需要昂贵的热循环仪， LAMP 只需要很简单的设 备， 如水浴锅即可。 目前LAMP已经广泛应用于病毒、 细菌和寄生虫等病原的检测。 环介导等 温扩增技术的原理是利用 4 个特殊设计的引物和具有链置换活性的 DNA 聚合酶， 在恒温条 件下特异、 高效、 快速地扩增 DNA 的新技术。利用 4 条不同的特异性引物识别靶基因的 6 个 特定区域， 从而保证了其特异性更强、 灵敏度更高， 进而使反应的稳定性和可重复性更好。 具有高特异性和等温快速扩增的特点， 可以在 1h 之内， 将靶 DNA 片段扩增 109 1010倍。 0004 目前国内外还缺少一种有效的金黄。
9、色葡萄球菌的 LAMP 检测方法。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是提供一种金黄色葡萄球菌的 LAMP 引物及其应用方 法， 特异性强且灵敏度高。 0006 为解决上述技术问题， 本发明所采取的技术方案是 ： 0007 一种金黄色葡萄球菌 LAMP 引物， 包括两条内引物 (FIP 和 BIP) 和两条外引物 (F3 和 B3)， 分别为 ： 0008 F3 ： 如 SEQ ID NO ： 1 所示 ； 0009 B3 ： 如 SEQ ID NO ： 2 所示 ； 0010 FIP ： 如 SEQ ID NO ： 3 所示 ； 0011 BIP ： 如 SEQ ID NO ： 4 。
10、所示。 0012 一种利用上述 LAMP 引物的金黄色葡萄球菌的 LAMP 检测方法， 其使用的 25L 反 应体系包括 ： 按终浓度计， 20mmol/L 的 Tris-HCl(pH8.8)， 10mmol/L 的氯化钾、 10mmol/L 的 硫酸铵、 8mmol/L的硫酸镁、 0.1v/v的Tween20、 1mol/L的甜菜碱、 FIP和BIP各1.6mol/ L、 F3 与 B3 各 0.2mol/L， 1.4mmol/L 的 dNTP ； 8U 的 Bst 大片断 DNA 聚合酶和 1L 的 DNA 模 板 ； 将上述反应体系在 62.5恒温反应 45min， 最后在 80下保持 。
11、10min 后结束反应。 0013 每次反应设阴性对照 ( 用灭菌双蒸水代替 DNA 模板 )。 0014 反应结束后， 利用目测和凝胶电泳法检测反应结果。 说 明 书 CN 104293954 A 3 2/4 页 4 0015 目测 ： 反应结束后， 向各反应小管中加入1L(1 ： 1000)的SYBRGreen I荧光染料， 在自然光下肉眼观察反应小管混合液的外观变化， 如果染料颜色由开始的橙色变为绿色， 则检测结果为阳性， 如果保持染料原有的橙红色， 则检测结果为阴性。 0016 凝胶电泳法 ： 反应结束后， 产物在1.5琼脂糖凝胶上80V电泳分离50min， 加样量 为 7L/ 上样孔。
12、。凝胶置于溴化乙锭 (EB) 中染色 10min， 在凝胶成像系统下检测、 照像， 如 出现梯型条带则判断为阳性， 没有出现梯型条带则判断为阴性。 0017 采用上述技术方案所产生的有益效果在于 ： 0018 本发明根据 LAMP 方法的原理， 针对金黄色葡萄球菌特异性的 nuc 基因， 设计了一 组引物， 并应用该引物建立了敏感、 特异的金黄色葡萄球菌 LAMP 检测方法。 0019 本发明的LAMP检测方法的检测灵敏度和检出限是PCR方法的100倍 ； 可以通过肉 眼观察是否产生绿色荧光确定反应是否发生， 使结果判定简便易行 ； 与 PCR 技术比较省时 省力， 不需要昂贵的仪器和繁琐的电。
13、泳分析， 更适合在基层应用。 附图说明 0020 图 1 是实施例 2 中 LAMP 反应结果 ； 图 1 中 ： A 为肉眼观察到的反应结果， B 为紫外 灯下观察到的反应结果 (1、 阴性反应， 2、 阳性反应， 3-5 为检测样品 )。 0021 图 2 是实施例 2 中 LAMP 特异性检测结果 ； 图 2 中 ： M ： marker， 1 ： 阴性对照， 2 ： 金黄 色葡萄球菌， 3 ： 大肠杆菌， 4 ： 无乳链球菌， 5 ： 鼠伤寒沙门氏菌， 6 ： 表皮葡萄球菌。 0022 图 3 是实施例 3 中 LAMP 方法与 PCR 方法灵敏度检测比较结果 ； 图 3 中， A 为。
14、 LAMP 方法灵敏度检测结果 (M ： Marker ； 1 4 ： 103、 102、 101、 阴性对照 )， B 为 PCR 方法灵敏度检测 结果 (M ： Marker ； 1 5 ： 106、 105、 104、 103、 102)。 具体实施方式 0023 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。 0024 本发明各实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。并且各实施 例中所用的材料及试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0025 本发明各实施例中部分材料为 ： Bst大片段DNA聚合酶购于New England Biolabs 公司 ； 甜菜。
15、碱 ( 分析纯 ) 购于 Sigma 公司 ； Tap DNA 聚合酶、 dNTP、 细菌基因组 DNA 提取试剂 盒购于宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ； SYBR Green I 荧光染料、 琼脂糖购于日本 TaKaRa 公 司。 0026 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Sta.aureus ATCC 25923)、 大 肠 杆 菌 (Escherichia coli ATCC 35218)、 无乳链球菌 (Str agalactiae CVCC1886)、 鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium CVCC542) 购 于 中 国 兽 医 微 生 物 菌 种 保。
16、 藏 管 理 中 心 ； 表 皮 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus epidermidis CICC23664) 购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。 0027 本发明各实施例中部分仪器为 ： Thermocell 恒温金属水浴锅 ( 杭州博日科技有限 公司， 中国 ) ； PCR 仪 My cycler(Bio-Rad 公司， 美国 ) ； 核酸通用型电泳仪 JY1000C( 北京 六一仪器公司， 中国 ) ； 电泳槽 DYCP-31DN( 北京六一仪器公司， 中国 ) ； 紫外凝胶成像系统 WD-9413C( 北京六一仪器公司， 中国 )。 0028 实施例 1 ： LAMP。
17、 引物的设计 说 明 书 CN 104293954 A 4 3/4 页 5 0029 引物由宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司合成， 4 条引物序列见表 1。 0030 表 1LAMP 引物序列 0031 0032 实施例 2 ： 引物在金黄色葡萄球菌的 LAMP 检测中的应用 0033 (1) 模板 DNA 制备 ： 将各种菌株培养过夜， 取 1.5mL 菌液用细菌基因组 DNA 提取试 剂盒提取全基因组 DNA， -20保存。 0034 (2) 优化 LAMP 反应体系及反应条件 0035 25LLAMP 反应体系包括 ： 以终浓度计， 20mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、 。
18、10mmol/L KCl、 10mmol/L(NH4)2SO4、 8mmol/L MgSO4、 0.1v/v的Tween20、 1mol/L的甜菜碱、 FIP和BIP 各1.6mol/L、 F3和B3各0.2mol/L、 1.4mmol/L的dNTP ； 8U Bst大片断DNA聚合酶和1L 的 DNA 模板。 0036 反应条件 ： 将上述混合物置于 62.5恒温反应 45min， 最后在 80下保持 10min 结束反应。每次反应设阴性对照 ( 用灭菌双蒸水代替 DNA 模板 )， 严格试验分区， 防止反应 过程中的交叉污染。 0037 (3)LAMP 反应结果检测 ： 0038 肉眼检测。
19、 ： 扩增反应结束后， 观察反应小管混合液的外观变化， 向各反应小管中 加入 1L(1:1000) 的 SYBRGreen I 荧光染料。SYBR Green I 染料与双链 DNA 结合会发绿 色荧光， 所以， 在自然光下肉眼观察， 如果染料颜色由开始的橙色变为绿色， 则说明检测结 果阳性。 0039 肉眼检测结果如图 1 所示 ： 当反应体系中存在靶 DNA 时， LAMP 扩增反应会产生大 量的、 大小不等的含有靶DNA的重复序列， 添加SYBR Green I荧光染料时， 阳性产物由橙色 变绿色， 阴性反应则保持染料原有的橙红色。 0040 凝胶电泳检测 ： 反应结束后， 产物在1.5。
20、琼脂糖凝胶上80V电泳分离50min， 加 样量为 7L/ 上样孔。凝胶置于 EB 中染色 10min， 在凝胶成像系统下检测、 照像， 观察是否 产生 LAMP 反应特有的梯型条带， 即特异性扩增， 如出现梯型条带则判断为阳性， 没有出现 梯型条带则判断为阴性。凝胶电泳检测如图 2 所示， 呈现在凝胶上就是典型的梯型电泳条 带。 0041 本发明检测的特异性 0042 应用本发明的 LAMP 检测方法对金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌、 无乳链球菌、 鼠伤寒 说 明 书 CN 104293954 A 5 4/4 页 6 沙门氏菌及表皮葡萄球菌进行检测， 检测结果如图 2 所示。从图 2 可以看出，。
21、 只有金黄色 葡萄球菌出现阳性结果， 其他菌株为阴性结果直至反应时间延长至 60min。说明本发明的 LAMP 反应体系只对金黄色葡萄球菌有特异性。 0043 实施例 3 ： 本发明的 LAMP 检测方法与 PCR 方法的对比 0044 PCR 引 物 ： 根 据 GenBank 已 发 表 的 编 码 金 黄 色 葡 萄 球 菌 23srRNA 的 DNA 序 列 (S.aureus， X68425.1)， 利 用 Premier5.0 软 件 设 计、 合 成 1 对 引物 (P1 ： 5 -TCTTCAGAAGATGCGGAATA-3， 如 SEQ ID NO ： 5 所示 ； P2 ：。
22、 5 -TAAGTCAAACGTTAACATACG-3， 如 SEQ ID NO ： 6 所示 )， 扩增产物长度为 420bp， 由宝生 物工程 ( 大连 ) 有限公司合成。 0045 PCR 扩增反应体系 ： 10PCR buffer 5L， Mg2+(25mmol/L)3L， dNTP(25mmol/ L)4L， Taq 酶 (2.5U)0.5L， 引物 P1 和 P2 各 1L， 模板 2L， 无菌双蒸水补至 50L。循 环条件 ： 94预变性 2min， 94变性 1min， 56退火 1min， 72延伸 1min， 扩增 30 个循环， 最后 1 个循环于 72延伸 5min。取。
23、 5L 扩增产物， 经 1.5琼脂糖凝胶电泳分析。 0046 LAMP 方法与 PCR 方法检测灵敏度比较 0047 以金黄色葡萄球菌(Sta.aureus ATCC 25923)为检测对象， 测量菌液浓度， 并将菌 液进行 10 倍稀释度稀释， 使得最终稀释梯度为 106、 105、 104、 103、 102、 10CFU/mL， 分别提取 DNA模板， 用于LAMP和PCR扩增反应， 并且比较LAMP方法和PCR方法的检出率、 最低检出限 (CFU/mL)。 检测结果见图3， 从中可见， LAMP反应产物的电泳结果是梯形条带， PCR反应产物 是 420bp 大小的扩增条带 ； LAMP。
24、 检测的最低限是 102CFU/mL， PCR 检测的最低限是 104CFU/ mL。 0048 LAMP 方法和 PCR 方法检测结果评价 0049 用本发明的特异性LAMP引物以及确立的反应条件和程序检测40份乳房炎病牛的 牛奶样本进行金黄色葡萄球菌检测， 通过凝胶电泳检测是否产生 LAMP 反应特有的梯型条 带， 即特异性扩增。并与 PCR 方法比较检出率。 0050 检测结果 ： 本发明的 LAMP 方法的检出率为 100， 最低检出限达到 102CFU/mL ； 而 PCR 方法的检出率是 85， 最低检出限 104CFU/mL。可见 LAMP 方法在保持 100检出率的 同时， 检测灵敏度是 PCR 方法的 100 倍。 说 明 书 CN 104293954 A 6 1/2 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 104293954 A 7 2/2 页 8 序 列 表 CN 104293954 A 8 1/1 页 9 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104293954 A 9 。