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1、(10)申请公布号 CN 104093741 A (43)申请公布日 2014.10.08 CN 104093741 A (21)申请号 201280024485.7 (22)申请日 2012.03.09 FERMBP-11446 2011.02.18 FERMBP-11447 2011.12.28 FERMBP-11448 2011.12.28 FERMBP-11449 2011.12.28 2011-062686 2011.03.22 JP C07K 16/28(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 7/02(2006.01) A61P 9/00(2006.。
2、01) A61P 9/10(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/04(2006.01) A61P 43/00(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/09(2006.01) C12P 21/08(2006.01) (71)申请人 公益财团法人癌研究会 地址 日本东京都 (72)发明人 藤田直也 中泽侑也 高木聪 (74)专利代理机构 北京尚诚知识产权代理有限 公司 11322 代理人 龙淳 (54) 发明名称 小鼠抗 Aggrus 单克隆抗体 (57) 摘要 本发明提供识别由序列号 1、 3 或 4 所示的 氨基酸序列构成的。
3、 Aggrus 的抗原决定簇的小鼠 单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段、 由 保 藏 号 FERM BP-11446、 FERM BP-11447、 FERM BP-11448或FERM BP-11449的杂交瘤产生的单克 隆抗体或其功能性片段。 本发明提供上述杂交瘤、 包含上述单克隆抗体或由其功能性片段构成的片 段的 Aggrus-CLEC-2 结合抑制剂、 以及用于抑制 血小板凝集或抑制癌转移或者处置肿瘤或血栓病 的医药组合物。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2013.11.20 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/JP2012/056142 2012.。
4、03.09 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2012/128082 JA 2012.09.27 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 11 页 序列表 2 页 附图 17 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书11页 序列表2页 附图17页 (10)申请公布号 CN 104093741 A CN 104093741 A 1/1 页 2 1. 一种小鼠单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段， 其特征在于 ： 其识别由序列号 1、 3 或 4 所示的氨基酸序列构成的 Aggrus 的抗原决定簇。 2. 如权利要。
5、求 1 所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段， 其特征在于 ： 其是由保藏号为FERM BP-11446、 FERM BP-11447、 FERM BP-11448或FERM BP-11449的 杂交瘤产生的。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段， 其特征在于 ： 其被人化。 4. 保藏号为 FERM BP-11446、 FERM BP-11447、 FERM BP-11448 或 FERM BP-11449 的杂 交瘤。 5. 一种 Aggrus-CLEC-2 结合抑制剂， 其特征在于 ： 其包含权利要求 1 3 中任一项所述的单克隆抗体或由其功能。
6、性片段构成的片段。 6. 一种医药组合物， 其用于抑制血小板凝集或抑制癌转移、 或者处置肿瘤或血栓病， 该 医药组合物的特征在于 ： 包含权利要求 1 3 中任一项所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段。 7. 如权利要求 6 所述的医药组合物， 其特征在于 ： 血栓病为脑梗塞或心肌梗塞。 8. 如权利要求 6 所述的医药组合物， 其特征在于 ： 癌或肿瘤为鳞状细胞癌、 纤维肉瘤、 间皮瘤、 卡波氏肉瘤、 睾丸肿瘤、 脑肿瘤或膀胱癌。 9. 如权利要求 8 所述的医药组合物， 其特征在于 ： 癌或肿瘤为鳞状细胞癌、 间皮瘤、 睾丸肿瘤或膀胱癌。 权 利 要 求 书 CN 104093741。
7、 A 2 1/11 页 3 小鼠抗 Aggrus 单克隆抗体 技术领域 0001 本发明涉及小鼠抗 Aggrus 单克隆抗体。 背景技术 0002 血小板凝集诱导因子 Aggrus（已知作为 podoplanin， gp44 等） 为 I 型膜贯通蛋 白质， 公开了在鳞状细胞癌、 间皮瘤、 卡波氏肉瘤、 睾丸肿瘤和脑肿瘤等各种各样类型的癌 症中表达增加 （非专利文献 1 9） 。有报告指出 ： Aggrus 的过量表达与预后不良有关， 暗 示 Aggrus 对癌演进的重要的作用 （非专利文献 10、 11） 。已知 Aggrus 的表达引起血小板凝 集， 会促进小鼠的实验的自发肺转移 （非专利。
8、文献 11、 12） 。有文献认为导入抑制血小板凝 集的点突变， 会减弱肺转移的形成， 因此 Aggrus 的血小板凝集诱导活性与转移形成直接相 关 （非专利文献 11、 12） 。癌细胞诱导血小板凝集， 被认为形成大的癌 - 血小板凝集， 会造成 在微小血管体系中的癌细胞的栓塞形成增大， 保护循环中不受免疫学的攻击。最近， 将血 小板上表达的 C 型凝集素样受体 （CLEC-2） 特别规定为 Aggrus 的配对受体 （Counterpart receptor） 中的一种。已知当 CLEC-2 与在肿瘤细胞上表达的 Aggrus 结合， 即使没有血浆 成分， 也会在血小板发出活化信号， 成为。
9、血小板凝集的诱因。相互识别地确定的 Aggrus 和 CLEC-2 的区域已经已知 （非专利文献 13） 。 0003 单克隆抗体能够与细胞表面抗原牢固地特异性结合， 能够在靶细胞引发免疫学上 的应答。因此， 现在， 许多单克隆抗体用于癌症治疗。癌症治疗中使用的单克隆抗体通过中 和、 抗体依赖性细胞毒性 （antibody-dependent cellular cytotoxicity ： ADCC） 和补体依 赖性细胞毒性 （complement-dependent cytotoxicity ： CDC） 的 3 个代表性作用方式显示抗 癌效果。以贝伐单抗 （Bevacizumab） 、 西。
10、妥昔单抗 （Cetuximab） 为代表的那样， 抗体能够抑 制配体 - 受体结合或受体多聚体化、 中和信号通路的活化。癌细胞的增殖依赖于信号通路 的活化， 因此， 通过其中和导致细胞死亡。另一方面， 以利妥昔单抗 （Rituximab） 或曲妥珠 单抗 （Trastuzumab） 为代表的那样， 抗体能够通过其的 Fc 区诱导对于靶标癌细胞的免疫应 答。巨噬细胞、 NK 细胞和中性粒细胞等效应细胞和补体识别与癌特异性抗原结合的抗体的 Fc 区， 其结果杀死靶标癌细胞。这三个作用方式， 通过抗体的同型或亚类、 抗原的特征或识 别部位进行规定。 0004 至此， 确定了对Aggrus的多个抗体，。
11、 但是， 其大部分是不能干涉Aggrus-CLEC-2的 相互作用的抗体。被命名为 NZ-1 的大鼠抗体， 已知作为能够抑制 Aggrus-CLEC-2 的相互作 用和血小板凝集的 Aggrus 抗体 （非专利文献 14） ， 但是由于种的屏障 （barrier） 的原因， 存 在用通常使用的小鼠的癌模型无法准确地调查等的问题。 0005 现有技术文献 0006 非专利文献 0007 非专利文献1 ： Kato Y,Kaneko M,Sata M,Fujita N,Tsuruo T,Osawa M.Enhanced expression of Aggrus(T1/podoplanin),a p。
12、latelet-aggregation-inducing factor in lung squamous cell carcinoma.Tumor Biol2005;26:195-200. 说 明 书 CN 104093741 A 3 2/11 页 4 0008 非专利文献2 ： Martin-Villar E,Scholl FG,Gamallo C et al.Characterization of human PA2.26 antigen(T1-2,podoplanin),a small membrane mucin induced in oral squamous cell carcin。
13、omas.Int J Cancer 2005;113:899-910. 0009 非 专 利 文 献 3 ： Yuan P,Tenam S,EI-Naggar A et al.Overexpression of podoplanin in oral cancer and its association with poor clinical outcome. Cancer2006;107:563-569. 0010 非专利文献 4 ： Wicki A.Lehembre F,Wick N,Hantusch B,Kerjaschki D.Christofori G.Tumor invasion in。
14、 the absence of epithelial-mesenchymal transition:podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton.Cancer Cell 2006;9:261-272. 0011 非专利文献5 ： Kimura N,Kimura I.Podoplanin as a marker for mesothelioma. Pathol Int 2005;55:83-86. 0012 非专利文献6 ： Fukunaga M.Expression of D2-40 in lymphatic endothel。
15、ium of normal tissues and in vascular tumours.Histopathology 2005;46:396-402. 0013 非 专 利 文 献 7 ： Kato Y,Sasagawa I,Kaneko M,Osawa M,Fujita N,TsuruoT. Aggrus:a diagnostic marker that distinguishes seminoma from embryonal carcinoma in testicular germ cell tumors.Oncogene2004;23:8552-8556. 0014 非专利文献8 。
16、： Mishima K,Kato Y,Kaneko MK et al.Podoplanin expression in primary central nervous system germ cell tumors:a useful histological marker for the diagnosis of germinoma.Acta Neuropathol 2006;111:563-568. 0015 非专利文献9 ： Mishima K,Kato Y,Kaneko MK,Nishikawa R,Hirose T,Matsutani M.Increased expression of。
17、 podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression,Acta Neuropathol2006;111:483-488. 0016 非 专 利 文 献 10 ： Yuan P,Teman S,EL-Naggar A,Zhou X,Liu DD,Lee JJ,Mao L,Overexpression of podoplanin in oral cancer and its association with poor clinical outcome.Cance。
18、r.2006;107:563-569. 0017 非专利文献11 ： Kunita A.Kashima TG,Morishita Y,Fukayama M,Kato Y,Tsuruo T,Fujita N,The platelet aggregation-inducing factor aggrus/podoplanin promotes pulmonary metastasis.Am J Pathol.2007;170:1337-1347. 0018 非专利文献 12 ： Kato Y,Fujita N,Kunita A,Sato S,Kaneko M,Osawa M,Tsuruo T.Mo。
19、lecular identifi cation of Aggrus/T1alpha as a platelet aggregation-inducing factor expressed in colorectal tumors.J Biol Chem.2003;278:51599-51605. 0019 非专利文献 13 ： Kato Y,Kaneko MK,Kunita A et al.Molecular analysis of the pathophysiological binding of the platelet aggregation-inducing factor podopl。
20、anin to the C-type lectin-like receptor CLEC-2.Cancer Sci2008;99:54-61. 0020 非 专 利 文 献 14 ： Kato Y,Kaneko MK,Kuno A et al.Inhibition of tumor cell-induced platelet aggregation using a novel anti-podoplanin antibody reacting with its platelet-aggregation-stimulating domain.Biochem Biophys Res Commun2。
21、006;349:1301-1307. 说 明 书 CN 104093741 A 4 3/11 页 5 发明内容 0021 发明所要解决的课题 0022 本发明的课题在于提供一种将 Aggrus 作为靶标用于处置癌症和血栓病的医药组 合物。 0023 用于解决课题的方法 0024 本发明的发明人等进行了潜心研究的结果， 构建了产生能够抑制 Aggrus-CLEC-2 相互作用和血小板凝集的单克隆抗体的杂交瘤。发现从该杂交瘤产生的抗体， 显示出识别 由序列号 1（Pro Gly Ala Glu Asp Val Val Thr） 、 序列号 3（Pro Gly Thr Ser Glu Asp） 或序。
22、列号 4（Pro Gly Thr Ser Glu Asp Arg Tyr Lys） 所示的氨基酸序列构成的 Aggrus 的抗原决定簇 （epitope） 、 依赖于浓度地抑制 Aggrus-CLEC-2 的结合、 抑制血小板凝集和抑 制癌的肺转移的效果， 从而完成了本发明。 0025 即， 本发明提供一种小鼠单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段 （1） ， 其识别由 序列号 1、 3 或 4 所示的氨基酸序列构成的 Aggrus 的抗原决定簇。 0026 另外， 本发明提供上述 （1） 所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段 （2） ， 其是由保藏号FERM BP-11446、 FERM。
23、 BP-11447、 FERM BP-11448或FERM BP-11449的杂交瘤 产生的。 0027 此外， 本发明还提供上述 （1） 或 （2） 所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的 片段 （3） ， 其被人化。 0028 本发明提供保藏号 FERM BP-11446、 FERM BP-11447、 FERM BP-11448 或 FERM BP-11449 的杂交瘤 （4） 。 0029 本发明提供一种 Aggrus-CLEC-2 结合抑制剂 （5） ， 其包含上述 （1） （3） 中任一项 所述的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段。 0030 本发明提供一种医药组合物 （6） ，。
24、 其用于抑制血小板凝集或抑制癌转移或者处置 肿瘤或血栓病， 该医药组合物包含上述 （1） （3） 中任一项所述的单克隆抗体或由其功能 性片段构成的片段。 0031 此外， 本发明还提供上述 （6） 所述的医药组合物 （7） ， 其中， 血栓病为脑梗塞或心 肌梗塞。 0032 此外， 本发明提供一种上述 （6） 所述的医药组合物 （8） ， 其中， 癌或肿瘤为鳞状细 胞癌、 纤维肉瘤、 间皮瘤、 卡波氏肉瘤、 睾丸肿瘤、 脑肿瘤或膀胱癌。 0033 优选本发明提供上述 （8） 所述的医药组合物 （9） ， 其中， 癌或肿瘤为鳞状细胞癌、 间皮瘤、 睾丸肿瘤或膀胱癌。 0034 发明的效果 003。
25、5 由本发明的发明人等构建的杂交瘤产生的被命名为 P2-0、 MS-1、 MS-3、 MS-4 的小 鼠单克隆抗体， 通过体内 （in vivo） 和体外 （in vitro） 分析可知， 识别由序列号 1、 3 或 4 所 示的氨基酸序列构成的 Aggrus 的抗原决定簇， 浓度依赖性地抑制 Aggrus-CLEC-2 的结合。 此外， 本申请发明的单克隆抗体还显示血小板凝集抑制效果和癌的肺转移抑制效果。本申 请发明的单克隆抗体的人化抗体 （人型嵌合抗体） 在 Aggrus 低表达细胞中也显示癌转移抑 制效果。 本申请发明的单克隆抗体， 相比于已知的大鼠的单克隆抗体， 对生物体内表达的天 说。
26、 明 书 CN 104093741 A 5 4/11 页 6 然 （native） 的 Aggrus 的反应性不同， 能够以更低的浓度抑制 Aggrus 依赖性的肺转移， 得 到难以预料的效果。 此外， 本申请发明的单克隆抗体识别各种不同的抗原决定簇， 具有即使 在癌中频发的耐性变异等产生的情况下也能够使用其他抗体来克服的可能性高的巨大优 点。 本申请发明的单克隆抗体为小鼠单克隆抗体， 因此， 在抗癌剂的研发过程中通用的移植 了人癌的小鼠模型 （小鼠荷瘤模型） 中， 不需要像大鼠抗体这样考虑种的屏障。通常， 虽然通 过将CDR与小鼠抗体的Fc区结合， 从大鼠抗体也能够制作小鼠嵌合抗体， 但是，。
27、 该小鼠嵌合 抗体的产生需要在 CHO 细胞等抗体产生细胞中将嵌合抗体表达载体进行基因导入而产生， 在小鼠嵌合抗体的大量纯化中与在小鼠腹水中产生小鼠抗体的情况相比不经济且不实用。 因此， 本申请发明的小鼠单克隆抗体， 例如， 在使用人癌的小鼠荷瘤模型的医药组合物的开 发中具有特别的便利性。 附图说明 0036 图 1 为表示使用 P2-0 抗体的合成肽进行的识别抗原决定簇的筛选的图。 0037 图 2 为表示 P2-0 抗体以浓度依赖性的方式抑制 Aggrus-CLEC-2 相互作用的图。 0038 图 3 为表示 P2-0 抗体具有血小板凝集抑制效果的图。 0039 图 4 为表示 P2-0。
28、 抗体具有癌的肺转移抑制效果的图。 0040 图 5 为表示人化 P2-0 抗体 （人型嵌合 P2-0 抗体） 具有血小板凝集抑制效果的图。 0041 图 6 为表示人化 P2-0 抗体 （人型嵌合 P2-0 抗体） 具有癌的肺转移抑制效果的图。 0042 图 7 为表示人化 P2-0 抗体 （人型嵌合 P2-0 抗体） 在 Aggrus 低表达细胞 （HT1080 细胞） 中也具有肺转移抑制效果的图。 0043 图 8 为表示 P2-0 抗体识别在人膀胱癌细胞膜表面表达的 Aggrus 的蛋白质印迹法 分析的图。 0044 图 9 为表示 NZ-1 抗体和 P2-0 抗体对 Aggrus 识。
29、别能力的差异的蛋白质印迹法分 析的图。 0045 图 10A 为表示 NZ-1 抗体 （图 10A） 和 P2-0 抗体 （图 10B） 对 Aggrus 识别能力的差 异的 FACS 法中 NZ-1 抗体的解析结果的图。 0046 图 10B 为表示 NZ-1 抗体 （图 10A） 和 P2-0 抗体 （图 10B） 对 Aggrus 识别能力的差 异的 FACS 法中 P2-0 抗体的解析结果的图。 0047 图 11 为表示 NZ-1 抗体和 P2-0 抗体的癌的肺转移抑制效果的差异的图。 0048 图 12 为通过使用导入了人 Aggrus 基因的 CHO 细胞株的流式细胞仪解析来确认。
30、 MS-1、 MS-3 和 MS-4 抗体识别人 Aggrus 的图。 0049 图 13 为表示使用丙氨酸变异型 Aggrus 蛋白质的 P2-0、 MS-1、 MS-3 和 MS-4 抗体的 识别抗原决定位置的筛选的图。 0050 图 14 为使用表面等离子体共振测定 P2-0、 MS-1、 MS-3 和 MS-4 对抗体重组人 Aggrus 蛋白质的结合度的图。 0051 图 15 为表示 P2-0、 MS-1、 MS-3 和 MS-4 抗体抑制 Aggrus-CLEC-2 相互作用的图。 0052 图 16 为表示 P2-0、 MS-1、 MS-3 和 MS-4 抗体具有血小板凝集抑制。
31、效果的图。 0053 图 17 为表示 MS-1 抗体对人 Aggrus 表达细胞发挥抗肿瘤活性的图。 0054 图 18 为 MS-1 抗体抑制人 Aggrus 表达细胞向肺的自然转移的图。 说 明 书 CN 104093741 A 6 5/11 页 7 0055 图 19 为表示 MS-1 和 MS-3 抗体具有人 Aggrus 表达细胞的肺转移抑制效果的图。 具体实施方式 0056 Aggrus 作为 gp44、 podoplanin 等已知。 0057 “抗 Aggrus 单克隆抗体” 是指与 Aggrus 特异性结合的单克隆抗体或衍生物， 也包 括与原来的抗体显示实质上相同的抗原特异。
32、性的该抗体的片段 （本说明书中称为 “功能性 片段” ） 。抗体的功能性片段包括 Fab、 Fab 、 F(ab )2、 单链抗体 （scFv） 、 二硫化物稳定化 V 区片段 （dsFv） 或者包含CDR的肽等的抗体的功能性片段等。 本发明的抗体， 如以下所详述， 能够通过包括对动物优选对小鼠进行免疫、 为了与适当的细胞融合来制作杂交瘤而回收脾 脏细胞的步骤的现有的方法制作。 0058 作为对于 Aggrus 的小鼠单克隆抗体的优选例子， 可以列举由国家高级工业科学 技术学院国际专利生物保藏中心 （IPOD ； 日本3058566茨城县筑波市东1丁目1番地1中 央第 6） 中作为保藏号 FE。
33、RMBP-11446 于 2011 年 2 月 18 日保藏的杂交瘤、 以及作为保藏号 FERMBP-11447、 FERM BP-11448 和 FERM BP-11449 在上述 IPOD 中于 2011 年 12 月 28 日保 藏的杂交瘤产生的单克隆抗体。此外， 具有与其同等的结合特性的其他抗体也优选作为本 发明的抗 Aggrus 单克隆抗体。 0059 将人以外的动物的抗体利用基因重组技术制成的人型嵌合抗体或者人型 CDR 移 植抗体等人化抗体也能够在本发明中有利地使用。所谓人型嵌合抗体是指抗体的可变区 （以下， 记为 V 区） 为人以外的动物抗体， 恒定区 （以下， 记为 C 区）。
34、 为人抗体的抗体 （Morrison S.L.et al.,Proc Natl Acad Sci USA.81(21),6851-6855,1984） ， 作为人型CDR移植抗体， 是将人以外的动物的抗体的 V 区中的 CDR 的氨基酸序列移植到人抗体的合适位置的抗体 （Jones P.T.et al.Nature,321(6069),522-525,1986） 。将人化抗体对人进行给药的情况 下， 与人以外的动物的抗体相比， 副作用小， 能够长时间持续其治疗效果。 另外， 人化抗体能 够利用基因重组技术， 作为各种形态的分子制作。 0060 在其他方式中， 本发明提供包含本发明的单克隆抗体或。
35、由其功能性片段构成的片 段的 Aggrus-CLEC-2 结合抑制剂、 以及用于抑制血小板凝集或抑制癌转移或者处置肿瘤或 血栓病的包含本发明的单克隆抗体或由其功能性片段构成的片段的医药组合物， 血栓病优 选为脑梗塞或心肌梗塞。 癌或肿瘤优选为鳞状细胞癌、 纤维肉瘤、 间皮瘤、 卡波氏肉瘤、 睾丸 肿瘤、 脑肿瘤或膀胱癌。其中， 本说明书中的 “癌” 和 “肿瘤” 作为具有相同意义的用语使用。 0061 本发明的医药组合物的剂型的种类， 例如可以列举作为口服剂的片剂、 粉末剂、 丸 剂、 散剂、 颗粒剂、 细粒剂、 软 / 硬胶囊剂、 薄膜包衣剂、 小丸剂、 舌下片、 膏剂等， 作为非口服 剂，。
36、 可以列举注射剂、 栓剂、 经皮剂、 软膏剂、 硬膏剂、 外用液剂等， 本领域的技术人员能够对 应给药路径和给药对象等选择适当的剂型。作为有效成分的抗 Aggrus 单克隆抗体， 在制剂 中可以含有 0.1 到 99.9 重量 %。 0062 本发明的药剂的有效成分的给药量， 根据给药对象、 对象脏器、 症状、 给药方法等 不同而存在差异， 但是口服给药的情况下， 通常， 例如， 对患者 （60kg） 一天约为 0.1g 1000mg， 优选约为 1.0g 100mg， 更优选约为 1.0mg 50mg。非口服给药的情况下， 其 一次给药量随着给药对象、 对象脏器、 症状、 给药方法等的不同而。
37、不同， 例如， 以注射剂的方 式通常例如， 对患者 （60kg） 一天将约 0.01 到 30mg 左右、 优选约 0.1 到 20mg 左右、 更优选 说 明 书 CN 104093741 A 7 6/11 页 8 0.1 10mg 左右通过静脉注射给药。然而， 最终可以考虑剂型的种类、 给药方法、 患者的年 龄和体重、 患者的症状等， 通过医生或者兽医的判断进行确定。 0063 以下， 列举实施例， 更详细说明本发明。 0064 实施例 1 0065 小鼠抗人 Aggrus 单克隆抗体产生杂交瘤的制作 0066 免疫原 0067 对人 Aggrus cDNA 的 TT679 部位 （位置 。
38、38 51 的 14 个的氨基酸 （序列号 2 ： Glu Gly Gly Val Ala Met Pro Gly Ala Glu Asp Asp Val Val） 进行克隆， 在 pGEX-6P-3 载体 （GE Healthcare、 英国白金汉郡） 上反复进行 8 次连接 （TT679-repeat） 。用该载体转化大 肠杆菌 BL21（Invitrogen、 加利福尼亚州卡尔斯巴德市） ， 接着， 利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶 （Glutathione Sepharose， GE Healthcare） 纯化带有 GST 标签 （tag） 的重组蛋白质。 0068 致敏 0069 使用弗氏完。
39、全佐剂 （Freund s complete adjuvant， Difco Laboratories， 密歇 根州底特律） 对 6 周龄的雌性 BALB/c 小鼠 （由日本 Charles River 株式会社购入， 按照常规 方法饲养培育） 在颈部皮下将上述得到的免疫原进行给药。通过隔周的腹腔内给药， 进行追 加免疫。 0070 杂交瘤构建 0071 按照常规方法， 采集脾脏细胞， 使用聚乙二醇 4000（Merck、 新泽西州） 与小鼠骨髓 瘤细胞 P3U1 融合。用包含次黄嘌呤、 氨基蝶呤、 胸腺嘧啶核苷的 RPMI 1640 培养基 （Sigma） 增殖， 选择杂交瘤。其结果， 构建。
40、出 15 克隆的杂交瘤。 0072 实施例 2 0073 小鼠抗人 Aggrus 单克隆抗体的分析 0074 利用蛋白质印迹法的验证 0075 2011 年 2 月 18 日， 将从上述得到的杂交瘤得到的抗体中产生称为 P2-0 的抗 体的杂交瘤保藏在国家高级工业科学技术学院 国际专利生物保藏中心， 保藏号为 FERM BP-11446（与保藏号 FERM P-22069 相同） 。P2-0 抗体通过流式细胞仪和蛋白质印迹分析， 显示识别人 Aggrus。并且， 制作序列号 2 所示的氨基酸序列缺失的 Aggrus 变异体， 进行蛋 白质印迹分析， 结果 P2-0 抗体不能识别该 Aggrus。
41、 变异体。 0076 实施例 3 0077 抗原决定簇的探索 0078 如图 1 所示， 化学合成各种各样的肽， 通过 ELISA 方法研究 P2-0 抗体对它们的反 应性。其结果， 对具有位置 44 52 的氨基酸序列 （序列号 1） 的肽显示高的反应性。 0079 实施例 4 0080 Aggrus-CLEC-2 结合抑制试验 0081 使用从哺乳动物细胞纯化的重组 Aggrus 蛋白质和 CLEC-2 蛋白质， 通过 ELISA 方 法检测 Aggrus-CLEC-2 相互作用。调查对在 Aggrus 抗体的存在下的相互作用的影响。如 图 2 所示， 发现 P2-0 抗体以浓度依赖性的方。
42、式抑制 Aggrus-CLEC-2 相互作用。 0082 实施例 5 0083 血小板凝集抑制试验 说 明 书 CN 104093741 A 8 7/11 页 9 0084 CHO 细胞和 CHO/mock 细胞已知不会引起血小板凝集， 而表达 Aggrus 的 CHO/ Aggrus细胞引起血小板凝集。 在利用光线透过率的监测的in vitro血小板凝集分析中， 比 较从反应开始时刻到最大的一半的值的时刻的时间。如图 3 所示， 通过添加 P2-0 抗体， 发 现通过 Aggrus 的血小板凝集以浓度依赖性的方式被延迟。 0085 实施例 6 0086 肺转移抑制试验 0087 静脉注射后，。
43、 研究抗体对于导入了人 Aggrus 基因的 CHO 细胞株在 in vivo 的实验 的肺转移的影响。CHO 细胞已知通过 Aggrus 的强制表达而成为转移性的。如图 4 所示可 知， P2-0 抗体即使以 0.1g/ 只的非常少量也显示出非常强的肺转移抑制效果， P2-0 抗体 不仅显示 Aggrus 中和活性， 而且显示抑制 Aggrus 依赖性的血行性转移。 0088 实施例 7 0089 人化抗体的制作和验证 0090 为了能够实用， 克隆P2-0抗体的Aggrus识别可变区， 按照常规方法制作整合入人 IgG 的恒定区中的人化 P2-0 抗体 （人型嵌合 P2-0 抗体） 。确认。
44、了该人化 P2-0 抗体， 识别猴 Aggrus。并且， 也确认到该人化 P2-0 抗体， 与原来的 P2-0 抗体同样显示血小板凝集抑制活 性 （图 5） 和癌的转移抑制效果 （图 6） 。该人化 P2-0 抗体， 如图 7 所示， 对 Aggrus 低表达细 胞 （HT1080 细胞） 也显示癌转移抑制效果。 0091 实施例 8 0092 Aggrus 相关癌的探索和大鼠抗 Aggrus 抗体 （NZ-1 抗体） 的比较 0093 本发明的发明人等还以由膀胱癌的临床样本得到的 cDNA （Origene 公司在市场上 出售的 TissueScan cDNA Panel） 作为模板通过实时。
45、 PCR 法， 发现 Aggrus 在膀胱癌中也高 频度地表达亢进。 0094 在此， 通过蛋白质印迹法， 研究在人膀胱癌中表达的 Aggrus 的由 P2-0 抗体的识 别。如图 8 所示， 可知 P2-0 抗体识别在各种人膀胱癌细胞膜表面表达的 Aggrus （泳道 2 5） ， 相对于此， 市售的 D2-40 抗体 （小鼠抗人 Aggrus 单克隆抗体） 只识别导入了人 Aggrus 基 因的 CHO 细胞株 （泳道 1） ， 而不能识别在人膀胱癌细胞膜表面表达的 Aggrus。另外， 将导入 了人Aggrus基因的CHO细胞株和各种人膀胱癌细胞株， 在作为蛋白质分解酶的胰蛋白酶处 理的。
46、条件下 （图 9 ： 泳道 7 9） 或者无胰蛋白酶处理的条件下 （图 9 ： 泳道 12 15） 回收， 将 其细胞溶解液进行SDS-PAGE， 用P2-0抗体、 NZ-1抗体和用于确认蛋白质电泳量的肌动蛋白 抗体进行蛋白质印迹分析。其结果， 如图 9 所示， P2-0 抗体识别在人膀胱癌细胞膜表面表 达的 Aggrus 蛋白质， 但是 NZ-1 抗体只能识别导入了人 Aggrus 的 CHO 细胞表达的 Aggrus （图 9 ： 泳道 6） ， 不能够识别在人膀胱癌细胞膜表面表达的野生型 Aggrus。 0095 根据本研究， 实际证明了 P2-0 抗体与目前已知的抗人 Aggrus 抗。
47、体 （包括 NZ-1） 比 较， 对在生物体中表达的天然的Aggrus反应性强， 暗示P2-0抗体是能够识别多种癌中表达 的 Aggrus 的抗体。因此， 表明 P2-0 抗体在将 Aggrus 作为靶标的使用中， 具有更优异的效 果。 0096 而且， 通过 FACS 法， 再现了上述蛋白质印迹分析的结果。具体来说， 仅用不含作为 蛋白质分解酶的胰蛋白酶的 EDTA 对人膀胱癌细胞株 T24 进行细胞回收， 对该细胞， 分别使 用 NZ-1 抗体或作为其对照抗体大鼠抗体在 4反应 1 小时。用 PBS 清洗过剩的抗体， 之后， 说 明 书 CN 104093741 A 9 8/11 页 10。
48、 作为 2 次抗体使 Alexa488 标记的抗大鼠 IgG 抗体在 4反应 1 小时。用 PBS 清洗过剩的抗 体， 之后， 用 Beckman Coulter 公司的 Cytomics FC500 流式细胞仪进行分析。结果示于图 10A。 0097 另一方面， 对上述回收的人膀胱癌细胞株 T24， 分别使各个 P2-0 抗体或者作为其 对照抗体的小鼠抗体在 4反应 1 小时。用 PBS 清洗过剩的抗体， 之后， 作为 2 次抗体使 Alexa488 标记的抗小鼠 IgG 抗体在 4反应 1 小时。用 PBS 清洗过剩的抗体， 同样， 用流式 细胞仪进行分析。结果示于图 10B。如图 10A。
49、 和图 10B 所示， NZ-1 抗体未能识别人膀胱癌 细胞株 T24 中表达的 Aggrus， 而 P2-0 抗体能够识别。 0098 比较 P2-0 抗体和 NZ-1 抗体对于导入了人 Aggrus 基因的 CHO 细胞株在 in vivo 的实验的肺转移的作用。如图 11 所示可知， P2-0 抗体即使以每一只小鼠给药 0.01g、 0.001g 这样非常少的量， 与对照抗体给药组比较， 还是能够显示显著的肺转移抑制效果， 但是， NZ-1 抗体以 0.1g/ 只显示显著的转移抑制效果， 以 0.01g/ 只、 0.001g/ 只这样 非常少的量就无法显示显著的抑制效果。因此可知， P2-0 抗体与 NZ-1 抗体比较， 具有强的 血行性转移抑制活性。因此， 发现 P2-0 抗体为在 Aggrus 识。