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1、(10)申请公布号 CN 103966193 A (43)申请公布日 2014.08.06 CN 103966193 A (21)申请号 201310731604.9 (22)申请日 2013.12.27 C12N 9/88(2006.01) C12N 15/60(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A61K 8/66(2006.01) A61Q 17/04(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 安徽邦业生物工程有限公司 地址 230000 安徽省合肥市包河区太湖西路 徽商望湖苑 5 幢 1604 室。
2、 (72)发明人 李旭 沈辉 王虹 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 11350 代理人 汤东凤 (54) 发明名称 钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶 及其应用。 该CPD光修复酶具有SEQIDNO:2所示的 多肽序列， 或在 SEQIDNO:2 所示氨基酸序列中包 含取代和/或缺失和 / 或添加 1 10 个氨基酸残 基所形成的具有 CPD 光修复酶活性的多肽序列。 而用以编码所述钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶的多聚 核苷酸可具有 SEQIDNO:1 所示的核苷酸序列， 或 者与 SEQIDN。
3、O:1 所示核苷酸序列有 90% 以上同源 性且能够编码光修复酶活性蛋白的核苷酸序列。 本发明优化并首次人工合成了适于原核表达的钝 顶螺旋藻 CPD 光修复酶基因， 并成功将其克隆到 表达载体中， 获得大量钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶， 当将该 CPD 光修复酶应用到化妆品、 生物医药等 相关领域时， 能够主动修复由紫外线引起的皮肤 病症， 产生巨大社会效益和经济价值， 意义重大。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 附图3页 (10)申请公布号 CN 10396619。
4、3 A CN 103966193 A 1/1 页 2 1. 一种钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶， 其特征在于， 它具有 SEQ ID NO:2 所示的多肽序列， 或在 SEQ ID NO:2 所示氨基酸序列中包含取代和 / 或缺失和 / 或添加所形成的具有 CPD 光 修复酶活性的多肽序列。 2. 如权利要求 1 所述的钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶， 其特征在于， 它具有在 SEQ ID NO:2 所示氨基酸序列中取代和 / 或缺失和 / 或添加 1 10 个氨基酸残基所形成的多肽序列。 3. 编码权利要求 1-2 中任一项所述钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶的多聚核苷酸。 4. 如权利要求 3 所。
5、述的多聚核苷酸， 其特征在于， 具有 SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序 列， 或者与SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列有90% 以上同源性且能够编码光修复酶活性蛋白 的核苷酸序列。 5. 导入了权利要求 3-4 中任一项所述多聚核苷酸的原核或真核表达载体。 6. 权利要求 5 所述的表达载体， 其特征在于， 所述表达载体中还导入了选择性标记基 因。 7. 权利要求 6 所述的表达载体， 其特征在于， 所述选择性标记基因包括 ： 可在表达菌株 中产生颜色变化的酶的基因、 或发光化合物的基因、 或具有抗生素标记物的基因、 或具有营 养缺陷抗性的基因。 8.包含权利要求3-4中任一项所述多。
6、核苷酸或权利要求5-7中任一项所述表达载体的 宿主细胞。 9. 权利要求 1-2 中任一项所述钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶在制备防晒产品中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103966193 A 2 1/8 页 3 钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶及其应用 0001 技术领域 0002 本发明具体涉及钝顶螺旋藻 （Spirulina platensis） 中 CPD 光修复酶、 其优化后 的编码基因， 以及钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶的 DNA 损伤修复活性， 涉及生物学领域。 0003 背景技术 0004 对每一种生物而言， 基因组的准确和完整都是保证其自身存活及机体功能正常执 行的重要基础。。
7、源于生物体内部及外界环境的基因毒性物质侵害、 DNA 复制过程中发生的 各类错误以及DNA自身固有生化性质导致的不稳定， 每个细胞每天大约需要承受50,000到 500,000 次的 DNA 分子损伤。 0005 紫外线是最主要的环境 DNA 损伤剂， 尽管臭氧层吸收了太阳紫外线中最危险的部 分 （紫外线C） ， 但强烈阳光中剩余的紫外线A和紫外线B仍能在一小时内对被照射细胞产生 约十万次的DNA损伤。 生物体中DNA的四种碱基在近紫外波段 （紫外线B） 有强吸收， 进而诱 发 DNA 同一条链内相邻的胸腺嘧啶碱基产生嘧啶二聚体光化学产物， 其中最主要 ( 约 90%) 的光产物是环丁烷嘧啶二。
8、聚体 (Cyclobutane Pyrimidine Dimer, CPD), 还包括 (6-4) 光 产物 （6-4 PhotoProduct， 6-4 PP) 等其他光产物破坏 DNA 结构， 引发基因突变和基因组畸 变， 最终导致细胞死亡或者癌变。对人体的皮肤细胞而言， 受紫外线损伤的 DNA 如果不能够 被及时和正确的修复， 将造成皮肤炎症及黑色素沉积， 甚至引发皮肤癌和黑瘤病。 0006 在病毒、 细菌、 真菌、 昆虫、 植物、 无脊椎动物及部分脊椎动物细胞内存在一类 DNA 光修复酶， 可在 300600nm 波长的光照射下将原本受紫外线照射而在 DNA 中形成的嘧啶二 聚体分解成。
9、原来的非聚合状态， 使 DNA 恢复正常。由于人体内缺乏该类 DNA 光修复酶， 皮肤 细胞中只能采用效率较低的核苷酸切除修复(nucleotide excision repair, NER)方式消 除6-4 PP， 而环丁烷嘧啶二聚体CPD则会被积累下来并导致一系列的负面效应的发生, 如 皮肤炎症、 免疫抑制、 皮肤肿瘤， 甚至皮肤癌。现有研究结果表明 CPD 光修复酶可以主动修 复皮肤细胞因紫外线照射而产生的基因损伤， 抑制由此引起的红斑、 皮肤炎症等发生 ； 抑制 DNA 损伤引起的代谢免疫功能异常， 有效抵制细菌、 寄生虫的侵蚀， 延缓衰老， 增强皮肤新陈 代谢而使细胞保持活力 ； 并。
10、且还能预防紫外线损伤引起的皮肤癌。 0007 钝顶螺旋藻 (Spirulina platensis)， 是丝状不形成异型胞的蓝藻， 原产于非洲乍 得 Aranguadi 湖， 国内主要分布在海南、 广东、 云南等地。钝顶螺旋藻是世界上广泛推行的 优良螺旋藻品种， 由于其具有营养成分高且易于吸收的特点， 已被人类广泛采集食用了几 百年。作为安全的食用藻类， 每个钝顶螺旋藻中仅含有 1020 个 CPD 光修复酶分子， 这使得 直接进行天然钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶的分离纯化和体外应用极为困难。因此有必要对长 期生存于强紫外线辐射条件下的钝顶螺旋藻进行深入研究， 利用基因工程手段克隆重组其 CP。
11、D 光修复酶， 实现过量表达和纯化。 说 明 书 CN 103966193 A 3 2/8 页 4 0008 发明内容 0009 鉴于现有技术的不足， 本发明的目的之一在于提供一种钝顶螺旋藻 CPD 光修复 酶， 其具有SEQ ID NO:2所示的多肽序列， 或在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中包含取代和 / 或缺失和 / 或添加所形成的具有 CPD 光修复酶活性的多肽序列。 0010 作为可行的实施方案之一， 所述钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶具有在 SEQ ID NO:2 所 示氨基酸序列中取代和 / 或缺失和 / 或添加 1 10 个氨基酸残基所形成的多肽序列。 0011 本发明的目。
12、的之二在于提供一种编码所述钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶的多聚核苷 酸。 0012 进一步的， 所述多聚核苷酸具有 SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列， 或者与 SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列有 90% 以上同源性且能够编码光修复酶活性蛋白的核苷酸序列。 0013 本发明的目的之三在于提供一种导入了前述多聚核苷酸的原核或真核表达载体。 0014 进一步的， 所述表达载体中还导入了选择性标记基因， 其可包括但不限于 ： 可在表 达菌株中产生颜色变化的酶的基因、 或发光化合物的基因、 或具有抗生素标记物的基因、 或 具有营养缺陷抗性的基因。 0015 本发明的目的之四在于提供包含前述多。
13、核苷酸或前述表达载体的宿主细胞。 0016 本发明的目的之五在于提供钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶在制备防晒产品中的应用。 0017 与现有技术相比， 本发明至少具有如下有益效果 ： 优化并首次人工合成了适于原 核表达的钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶基因， 并成功将其克隆到表达载体中， 获得大量钝顶螺 旋藻CPD光修复酶， 当将该CPD光修复酶应用到化妆品等相关领域时， 能够主动修复由紫外 线引起的皮肤细胞 DNA 损伤， 产生巨大社会效益和经济价值， 意义重大。 0018 附图说明 0019 图 1 是钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶重组表达鉴定及纯化结果鉴定 SDS-PAGE 电泳图 ； 图 2 。
14、是钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶紫外及可见光吸收光谱扫描结果 ； 图 3 是钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶酶催化动力学参数拟合曲线。 具体实施方式 0020 本发明旨在通过优化得到适于原核表达的钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶编码基因， 然 后将其优化后的编码基因克隆到表达载体中， 得到其编码产物， 验证其 CPD 光修复酶活性， 并将编码产物合理应用到化妆品、 生物医药等相关领域， 从而消除上述现有技术的缺陷。 0021 而相应的， 本发明的技术方案包括 ： 1. 提供了一种钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶， 如 （a） 或 （b） 所述的蛋白质 ： （a） 其如 SEQ ID NO:2 所示的氨基酸序。
15、列 ； （b） 将 （a） 中的氨基酸序列经过取代、 缺失或添加一至十个氨基酸残基且具有 CPD 光修 复酶活性的由 （a） 衍生的蛋白质。 0022 （b） 所述的蛋白质， 例如在SEQ ID NO:2 所示氨基酸序列的N 端添加His His His 说 明 书 CN 103966193 A 4 3/8 页 5 His His His六个氨基酸、 或在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的N 端添加His His His His His His His His八个氨基酸等， 以上修饰均不改变蛋白活性， 且由 （a） 衍生， 均属于本发明 的保护范围。 0023 2. 提供了钝顶螺旋藻 CP。
16、D 光修复酶经过密码子优化后的编码基因。 0024 钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶优化后的编码基因， 具有如 SEQ ID NO:1 所示的核苷酸 序列。或者， 与 SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列有 90% 以上同源性且编码光修复酶活性蛋 白的核苷酸序列， 能够编码 （b） 所述蛋白质的核苷酸序列。例如， 将钝顶螺旋藻 CPD 光修复 酶氨基酸序列中天冬酰胺 (Asn) 的对应编码基因由最优密码子 AAC 替换为 AAT ； 将钝顶螺 旋藻 CPD 光修复酶氨基酸序列中脯氨酸 (Pro) 的对应编码基因由最优密码子 CCG 替换为 CCT、 CCC 或者 CCA ； 或针对将 SEQ 。
17、ID NO:2 所示氨基酸序列中的氨基酸 N 端添加六个氨基 酸， SEQ ID NO:1 所示的核苷酸 3 端添加 18 个核苷酸。 0025 3. 提供了钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶的表达载体 该表达载体包括 ： 导入了钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶优化后的编码基因而能够编码如 （a） 或 （b） 所述蛋白质的原核表达载体或真核表达载体。 0026 本发明提供的钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶的表达载体中， 还可以加入选择性标记基 因， 包括但不限于 ： 可在表达菌株中产生颜色变化的酶的基因、 或发光化合物的基因、 或具 有抗生素标记物的基因、 或具有营养缺陷抗性的基因。 0027 更具体的讲，。
18、 本发明首先从GeneBank数据库中查询得到钝顶螺旋藻CPD光修复酶 原始cDNA序列， 经原核表达系统密码子优化后得到优化后的钝顶螺旋藻CPD光修复酶编码 基因。通过化学合成得到该全长编码基因， 同时， 根据该基因片段序列设计引物， 进行 PCR， 扩增优化后的全长钝顶螺旋藻CPD光修复酶基因并将该基因克隆到原核克隆载体pET28上 (由pET28a(+)改造的载体， 去除了pET28a(+)中His-tag前的凝血酶酶切位点及一些限制 性酶切位点)， 进行测序验证。 将构建好的重组载体转化进入大肠杆菌Rosetta (DE3)菌株 中表达。最终经过 Ni 亲和层析、 凝胶排阻及离子交换层。
19、析得到纯化蛋白。为了方便过量表 达菌株的鉴定和筛选， 可对表达载体进行加工， 如加入可产生颜色变化的酶或发光化合物 基因 ( 如 GFP 基因、 荧光素酶基因等 )， 或具有抗性的抗生素标记物及营养缺陷标记物。 0028 （1） 钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶基因编码序列的原核表达系统密码子优化 从 GeneBank 数据库中查询得到钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶原始 cDNA 序列 (Gene ID: 15162397)， 按照大肠杆菌细胞内tRNA丰度数据， 将钝顶螺旋藻CPD光修复酶原始编码基因 中的稀有三联体密码子替换为大肠杆菌细胞中 tRNA 丰度最高的相应密码子核苷酸， 最终 获得适于。
20、大肠杆菌原核表达的钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶优化基因编码序列。该优化过程中 钝顶螺旋藻CPD光修复酶原始cDNA序列中有367个核苷酸被替换调整， 占编码序列的25%。 0029 （2） 钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶原核表达编码基因的获得 按照优化后的基因序列全基因化学合成全长双链钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶原核表达 编码基因。 0030 （3） 钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶表达载体构建 根据优化后的钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶基因完整序列设计引物 ： CPDF: CGACGCATATGGCTGCTAACCCGCAG CPDR: GACA CTCGAGTTAGGTCATACGCAGAGC 说。
21、 明 书 CN 103966193 A 5 4/8 页 6 PCR 反应条件为 ： 98预变性 10min， 98变性 50s， 55退火 50s， 72延伸 2min， 反 应进行 30 个循环 ； 将光修复酶基因的 PCR 扩增产物连接至原核表达载体 pET28， 得到重组 质粒 ； 将连接好的重组质粒转化大肠杆菌 Rosetta (DE3)， 测序鉴定得到重组菌株 Rosetta (DE3)/ pET28/phr。 0031 （4） 钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶的纯化和蛋白检测 将重组菌 Rosetta (DE3)/ pET28/phr 接种于含卡那霉素的 LB 液体培养基培养后， 加 。
22、入 IPTG， 收集菌体 ； 经过 Ni 亲和层析、 凝胶排阻及阴离子交换层析， 得到目的蛋白。 0032 取上述诱导表达的 Rosetta (DE3)/ pET28/phr 菌体和纯化的目的蛋白， 进行 SDS-PAGE 恒压电泳， 电泳结束后将凝胶用聚丙烯酰胺凝胶染色液染色。 0033 本发明通过密码子优化及重组表达、 纯化技术， 获得了钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶， 其能够主动修复由紫外线引起的皮肤细胞 DNA 损伤， 适用于化妆品等相关领域。例如， 现有 防晒产品主要通过将皮肤与紫外线隔离开来的方式起作用， 对已经产生的紫外伤害无法起 到修复治愈作用 ； 而将本发明的钝顶螺旋藻 CPD。
23、 光修复酶蛋白作为高级护肤品的功能成分 时， 其主动修复由紫外线引起的红斑、 皮肤炎症以及基因损伤， 显著提高防晒产品的防护效 果， 而若作为皮肤细胞 DNA 修复保健品， 其还可以清除皮肤细胞中日常累积的 DNA 损伤， 起 到延缓皮肤衰老的作用。 0034 为了使本发明实现的技术手段、 创作特征、 达成目的与功效易于明白了解， 下面结 合具体实施例， 进一步阐述本发明。 0035 下述实施例中所使用的方法均为本领域常规操作， 详见 分子克隆实验指南 （第四 版） ， 科学出版社， 2013 年 1 月 1 日出版， ISBN ： 9787030386069。 0036 实施例1 钝顶螺旋藻。
24、Spirulina platensis CPD光修复酶原核表达优化编码基因 的获得 从 GeneBank 数据库中查询得到钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶原始 cDNA 序列 (Gene ID: 15162397)， 按照大肠杆菌细胞内tRNA丰度数据， 将钝顶螺旋藻CPD光修复酶原始编码基因 中的稀有三联体密码子替换为大肠杆菌细胞中 tRNA 丰度最高的相应密码子核苷酸， 最终 获得适于大肠杆菌原核表达的钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶优化基因编码序列。该优化过程中 钝顶螺旋藻CPD光修复酶原始cDNA序列中有367个核苷酸被替换调整， 占编码序列的25%， 其具有 SEQ ID NO:1 所示核苷。
25、酸序列。 0037 实施例 2 钝顶螺旋藻 Spirulina platensis CPD 光修复酶表达载体构建 1、 根据优化后的钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶基因完整序列设计引物 ： 正向引物 : CGACGCATATGGCTGCTAACCCGCAG 反向引物 : GACACTCGAGTTAGGTCATACGCAGAGC PCR 反应条件为 ： 98预变性 10min， 98变性 50s， 55退火 50s， 72延伸 2min， 反应 进行 30 个循环。PCR 反应体系如下 ： 反应体系体积 (L) 2xPrimerstarMix25 正向引物1 反向引物1 模板 DNA1 ddH2O2。
26、2 2、 将优化后的钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶基因的 PCR 扩增产物和原核表达载体 pET28 分 说 明 书 CN 103966193 A 6 5/8 页 7 别用 Nde I 和 Xho I 于 37酶切 2h， 用 1.0% 的琼脂糖分别进行回收， 将纯化好的目的片段 及载体用 T4DNA 连接酶于 16下连接 12h， 连接体系如下。 0038 反应体系体积 (L) phrPCR 反应产物8 pET28a2 连接酶 / 缓冲液 Mix 6 反应总体系16 3、 将连接好的重组质粒转化大肠杆菌 Rosetta (DE3)， 步骤如下 ： (1) 取感受态细胞 100L 于 1.5mL。
27、 离心管中， 冰浴 5min。 0039 (2) 于每管中加入 16L 连接过的质粒， 轻轻旋转以混合内容物， 冰浴 30min。 0040 (3) 42热休克 90s， 不要摇动试管， 冰浴 5 min。 0041 (4) 取 10mL 无菌试管， 每管加入 200L LB 液体培养基， 放入摇床 37 160rpm 振荡培养 40min。 0042 (5) 将 300L 转化的菌液涂布于平板表面， 37培养培养 12h。 0043 4、 挑取白色的菌落分别置于 5mL 含卡那霉素的 LB 液体培养基中， 37振荡培养 8h， 测序鉴定得到重组菌株 Rosetta (DE3)/ pET28/。
28、phr。 0044 实施例 3 钝顶螺旋藻 Spirulina platensis CPD 光修复酶的纯化及蛋白检测 1、 将重组菌 Rosetta (DE3)/ pET28/phr 接种于 5mL 含卡那霉素的 LB 液体培养基中， 于 37振荡过夜培养。次日取 5mL 菌液接入 500mL 相同的培养基继续培养 4h(OD600约 0.8) 后， 加入终浓度为 1mM 的 IPTG， 于 16振荡培养 20h， 8000rpm 离心 5min， 收集菌体。 0045 2、 Ni琼脂糖亲和柱亲和层析 ： 将金属螯合剂Ni 琼脂糖装入层析柱， 用1Ni柱结 合缓冲液平衡 (25mM Tris，。
29、 500mM NaCl， 10% Glycerol， pH 8.0)。将上清液上柱。一般用 300mM 咪唑洗脱， 收集得到目的蛋白。 0046 3、 Superdex 200 凝胶排阻层析 ： 采用平衡缓冲液 (25mM Tris， 200mM NaCl， 10% Glycerol, pH 8.0, 1mM DTT) 平衡 Superdex 200 凝胶排阻层析柱， 将步骤 2 所得样品上 柱， 继续采用平衡缓冲液对目的蛋白进行洗脱， 收集得到目的蛋白。 0047 4、 Q fast flow 阴离子交换层析 ： 采用低盐缓冲液 (25mM Tris， 50mM NaCl， pH 8.0， 。
30、1mM DTT)平衡5mL Q fast flow阴离子交换层析柱， 将样品上柱， 采用高盐溶液(25mM Tris， 1M NaCl， pH 8.0， 1mM DTT) 与低盐溶液形成离子强度梯度， 对目的蛋白进行洗脱， 收 集得到高纯度钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶蛋白。 0048 5、 取上述诱导表达的 Rosetta (DE3)/ pET28/phr 菌体和纯化的钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶蛋白， 分别与等体积的 2 上样缓冲液混合， 100水浴 3 5min。配制 15% 的 SDS-PAGE分离胶和5%的浓缩胶， 取10L加样于凝胶， 在浓缩胶中100V， 分离胶中120V， 进 行。
31、 SDS-PAGE 恒压电泳， 电泳结束后将凝胶用聚丙烯酰胺凝胶染色液染色。 0049 结果如图 1 所示， 其中 M 表示标准分子量 ； B 表示空载体菌株对照 ； S 表示 BL21(DE3)/pET-28a(+)/phr 重组菌体诱导后的蛋白表达情况 ； P 表示经过 3 步纯化后得 到的 99% 以上纯度的钝顶螺旋藻 Spirulina platensis CPD 光修复酶蛋白 ； 箭头所示为约 56kDa 大小的钝顶螺旋藻 Spirulina platensis CPD 光修复酶蛋白电泳条带位置。以上结 果说明， 利用上述方法能够得到纯度大于 99% 的钝顶螺旋藻 Spirulina。
32、 platensis CPD 光 说 明 书 CN 103966193 A 7 6/8 页 8 修复酶， 其具有 SEQ ID NO:2 所示氨基酸序列。 0050 实施例4 钝顶螺旋藻Spirulina platensis CPD光修复酶蛋白配体成分及分型分 析 CPD 光修复酶通常以非共价形式结合不同配体， 形成光捕捉中心并完成催化反应所 需的电子传递链， 不同的配体结合特性决定了 CPD 光修复酶的催化特性。通常， CPD 光修 复酶可分为脱氮核黄素型及次甲基四氢叶酸型， 其中脱氮核黄素型光修复酶在 440nm 处 有最大光吸收峰， 次甲基四氢叶酸型光修复酶在 370-420nm 处有最。
33、大光吸收峰。如图 2 所示， 钝顶螺旋藻 Spirulina platensis CPD 光修复酶蛋白的紫外及可见光吸收光谱扫 描曲线显示该光修复酶的最大吸收峰位于 380-390nm 之间， 证明钝顶螺旋藻 Spirulina platensis CPD 光修复酶属于次甲基四氢叶酸型光修复酶， 蛋白中天然结合次甲基四氢叶 酸 (methylenetetrahydrofolate, MTHF) 作为光捕捉配体。 0051 实施例5 钝顶螺旋藻Spirulina platensis CPD光修复酶修复DNA紫外损伤的作 用检测 反应底物的制备 ： 将 100m 人工合成的 oligo dT 1m。
34、L 加到石英比色皿 （10.00mm 型） 中， 在冰浴中用 302 nm 紫外光 （光强 ： 700W 每平方厘米） 照射 20h， 得到含 CPD 嘧啶二聚 体的寡聚核苷酸， 即 oligo-dT(CPD)。 0052 反应体系为样品缓冲液 (25M Tris, 200M NaCl, pH=8.0) 中加入 1M 的二 硫苏糖醇 (DTT， 作为电子供体 )， 加入 5M 的钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶和不同浓度 (2M、 4M、 5M、 8M) 的 oligo-dT(CPD) 底物 ； 总反应体积保持在 210L。 0053 检测流程 ： 将反应液体置于石英比色皿 （10.00mm 型）。
35、 中， 用 6W 近紫外灯管 ( 主要 输出波长为 365nm) 以光距 20cm 光照进行光修复， 照射不同时间后将反应液置于 70中水 浴 5min 终止反应， 测定 268nm 处吸光度变化。不同底物浓度、 不同反应时间的样品平行测 量三遍， 根据酶动力学计算得出钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶的酶催化动力学参数。 0054 经多次实验重复， 优化得到最优反应浓度条件并分别平行测试 3 组数据后， 作图 ( 图 3) 计算得出钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶催化动力学参数为 ： Km=42.66x10-6M， Vmax=2.50 uM/min， Kcat=0.5 min-1。证明钝顶螺旋藻 CP。
36、D 光修复酶具有很强的 CPD 光修复能力。 0055 应当理解的是， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本 发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 0056 序 列 表 安徽邦业生物工程有限公司 钝顶螺旋藻 CPD 光修复酶及其应用 2 1 1470 DNA 人工序列 1 atggctgcta acccgcagaa aatcatcctg tggtaccgta acgacctgcg tctgcacgac 60 cacgaaccgc tggacctggc tacctctacc cagggtcaga tcatcccgct gtactgc。
37、ttc 120 说 明 书 CN 103966193 A 8 7/8 页 9 gacccgcgtc agttcgctaa aacctctttc ggtttcccga aaaccggtgg tttccgtggt 180 aaattcctgc tggaatctgt tgctgacctg cgtcacaact tccagaaaat cggttctaac 240 ctgctggttc gtatcggtga accggaacgt gttatcttcg acctggttaa acagctgaac 300 atcgacgctg tttactacca caaagaagtt accgctgaag aactggc。
38、tgt tgaaaccgct 360 ctggaaaaag ctctgacccc gctgggtgtt gaagttaaat ctttctgggg tgctaccctg 420 taccacctga aagaactgcc gttcccgatc gaaaaactgc cggaactgtt caccaacttc 480 cgtaaacagg ttgaacagaa atctgttatc tacccgccgt acaccccgcc gaaccagctg 540 ccgcagttcc cggacatcga accgggtgaa atcccgaccc tgaccgaact gggtatcacc 600 c。
39、cggctccgt tcgacgaacg ttctgttctg gacttcgctg gtggtgaaac cgctggtctg 660 tctcgtctga acgactactt ctggcgtcgt gactgcctga aaaactacaa acagacccgt 720 aacggtatgc tgggttctga ctactcttct aaattctctc cgtggctggc taacggttgc 780 ctgtctccgc gttggatcta ccagcaggtt caggactacc agcaccagcg tgttaaaaac 840 gactctacct actggctggt。
40、 tttcgaactg ctgtggcgtg actacttccg tttcatctgc 900 ctgaaacacg gtccgaaagt tttctacaaa tctggtctgc agggtgttaa aatcccgtgg 960 ggtgaaaact gggaacagtg gcagatctgg tgccagggtc tgaccggttt cccgctggtt 1020 gacgctaaca tgcgtgaact ggctgctacc ggtttcatgt ctaaccgtgg tcgtcagaac 1080 gttgcttctt tcctgaccaa aaacctgggt atcaac。
41、tggc agatgggtgc tgaatggttc 1140 gaatctgttc tgatcgacta cgacgtttgc tctaactggg gtaactggaa ctacaccgct 1200 ggtgttggta acgacggtcg tggtttccgt tacttcaaca tcgctaaaca gtctcaggac 1260 tacgacccga tgggtgacta cgttaaacac tggctgccgg aactggcttc tatcccggac 1320 ggtcgtgttc actctccgtg gcgtctgtct aaccaggaac agatccgttt 。
42、cggtgttcgt 1380 ctgggtgttg actacccgta cccgatggtt gacctgcagg aatctgttga agctaaccgt 1440 cgtatctacg aaaaagctct gcgtatgacc 1470 2 490 PTR 人工序列 2 Met Ala Ala Asn Pro Gln Lys Ile Ile Leu Trp Tyr Arg Asn Asp 15 Leu Arg Leu His Asp His Glu Pro Leu Asp Leu Ala Thr Ser Thr 30 Gln Gly Gln Ile Ile Pro Leu Tyr 。
43、Cys Phe Asp Pro Arg Gln Phe 45 Ala Lys Thr Ser Phe Gly Phe Pro Lys Thr Gly Gly Phe Arg Gly 60 Lys Phe Leu Leu Glu Ser Val Ala Asp Leu Arg His Asn Phe Gln 75 Lys Ile Gly Ser Asn Leu Leu Val Arg Ile Gly Glu Pro Glu Arg 90 Val Ile Phe Asp Leu Val Lys Gln Leu Asn Ile Asp Ala Val Tyr 105 Tyr His Lys Glu 。
44、Val Thr Ala Glu Glu Leu Ala Val Glu Thr Ala 120 Leu Glu Lys Ala Leu Thr Pro Leu Gly Val Glu Val Lys Ser Phe 135 Trp Gly Ala Thr Leu Tyr His Leu Lys Glu Leu Pro Phe Pro Ile 150 Glu Lys Leu Pro Glu Leu Phe Thr Asn Phe Arg Lys Gln Val Glu 165 说 明 书 CN 103966193 A 9 8/8 页 10 Gln Lys Ser Val Ile Tyr Pro 。
45、Pro Tyr Thr Pro Pro Asn Gln Leu 180 Pro Gln Phe Pro Asp Ile Glu Pro Gly Glu Ile Pro Thr Leu Thr 195 Glu Leu Gly Ile Thr Pro Ala Pro Phe Asp Glu Arg Ser Val Leu 210 Asp Phe Ala Gly Gly Glu Thr Ala Gly Leu Ser Arg Leu Asn Asp 225 Tyr Phe Trp Arg Arg Asp Cys Leu Lys Asn Tyr Lys Gln Thr Arg 240 Asn Gly 。
46、Met Leu Gly Ser Asp Tyr Ser Ser Lys Phe Ser Pro Trp 255 Leu Ala Asn Gly Cys Leu Ser Pro Arg Trp Ile Tyr Gln Gln Val 270 Gln Asp Tyr Gln His Gln Arg Val Lys Asn Asp Ser Thr Tyr Trp 285 Leu Val Phe Glu Leu Leu Trp Arg Asp Tyr Phe Arg Phe Ile Cys 300 Leu Lys His Gly Pro Lys Val Phe Tyr Lys Ser Gly Leu 。
47、Gln Gly 315 Val Lys Ile Pro Trp Gly Glu Asn Trp Glu Gln Trp Gln Ile Trp 330 Cys Gln Gly Leu Thr Gly Phe Pro Leu Val Asp Ala Asn Met Arg 345 Glu Leu Ala Ala Thr Gly Phe Met Ser Asn Arg Gly Arg Gln Asn 360 Val Ala Ser Phe Leu Thr Lys Asn Leu Gly Ile Asn Trp Gln Met 375 Gly Ala Glu Trp Phe Glu Ser Val 。
48、Leu Ile Asp Tyr Asp Val Cys 390 Ser Asn Trp Gly Asn Trp Asn Tyr Thr Ala Gly Val Gly Asn Asp 405 Gly Arg Gly Phe Arg Tyr Phe Asn Ile Ala Lys Gln Ser Gln Asp 420 Tyr Asp Pro Met Gly Asp Tyr Val Lys His Trp Leu Pro Glu Leu 435 Ala Ser Ile Pro Asp Gly Arg Val His Ser Pro Trp Arg Leu Ser 450 Asn Gln Glu 。
49、Gln Ile Arg Phe Gly Val Arg Leu Gly Val Asp Tyr 465 Pro Tyr Pro Met Val Asp Leu Gln Glu Ser Val Glu Ala Asn Arg 480 Arg Ile Tyr Glu Lys Ala Leu Arg Met Thr 490 说 明 书 CN 103966193 A 10 1/3 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 103966193 A 11 2/3 页 12 图 2 说 明 书 附 图 CN 103966193 A 12 3/3 页 13 图 3 说 明 书 附 图 CN 103966193 A 13 。