通过胰脏衍生的非内分泌上皮细胞和血管内皮细胞的组织复合物培养胰岛样组织的方法技术领域
本发明涉及用于产生胰岛素生成组织(IPT)的培养方法，特别是通过培
养分离自胰脏的胰脏衍生非内分泌上皮细胞(NEEC)和/或血管内皮细胞
(VEC)，或者通过使用VEC增加天然胰岛细胞的增殖。本发明还涉及用于
富集可以分化为胰岛素生成细胞的细胞的方法，包括在剩余细胞(LOC)的存
在下培养NEEC的方法，所述剩余细胞分离自包含NEEC的胰脏细胞的原
代培养物。
背景技术
已认识到胰岛移植是1型糖尿病的有效治疗，但是目前这种方法仅向
少于20%的受体提供胰岛素不依赖性，并且需要来自超过一个供体的胰岛。
即使对于已移植来自多个供体的胰岛的受体，最近的研究显示仅小部分的
胰岛成功移入；更不用说供体组织可用性始终短缺。
弥补可移植的胰岛的短缺的一种策略是离体培养法，以便从可能位于
供体胰脏中的胰岛先祖产生足量的功能性内分泌组织。虽然已提出许多方
法，但是与天然胰岛产生的胰岛素相比，离体产生的胰岛样组织倾向于产
生少量胰岛素，通常低于前者的1%，和/或缺少适当水平的葡萄糖反应性，
即不能对增加浓度的葡萄糖应答而分泌更多胰岛素。
几个研究表明出生后的胰脏中胰岛先祖的存在以及通过施用外部胁迫
体内再生内分泌细胞，例如，施用毒素如四氧嘧啶或链佐星，使胰脏进行
例如胰切除的手术治疗，或者捆扎胰管(称为导管结扎)。最近，据发现导
管结扎造成大量胰脏炎症和细胞凋亡然后胰岛祖细胞群体快速增殖(Xu et
al.,2008,Cell 132:197-207)。虽然先祖在胰脏组织中的确切组织定位尚未阐
明，但是许多研究已发现它们位于胰脏的导管或泡心(centroacinar)区域的证
据，以及一些其它研究表明它们位于胰岛内。
尽管缺少先祖的确切特性，但是已测试各种方法以分离它们。一种这
样的方法是流式细胞仪分选，其使用一组特定的细胞表面标记。这种方法
的缺点是收集的细胞的量常不足以扩增培养，这部分是由于分选过程引起
的损伤以及来自细胞表面标记的可能的偏差。另一方法是通过培养整个胰
脏丢弃物来选择性扩增靶细胞。将胰脏丢弃物接种于具有适当的培养基和
生长因子的培养容器中以促进预期的先祖而不是其它非靶细胞的增殖。采
用这种方法的一个挑战是预测哪些细胞以及在哪个阶段细胞需要用给定培
养方案选择性扩增。
弥补可移植的胰岛的短缺的另一策略是离体扩增天然胰岛细胞。据认
为胰岛细胞如β细胞是终末分化的，因此难以促进它们在体外增殖，因此
需要有效的方法。
发明内容
根据本发明的第一方面，通过培养来制备胰岛素生成组织(IPT)的方法
包括：体外产生由均分离自或源自出生后的胰脏的非内分泌上皮细胞
(NEEC)和血管内皮细胞(VEC)组成的组织复合物。
根据本发明的第二方面的产生胰岛素生成组织(IPT)的方法包括：制备
血管内皮细胞(VEC)和天然胰岛细胞，其分离自或源自出生后的胰脏；以形
成单层的方式体外培养血管内皮细胞(VEC)；以及在所述单层上接种并生长
天然胰岛细胞。
根据本发明的第三方面的制备胰岛素生成组织(IPT)的方法包括：制备
非内分泌上皮细胞(NEEC)，其分离自或源自出生后的胰脏；以粘附在培养
容器的表面上或培养基材(“培养基材(culture substrate)”此后用来包括任何
形式的支架)上的状态体外培养非内分泌上皮细胞(NEEC)；通过用组织解离
酶处理来从培养容器或培养基材去除非内分泌上皮细胞(NEEC)以剩下仍
然粘附在培养容器或培养基材上的剩余细胞(LOC)；互相分离地培养去除的
非内分泌上皮细胞(NEEC)和剩余细胞(LOC)；以及在通过单独培养的剩余
细胞(LOC)条件处理的培养基中或者在单独培养的剩余细胞(LOC)的存在
下培养非内分泌上皮细胞(NEEC)以形成细胞簇。
附图说明
[图1-A]图1A-1D为显微图像，示出NEEC生长的转变过程；图1A
示出在细胞捕获步骤中保持粘附在胶原I包被的平皿表面上的细胞(实施例
2)；
[图1-B]图1B示出在包含20ng/ml FGF-2和1400U/ml LIF的无血清
培养基中诱导生长的细胞集落(实施例3)；
[图1-C]图1C示出在包含10mM烟酰胺、0.02微摩尔(10-6M)2-巯基
乙醇和10ng/ml的KGF的无血清培养基中进一步生长2天的细胞集落(实
施例4)；
[图1-D]图1D示出在相同的无血清培养基中培养7天后大部分为上皮
细胞的密集单层的形成(实施例4)；
[图2-A]图2A-2C为示出NEEC的各种集落中的细胞密度的图；图2A
示出在将Accutase处理的胰脏碎片接种在胶原I包被和抗体处理的平板上
后用包含血清的培养基培养18和36小时的NEEC的集落密度的差异；
[图2-B]图2B示出当培养基更换为无血清培养基时，用FGF-2刺激后
从导管组织或整个胰脏碎片(所有组织)出现的NEEC；
[图2-C]图2C示出在抗Notch1抗体处理的胶原I包被的培养容器(抗
Notch1)上以及在未经处理的胶原I包被的培养容器(未经处理的)上传代的
Brdu(溴脱氧尿苷)+NEEC；
[图3-1]图3-1A示出将NEEC在胶原I包被的培养容器上于补充了
10ng/ml的EGF、10ng/ml的HGF、20ng/ml的BMP7和4微摩尔的rock
抑制剂的无血清培养基中培养后，培养容器的包被表面上的NEEC的显微
图像，在所述培养基上装载包含剩余细胞(LOC)的transwell小室(箭头指示
NEEC簇，所述NEEC簇规模生长，并且在培养中位置上粗略地与图3-1B
所示的transwell小室中的LOC团对齐)；图3-1B示出与培养容器的包被表
面上的NEEC共培养后transwell小室中的LOC(箭头指示LOC簇)；图3-1C
示出一周后具有更成熟的三维结构的NEEC簇；
[图3-2]图3-2为示出小室中有或无LOC的情况下形成的簇数量的差
异的图；
[图3-3]图3-3示出LOC、小室中有或无LOC的情况下培养的NEEC
以及天然胰岛的Pdx-1和Ins 1的mRNA表达；
[图4-A]图4A示出用抗胰岛素一抗和Cy3缀合的二抗以及DAPI(4',6-
二氨基-2-苯基吲哚)染色的NEEC的荧光显微图像，是在阿托伐他汀的存在
下(称为“ATS处理”，并且图像如右手部分所示)或阿托伐他汀不存在下(为
“对照”，如左手部分所示)生长的细胞的荧光显微图像，其中上图示出胰
岛素免疫染色的细胞，而下图示出DAPI染色的相应的核。左上图中的大
小标尺代表所有图的100微米；
[图4-B]图4B示出获得自这些图像的胰岛素阳性细胞的百分比；
[图5-A]图5A为一组荧光显微图像，其示出用全反式视黄酸(RA)和环
杷明KAAD(Cycl-K)处理24小时(左图称为“Cycl-K+RA”)或者未经处理
(右图称为“对照”)的NEEC的核中的Ngn3表达，其中上幅图像通过用
DAPI复染细胞核获得以证实Ngn3的核定位，并且下部右手图中的大小棒
表示所有图的5微米；
[图5-B]图5B为示出NEEC中Ngn3阳性细胞的百分比的图；
[图6-A]图6A-6B示出基于NEEC(“1”，胰脏丢弃物；“2”，在无血
清培养基中培养5天后的NEEC；“3”，随后用包含全反式视黄酸和环杷明
KAAD的培养基培养24小时的NEEC；以及“4”，其是“3”的NEEC培
养对照)的半定量RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)的以下基因的相对表达：
Ngn3、Pdx1、Neuro D、Ptf1a (图6A中)，以及Notch1、Hes1、HNF6和
Nkx6.1(图6B中)；
[图6-B]图6B示出如上文所示的以下基因的相对表达：Notch1、Hes1、
HNF6和Nkx6.1；
[图7-1]图7-1示出用于产生IPT的细胞(图“A”和“B”)和所产生的
IPT(图“C”和“D”)的图像，其中图“A”示出从胰脏碎片生长、利用抗
CD31抗体通过磁性微珠分离并扩增的VEC，其中图“B”示出培养之前在
IPT生成培养基中由80%的NEEC和20%的VEC组成的混合细胞悬浮液，
其中组“C”示出将混合的细胞悬浮液在旋转运动下培养24小时后的球形
组织复合物，并且其中图“D”示出成熟的IPT；
[图7-2]图7-2示出显示从单独的NEEC或者NEEC与VEC的组织复
合物产生的IPT(直径100-200微米)数量的图；
[图8-1]图8-1示出从NEEC产生并成熟20天的IPT的图像---从单独
的NEEC产生的IPT(A)以及从80%的NEEC与20%的VEC的组织复合物
产生的IPT(B)(大小标尺代表30微米)；
[图8-2]图8-2为示出IPT中胰岛素生成细胞的百分比的图；
[图9-A]图9A-9C示出通过半定量PCR扩增的胰岛素mRNA表达的
图像和图形(在图9A中，M代表DNA大小标记)；
[图9-B]图9B为胰岛素1表达的图；
[图9-C]图9B为胰岛素2表达的图；
[图10]图10A-10B示出在KREBS缓冲培养基中用低葡萄糖(5mM)
和高(20mM)葡萄糖(20mM)浓度刺激IPT时C-肽(图10A)和胰岛素(图10B)
的分泌；
[图11-1]图11-1示出在腔式载玻片上的VEC单层上生长的胰岛细胞
的图像；
[图11-2]图11-2示出接种在腔式载玻片上的VEC单层上的胰岛细胞
(A、B和C)以及接种在腔式载玻片的包被表面上的胰岛细胞(D、E和F)的
一系列免疫细胞化学图像；
[图11-3]图11-3示出显示在VEC上和在基质胶(Matrigel)上生长的胰
岛细胞的溴脱氧尿苷阳性细胞百分比(%Brdu+细胞)的图；
[图12-A]图12A示出对糖尿病小鼠测量的血液葡萄糖水平的变化，将
从相同品系的供体小鼠的胰脏组织产生的700IEQ的IPT在肾被膜下移植
入所述糖尿病小鼠；以及
[图12-B]图12B示出在所示时间测量血液葡萄糖水平后去除的肾被膜
下的胰岛素+细胞。
具体实施方式
本发明提供增加胰岛素生成组织(IPT)的形成和内分泌功能的培养方
法，特别是用分离自胰脏的血管内皮细胞(VEC)培养胰脏衍生的非内分泌上
皮细胞(NEEC)以增加IPT的形成的方法。目的还是提供VEC的增加天然
胰岛细胞的增殖另一用法。因此，本发明提供特定细胞分离和培养方法的
用途，其使得可以扩增NEEC集落来产生拥有胰-胰岛样特征的IPT，并且
允许增加天然胰岛的增殖，用于治疗1型和2型糖尿病。
在第一个优选实施方案中，所述NEEC培养自胰岛分离后丢弃的组织，
它们的群体从包括以下(1)和(3)的方法开始，并且所述方法优选还包括以下
的(2)。
(1)细胞捕获，通过在培养容器或培养基材上将所述胰脏丢弃物接种于
含血清培养基中，然后使培养例如在37℃左右和增加的CO2下保持8-56
小时，所述培养容器或培养基材用细胞粘附物质如胶原包被，并且优选用
抗体如抗c-Met(HGF受体)和/或E-钙粘着蛋白的抗体包被。在一实例中，
在用0.2mg/ml鼠尾胶原I包被并用浓度范围为1:100-1:1000的抗E-钙粘着
蛋白抗体和/或抗c-Met(HGF受体)抗体进一步包被的培养容器中，在含有
10%(v/v)FCS(胎牛血清)的RPMI1640中进行细胞捕获；并且将组织在37
℃左右和5%CO2下捕获24-36小时。
(2)集落诱导，通过用包含FGF-2或其它成纤维细胞生长因子或者包
含成纤维细胞生长因子以及胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠补充物或其它生长
因子补充物，并且优选还包含LIF(白血病抑制因子)的第一无血清培养基替
换细胞捕获(1)中的含血清培养基；以及通过在无血清培养基中继续培养；
例如在37℃左右和增加的CO2下培养至少8小时。优选地，所述第一无血
清培养基包含2-40ng/ml，更优选5-30ng/ml成纤维细胞生长因子，和/或
100-15000U/ml，更优选300-5000U/ml的LIF。在一实例中，所述第一无
血清培养基在包含10mM D-葡萄糖的DMEM/Ham's F-12中包含1g/l ITS
(胰岛素-转铁蛋白-硒补充物；例如，5微克/ml胰岛素、5微克/ml转铁蛋白、
5ng/ml亚硒酸钠)、0.2%BSA(牛血清白蛋白)、20ng/ml重组人FGF-2和
1400U/ml重组人LIF (白血病抑制因子)，并且培养至少24小时。这个步
骤可以跳过，并且细胞捕获步骤(1)后可以直接进行下文所示的初始集落生
长步骤(3)。
3)初始集落生长，通过将集落诱导(2)中的第一无血清培养基换为包含
人KGF (角质形成细胞生长因子)，或者包含人KGF以及胰岛素-转铁蛋白-
亚硒酸钠补充物或其它生长因子补充物的第二无血清培养基，以及通过培
养直至具有直径10-30微米的细胞大小的NEEC克隆集落出现。优选地，
所述第二无血清培养基包含1-100ng/ml，更优选3-30ng/ml的KGF。所述
第二无血清培养基优选包含0.1-10g/L的生长因子补充物。例如，所述第二
无血清培养基在包含7mM的D-葡萄糖的DMEM/Ham's F-12中包含1g/L
的ITS(5微克/ml胰岛素、5微克/ml转铁蛋白、5ng/ml亚硒酸钠)、0.2%BSA、
10mM烟酰胺和10ng/ml重组人KGF(角质形成细胞生长因子)；并且培养
在例如37℃左右和增加的CO2下进行至少2-7天。为了缓和成纤维细胞样
细胞的生长，如果需要，可以将0.02微摩尔2-巯基乙醇加入培养基。为了
防止支原体感染，可以将支原体去除剂加入培养基。优选每2-3天补充培
养基直至相当数量的直径10-30微米大小的NEEC克隆集落出现。
在第二个优选实施方案中，通过以下(4)-(6)的技术将所述NEEC传代
用于它们的选择性扩增：
(4)第一细胞去除，即通过用组织解离酶溶液处理从培养容器去除第一
个优选实施方案的初始集落生长(3)中的NEEC；以及通过过滤和/或离心以
从所述第二无血清培养基去除NEEC。例如，将Accutase用于去除，并且
将去除的细胞通过40微米筛孔过滤并在160Xg或低于160Xg离心少于4
min。
(5)第二细胞去除或细胞脱离，即通过加入更强的细胞解离剂或部分蛋
白变性剂如胰蛋白酶-EDTA (乙二胺四乙酸)，以及通过使LOC在例如37°C
左右保持1-15min从第一细胞去除步骤(4)中的培养容器去除剩余细胞
(LOC)，其为紧密粘附在一起的上皮细胞。在详细的实例中，用0.05%胰蛋
白酶-EDTA在37°C下3-5min去除LOC；并且在用无血清培养基洗涤后将
这些细胞转移入transwell小室，在培养基浴中培养以备后用。
(6)将第一细胞去除中获得的NEEC在用第二细胞去除中获得的剩余
细胞(LOC)条件处理的条件培养基中培养。在优选实例中，将第一细胞去除
(4)中获得的去除细胞接种在如第一个优选实施方案的细胞捕获步骤(1)中
的新培养容器或其它培养容器上；并且用包含通过第二细胞去除获得的
LOC的transwell小室(例如，Millipore Co.)装载培养容器。通过transwell
小室的多孔底部，transwell小室内的培养基与培养容器底部上的NEEC培
养物的培养基相同或连通。优选地，将第一细胞去除(4)中获得的NEEC接
种在用包含KGF或者包含KGF和抗Notch 1抗体的胶原包被的培养容器或
培养基材上；并且将NEEC在补充了阿托伐他汀的第三无血清培养基中培
养。这里，KGF或者KGF和抗Notch 1抗体可以用rock(Rho相关含卷曲
螺旋蛋白激酶)抑制剂或者用rock抑制剂、EGF(表皮生长因子)和HGF(肝
细胞生长因子)以及BMP-4或BMP-7的混合物代替。
例如，用10ng/ml的KGF制备用于包被容器的胶原溶液，并且将包被
的表面用终浓度为1:100-1:1000的抗Notch 1抗体进一步处理。或者，胶原
包被不用KGF制备或用抗Notch 1抗体进一步处理；取而代之，将第一细
胞去除步骤(1)的培养基中的KGF用以下物质代替：多于10、15或20ng/ml
并少于30或20ng/ml(例如20ng/ml)的HGF(肝细胞生长因子)；多于10、
15、20或30ng/m并少于50或40ng/m(例如40ng/ml)的EGF(表皮生长因
子)；以及多于2、4、8或14微摩尔并少于25、20、14或8微摩尔(例如4
微摩尔)的rock(Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶)抑制剂。将细胞去除(4)中获
得的去除NEEC接种在容器上并任选地装载包含LOC的transwell小室后，
培养基可以优选地进一步补充0.01-1.0微摩尔，更优选0.03-0.3微摩尔，例
如0.1微摩尔阿托伐他汀，并且可以优选地进一步补充多于10或15ng/m
并少于40或30ng/m的BMP7(例如20ng/ml的BMP7)，以便富集在后来
分化时倾向于成为内分泌细胞的NEEC。每2-3天用40%条件培养基补充
培养基直至生长相当数量的NEEC克隆集落。NEEC克隆集落自发形成细
胞簇，所述细胞簇可以传代以进一步富集，以便增加它们在分化时形成组
织复合物的倾向。
在第三个优选实施方案中，扩增或传代的所述NEEC包含这样的细胞，
其表达Hes1(Notch信号传导的下游靶)，并且后来用全反式视黄酸和环杷明
KAAD((3-酮N-(氨基乙基-氨基己酰基-二氢肉桂酰)环杷明)处理时鉴定为
Ngn3阳性细胞，从而表示其能够产生胰岛素生成细胞的先祖的特性。
在第四个优选实施方案中，自去除胰岛后的丢弃组织培养所述VEC，
它们的群体通过以下(7)和(8)的培养技术起始：
(7)将所述丢弃组织本身或者第一个优选实施方案的细胞捕获步骤(1)
中去除的漂浮组织碎片接种于第二含血清培养基中，在用胶原或其它细胞
粘附物质包被的培养容器或培养基材上；并且在所述第二含血清的培养基
中培养。优选地，这种培养包括所述接种后的VEC扩增；补充培养基；以
及通过利用抗体和磁珠纯化VEC。以这样的方式进行培养基的补充，将所
述扩增后的非粘附细胞和组织去除，并且用生理溶液如磷酸盐缓冲溶液
(PBS)短暂洗涤，然后补充新鲜的含血清的培养基。更优选地，所述新鲜的
含血清的培养基包含抗真菌剂如两性霉素(商品名，Invitrogen Co.)。
所述第二含血清的培养基是例如包含70-100微克/ml的ECGS(内皮细
胞生长补充物)和20%(v/v)的FCS的RPMI1640，其已在65.5°C下热灭活
60-70min.，在用1.8mg/ml鼠尾胶原I包被的培养容器中。例如，将培养
18小时后的非粘附组织去除，并且用PBS短暂洗涤粘附细胞和组织，然后
补充包含0.1%(v/v)两性霉素的新鲜培养基。
(8)VEC的纯化，通过抗体和磁性微珠，优选通过使用抗体缀合的基材
如抗体缀合的微珠，例如具有抗CD31抗体的微珠。优选地，重复(7)中所
述的接种和补充以进一步扩增纯化的VEC。
在第五个优选实施方案中，将所述VEC接种在培养容器上以在第四个
优选实施方案中详细说明的培养基中产生几乎汇合的单层，然后将从分离
并纯化的天然胰岛解离的细胞或细胞簇接种在VEC单层上以促进胰岛的细
胞或细胞簇增殖。优选地，在形成VEC单层之前，使VEC进行第四个优
选实施方案中的接种和培养(7)和/或纯化(8)。
在根据第一个、第四个或第五个优选实施方案的实施方案中，所述VEC
来源于分离所述NEEC的相同的供体组织，或者来源于待移植所述IPT或
天然胰岛的受体的组织。
在根据前述实施方案中的任一个的实施方案中，通过利用以下(9)-(11)
的培养技术允许形成所述NEEC和VEC的组织复合物来产生所述IPT：
(9)如第二个优选实施方案的第一细胞去除(4)中一样去除所述NEEC
和VEC，以及在低粘附培养容器中产生NEEC和VEC的组织复合物。
(10)产生所述组织复合物，通过将所述去除(9)中获得的所述NEEC和
VEC放置入具有含血清的分化培养基的低粘附培养容器，并且旋转所述低
粘附培养容器直至组织复合物开始形成。
这两种细胞优选具有97/3-70/30，更优选97/3-75/25或95/5-70/30，更
优选90/10-70/30或95/5-75/25，并且更优选90/10-75/25的细胞数量混合比
例。
优选地，包含培养血清的分化培养基包括激活蛋白、其它生长因子和
CaCl2。更优选地，包含培养血清的分化培养基还包括骨形态发生蛋白如
BMP-7或BMP-4。更优选地，包含培养血清的分化培养基包括β细胞素
(Betacellulin)和/或毒蜥外泌肽-4(Exendin-4)。在优选实例中，包括激活蛋白、
β细胞素、HGF(肝细胞生长因子)、胃泌素、IGF(胰岛素样生长因子)-1、
KGF、VEGF(血管内皮生长因子)、BMP7、毒蜥外泌肽-4、抗坏血酸和CaCl2。
在一详细实例中，培养基包含具有20mM的D-葡萄糖的DMEM/Ham's
F-12，其补充了2%(v/v)的FCS、2ng/ml的激活蛋白A、5ng/ml的β细胞
素、20ng/ml的HGF、20ng/ml的胃泌素、20ng/ml的BMP7、20ng/ml的
IGF-1、5ng/ml的KGF、20ng/ml的VEGF、20ng/ml的毒蜥外泌肽-4、10
mM的烟酰胺、0.1mM的抗坏血酸以及1mM的CaCl2。优选进行容器的
旋转运动直至培养基中出现IPT的球形簇，优选以低于10、15或20rpm
的速度进行；例如，在37°C和5%CO2下进行18-24小时。
(11)用如所述产生(10)中的相同方法使所述IPT成熟，除了将培养容
器水平放置不动并且培养基不含CaCl2。在优选实例中，在约20天的整个
成熟期中每1-2天补充培养基。
在根据前述实施方案中的任一个的实施方案中，待加入培养基的抗生
素为50-100U/ml青霉素和50-100微克/ml链霉素，或者链霉素可以用
50-100U/ml庆大霉素代替。
在根据前述实施方案中的任一个的实施方案中，待加入培养基的ITS
(胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠补充物)的储备溶液包括约5微克/ml胰岛素和
约5微克/ml转铁蛋白，并且包括优选0.5-5ng/ml，更优选0.5-5ng/ml，例
如约1.25ng/ml的亚硒酸钠。
在根据前述实施方案中的任一个的实施方案中，所述IPT包含更大量
的组织，所述组织与没有用实施方案中所示方法的组织相比具有更大比例
的胰岛素生成细胞。
在根据前述实施方案中的任一个的实施方案中，所述IPT包含这样的
细胞，其比没有用实施方案中所示技术的细胞形成的组织产生更多胰岛素。
在根据前述实施方案中的任一个的实施方案中，所述IPT功能包括分
泌同种天然胰岛所产生的胰岛素的少于5%、10%、40%、60%、80%或100%。
在根据前述实施方案中的任一个的实施方案中，所述IPT功能包括与
没有用实施方案中所示技术相比的更大的胰岛素分泌的葡萄糖-反应性。
在根据前述实施方案中的任一个的实施方案中，所述IPT功能包括在
将IPT移植入受体时使糖尿病受体的葡萄糖控制能力正常化。
在根据前述实施方案中的任一个的实施方案中，所述天然胰岛的增殖
与没有用实施方案中所示方法相比更大程度增加。
这里我们进一步详细地描述体外培养方法的实施方案，所述方法使得
获得自出生后的胰脏的非内分泌上皮细胞(NEEC)能够生成胰岛素生成组
织(IPT)，所述胰岛素生成组织包含这样的内分泌细胞，其以适当程度的葡
萄糖反应性分泌胰岛素，多达天然胰岛产生的10%的。
在本发明的第一和第三方面，我们采用这样的培养方法，使用以下三
组不同细胞中的至少两组。一组是分离自胰脏的NEEC。这些细胞可以定
义为位于胰导管内或附近的具有上皮特征的祖细胞，或者定义为泡心细胞。
最近，将这些细胞用Aldefluor染料标记，这利用了祖细胞中醛脱氢酶的高
酶促活性(Rovira et al.,2010,PNAS 107:75-80)，并且预测这些细胞比以前认
为的更丰富。
用含血清的培养基如具有10%的FCS的RPMI1640将去除胰岛后的胰
脏丢弃物如经胶原酶消化的胰脏丢弃物接种在用胶原I等包被的培养容器
或培养基材上。这种初始孵育允许粘附细胞和组织粘附至包被的表面，从
而捕获细胞，主要是NEEC。对于这样的捕获，允许培养进行优选8-56小
时，更优选12-48小时；优选在37°C左右，具有增加浓度的CO2。在这样
的捕获的过程中，NEEC的初始孵育或培养发生。然后将含血清的培养基
用包含FGF-2或类似生长因子的第一无血清培养基代替以刺激增殖，优选
维持8-48小时，更优选维持12-36小时；例如，维持24小时。这段时间之
后，将培养基进一步用另一或第二无血清培养基替换，所述无血清培养基
优选包含KGF或类似生长因子和/或一些成纤维细胞样细胞的生长抑制剂；
例如包含0.1nM的2-巯基乙醇、0.2%的BSA、1g/L的ITS，10mM的烟
酰胺和10ng/ml的KGF的无血清培养基；优选在37°C左右，具有增加浓
度的CO2。2-巯基乙醇抑制成纤维细胞样细胞的生长，所述成纤维细胞样
细胞倾向于破坏上皮细胞的生长。待加入无血清培养基的ITS储备溶液优
选包含5微克/ml胰岛素、5微克/ml转铁蛋白，以及0.5、1.25、2.5、5或
更优选1.25ng/ml亚硒酸钠。
通常NEEC克隆集落在培养中规模生长7-10天。因此，第二无血清培
养基中的培养优选每2-3天补充培养基，优选维持3-20天，更优选维持5-15
天，优选在37°C左右，具有增加浓度的CO2。通过这样的初始集落生长，
直径10-30微米大小的NEEC克隆集落出现。在用于上述培养的任何含血
清或无血清的培养基中，如果需要，可以加入支原体去除剂以阻止支原体
感染。
随后优选每2-3天用具有降低的糖浓度(如7mM的D-葡萄糖或以下)
的相同培养基补充无血清培养基，以便防止自发产生胰岛素生成细胞。
在优选实施方案中，采用Notch受体的多水平刺激，所述Notch受体
作为关键信号转导物发挥功能以启动细胞周期。当足够数量的单层细胞生
长至大于70%汇合时，将细胞用Accutase从培养容器解离，通过40微米尼
龙网过滤，并且接种在用包埋KGF的胶原I包被并用抗Notch I抗体进一
步处理的培养容器上。
本发明的传代方法利用双向Notch激活刺激：一种通过上文所述的抗
Notch 1抗体或其它类似的Notch激活抗体胞外刺激Notch受体；另一种通
过阿托伐他汀或者具有Notch途径激活特性的可能的其它类似的他汀类胞
内刺激。他汀类为HMG-CoA还原酶抑制剂，这些包括阿托伐他汀和辛伐
他汀等。已知阿托伐他汀促进早老蛋白1(Presenilin 1)的表达，早老蛋白1
是潜在的内分泌祖细胞的正诱导物。改良的无血清培养基中的阿托伐他汀、
辛伐他汀或其它他汀类的浓度优选0.01-1.0微摩尔，更优选0.03-0.3微摩尔，
例如0.1微摩尔。
或者，胶原包被不用KGF制备也不用抗Notch 1抗体进一步处理；取
而代之，将初始集落生长步骤(3)的培养基中的KGF用10、15、20和30ng/ml，
并且更优选20ng/ml的HGF，10、15、20、30、40或50ng/ml，并且更优
选40ng/ml的EGF以及2、4、6、8或10微摩尔，并且更优选4的rock
抑制剂代替。培养基进一步补充阿托伐他汀以及10、15、20或30ng/ml，
并且更优选20的BMP4或BMP7以富集在后来分化时倾向于成为内分泌细
胞的NEEC。
用于培养的另一组细胞是紧密粘附在一起形成细胞团的上皮细胞。这
些细胞在本文所述的培养条件下快速增殖，并且可能是腺泡细胞的先祖和/
或去分化为具有导管样或导管先祖样表型的细胞。初始无血清培养基培养
物包含大量的这些上皮细胞团，据认为其通过分泌一些未鉴定的旁分泌因
子来增加NEEC的增殖。通过用组织解离酶处理如Accutase处理去除NEEC
后，这些细胞仍粘附于培养容器，因此称为“剩余细胞(LOC)”。然后通过
更强的解离酶如蛋白酶将这些细胞从培养容器去除；例如，通过用0.05%
胰蛋白酶-EDTA在37°C下处理3-5min，用无血清培养基洗涤，转移至
transwell小室并放置在培养基中用于增加NEEC的增殖。
第三组细胞为血管内皮细胞(VEC)，其可以从收集自用于捕获NEEC
的培养物的组织碎片培养。优选6-54小时后，更优选9-36小时后从前述用
于捕获粘附细胞或组织的培养物中的漂浮碎片收集VEC。利用抗CD31抗
体缀合的磁珠纯化培养的VEC。
本发明的一实施方案提供在低粘附培养容器中从NEEC和VEC产生组
织复合物的方法；这两种细胞优选具有97/3-75/25，更优选95/5-70/30的细
胞数量混合比例；即，对于NEEC的细胞数量比上NEEC和VEC的细胞数
量的总和，优选具有3%-25%的混合比例，并且更优选具有5%-30%的比例。
通过旋转低粘附培养容器来产生组织复合物，优选旋转6-72小时，更优选
旋转9-48小时，进一步优选旋转18-24小时，优选在37°C左右，具有增加
浓度的CO2。进行旋转直至IPT的球形簇出现在培养基中。这里使用的培
养基优选包含激活蛋白、β细胞素、HGF、胃泌素、IGF1、KGF、VEGF、
BMP7、毒蜥外泌肽4、抗坏血酸和CaCl2。
在优选实施方案中，采用前述相同的方法使所述IPT成熟，除了使培
养容器水平放置不动以及培养基没有CaCl2。在约20天的整个成熟期中每
1-2天补充培养基。
本发明描述通过体外产生获得自出生后的胰脏的非内分泌上皮细胞
(NEEC)和血管内皮细胞(VEC)的组织复合物来增加胰岛素生产组织(IPT)的
形成和功能的方法。分离VEC的组织来源和VEC本身的生理状态在本发
明中均很重要。因为血管内皮细胞的表型特征是异质的，部分取决于它们
位于的器官、组织和细胞的种类(Crivellato et al.,2007,J.Anat.211:415-427)，
看来VEC的组织或器官特异性是增加NEEC分化为IPT和/或天然胰岛细
胞的增殖的关键因素。此外，与NEEC一起用于产生组织复合物和随后的
IPT的VEC优选具有孔，正如通常在天然胰岛中的血管内皮细胞中观察到
的表型。因此，本发明中所用的分化培养基包含已知刺激VEC形成穿孔的
VEGF。
增加IPT的形成和功能的方法设计为两步：一步是分离和扩增NEEC
和VEC两种类型的细胞，另一步是从这两种细胞产生组织复合物。这些步
骤在本文中的各章节于实施例和/或权利要求的标题下详细描述。
为了分离包含胰岛祖细胞的细胞群体，可以通过细胞计量术用各种表
面标记分选细胞。这种方法的缺点是分选的细胞的量常不足以用于培养扩
增先祖，所述先祖通常不无限增殖并受到分选过程引起的损伤。另一缺点
是由于个体细胞样品之间的变异，所用的一组表面标记可能产生分选偏差；
因此，获得的细胞是否为靶先祖仅可以在产生功能性内分泌细胞后更严格
地评价。
为此，我们采用允许选择性扩增靶祖细胞的细胞培养方法。将已去除
胰岛后的剩余组织胰脏丢弃物接种于具有适当的培养基和生长因子的培养
容器中，以促进预期的先祖而不是非靶细胞的增殖。在以前的研究中，已
尝试设计许多方法以选择性扩增可以产生胰岛素生成细胞的祖细胞。例如，
Todorov等人(2006,Pancreas 32:130-138)在胶原I包被的瓶中利用人胰脏组
织丢弃物用含血清的培养基扩增表达pdx1的上皮细胞。这种方法已为我们
目前的发明建立基础，并且已对培养基和生长因子的选择进行各种修改。
如Bonner-Weir等人(2000,PNAS 97:7999-8004)和Katdare等人(2004,J.
Endocrinology 182:105-112)在他们的选择性方法中所用的，我们使用补充了
10%热灭活的FCS的RPMI1640以促进选择性细胞粘附在胶原I包被的表
面上。在这些研究中，将培养基转换为包含胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)、5-10
mM的烟酰胺和10ng/ml的KGF(FGF-7)的无血清培养基。据说烟酰胺促
进上皮细胞生长。Katdare等人(2004)还使用2-巯基乙醇以阻止成纤维细胞
样细胞的生长。我们已通过加入克隆集落诱导的另一中间步骤来修改他们
的方法，其中FGF-2和LIF用作补充物，以便无差别地促进粘附细胞生长
24小时。然后将培养基换为补充了2-巯基乙醇、烟酰胺和KGF的另一无
血清培养基，其允许进一步的细胞增殖。在随后的2-7天的时间内，相当
数量的直径10-30微米大小的上皮细胞克隆集落出现。这些细胞至少处于
初始扩增阶段，不形成紧密结合的上皮片而保持为松散邻接的单个细胞的
簇。我们已命名这些细胞为“非内分泌上皮细胞(NEEC)”，表明它们是较
大类别的上皮细胞内的细胞异质组，包括尚未获得内分泌功能的先祖。为
了防止过早产生内分泌细胞，在剩余的NEEC培养中将无血清培养基中的
葡萄糖维持在7mM或低于7mM。在这个初始培养步骤中，我们允许紧密
粘附的上皮细胞与NEEC一起生长，因为前者可能分泌某些未鉴定的生长
因子，看来所述生长因子促进后者NEEC的生长。我们已将这些紧密粘附
的上皮细胞命名为“剩余细胞(LOC)”，其粘附在通过前述Accutase处理去
除NEEC的培养容器上。LOC然后通过后来的胰蛋白酶消化去除。
对于胶原包被的培养容器、孔平板或培养皿，我们修饰其表面特性以
增加NEEC的粘附性；这通过在RT下(室温，或者在25°C左右)用PBS中
的浓度为1:100-1:1000的抗E钙粘着蛋白抗体和抗cMet抗体处理胶原包被
的容器1小时来进行。这种抗体处理是为了相对于其它类型的细胞，增加
上皮细胞粘附的机会。其它类型细胞中的上皮细胞表达细胞-细胞间粘附分
子E-钙粘着蛋白，E-钙粘着蛋白还在胰内分泌先祖中表达；因此，预测它
们粘附至抗E钙粘着蛋白抗体包被的表面。与c-Met同义的HGF受体是表
征一些能够成为胰岛内分泌细胞的先祖的细胞表面分子之一(Suzuki et al.,
2004,Diabetes 53:2143-2152)。实际上，抗体处理增加每包被表面的上皮细
胞收率(图2A)；有趣的是，两种抗体的组合产生比单独任一种略低的细胞
收率。
分离自成年胰脏的先祖群体很可能在传代时停止增殖(Seaberg et al.,
2004,Nature Biotechnology 22:1115-1124)。Ta等人(2006,Stem Cells
24:1738-1749)通过用BMP-4诱导上皮-间充质转换(EMT)来克服这种增殖停
滞。根据他们的工作，EMT后纤维样细胞快速增殖。一旦培养物产生足量
的细胞，在产生胰岛样组织之前通过逆转过程间充质-上皮转换(MET)恢复
上皮特征。这种转换培养方法中的一个缺点是所得的胰岛样组织分泌少量
胰岛素，表明其可能阻碍所得组织的功能性输出。相比之下，从上皮细胞
产生的胰岛样组织如Bonner-Weir等人(2000)或Katdare等人(2004)产生的胰
岛样组织产生较大量的胰岛素。虽然后两个研究未显示传代的详细方法，
但是我们模拟他们的一些基本培养技术以提高传代时上皮细胞的均匀性但
不诱导EMT。
为了增加传代后NEEC的增殖，我们采用双向刺激Notch信号传导，
Notch是启动细胞周期的关键信号传导物。一向是通过使用抗Notch 1抗体
胞外刺激Notch受体，并且另一向是通过使用阿托伐他汀胞内刺激。当原
代培养物中足够数量的单层细胞生长至大于50%、60%、70%、80%、90%
或100%汇合，并且更优选70%汇合时，用Accutase从培养容器去除如单
细胞或小细胞团的NEEC细胞。排除较大的细胞团特别是LOC是通过用具
有约10、20、30、40、50、70或100微米，并且更优选40微米筛孔大小
的过滤布或其它过滤材料如尼龙网过滤细胞悬浮液来保证的。将过滤的
NEEC以约2/3、3/4或4/5，并且更优选3/4的原始细胞密度接种在用包埋
KGF的胶原I包被并用稀释倍数为1:1000的抗Notch 1抗体(Millipore Co.)
进一步处理的培养容器上。已知特定组的抗Notch 1抗体在肌肉细胞再生中
诱导Notch受体激活(Conboy et al.,2003,Science 302:1575-1577)。
然后使NEEC在通过加入0.1微摩尔阿托伐他汀改良的无血清培养基
中生长，已知阿托伐他汀正选择潜在的内分泌祖细胞。Cras-Meneur等人
(2009,Genes&Development 23:2088-2101)利用转基因小鼠模型证实在γ-分
泌酶的催化核心的早老蛋白1和2对于Notch信号传导和Ngn3+先祖获得
内分泌命运是必不可少的。已知早老蛋白1在中风后的神经细胞再生中由
阿托伐他汀上调(Chen et al.,2008,Stroke 39:220-226)。因此，我们使用阿托
伐他汀以增加上皮细胞池内的内分泌祖细胞，不过其它他汀类可以产生相
似效果。对于NEEC培养，可以通过用以下物质代替KGF来进一步改良无
血清培养基：覆盖10、15、20和/或30ng/ml的范围的HGF，并且更优选
20ng/ml的HGF；覆盖0、15、20、30、40和/或50ng/ml的范围的EGF，
并且更优选40ng/ml的EGF；和/或覆盖2、4、6、8和/或10微摩尔的范
围的rock抑制剂，并且更优选4微摩尔的rock抑制剂。对于NEEC培养，
无血清培养基还可以补充：0.01-1.0微摩尔，更优选0.03-0.3微摩尔的阿托
伐他汀，例如0.1微摩尔；以及覆盖10、15、20和/或30ng/ml的范围的
BMP，并且更优选约20ng/ml BMP4或BMP7，以便富集在后来分化时倾向
于成为内分泌细胞的NEEC。将解离的NEEC接种于新培养容器中后，将
包含LOC的transwell放置在它们之上以通过LOC分泌的增加增殖的旁分
泌因子促进它们增殖。对于所有这些培养，每2-3天用约10%、20%、30%、
40%、50%或60%，或者更优选40%条件培养基补充培养基，直至相当数
量的NEEC克隆集落生长。这些克隆集落自发形成细胞簇，可以将所述细
胞簇收获并传代以进一步富集，以便增加它们在分化时产生组织复合物的
倾向。
关于胰岛内分泌细胞的成年先祖的确切谱系已有争议(Dor et al.,2004,
Nature 429:41-46;Inada et al.,2008,PNAS105:19915-19919;Xu et al.,2008,
Cell 132:197-207)。我们认为存在在一定压力条件如本发明所述的培养条件
下可以增殖和产生胰岛内分泌细胞的成年祖细胞。几个研究表明出生后胰
脏中胰岛先祖的存在以及通过施用外部胁迫体内再生内分泌细胞；例如，
给予毒素如四氧嘧啶或链佐星，使胰脏进行胰脏切除这样的手术治疗，或
者捆扎胰管(称为导管结扎)。最近，据发现导管结扎造成大量胰脏炎症和
细胞凋亡然后胰岛祖细胞群体增殖(Xu et al.,2008)。先祖在成年胰脏组织中
的确切组织定位尚未阐明，但是许多研究已发现它们位于胰脏的导管和/或
泡心区域的证据，以及一些其它研究表明它们位于胰岛内。最近，用
Aldefluor染料(Stem Cell Technologies)对这类祖细胞的某些组进行了标记，
这利用了祖细胞中醛脱氢酶的高酶促活性(Rovira et al.,2010,PNAS
107:75-80)，并且发现其比以前认为的更丰富。
用于产生IPT的另一组细胞为血管内皮细胞(VEC)，其正常位于支配胰
岛和胰间充质两者整体的连续血管系统中。这些VEC也分离自捕获粘附细
胞或组织的12-48小时悬浮培养后收集的胰脏组织碎片。短暂地扩增包含
VEC的细胞后，将它们从培养容器去除，并且利用抗CD31抗体缀合的磁
珠(Mylteny Biolgy，Inc.)纯化VEC。将纯化的VEC在补充了内皮细胞生长补
充物(ECGS,Sigma-Aldrich Co.)的含血清的培养基中进一步扩增。这些使得
能够从各种组织和器官来源VEC培养的分离和培养技术是本领域已知的。
首先将NEEC和VEC在体外分别在不同培养基中扩增，然后在钙离子
(1mM)的存在下通过旋转运动将这些细胞混合以促进球形组织的产生。已
知过量的胞外钙离子诱导E-钙粘着蛋白分子同型结合在相邻细胞之间的表
面上，从而形成球形组织。
已知不仅通过细胞表面分子如钙粘着蛋白的同型结合而且异型细胞-
细胞间相互作用均在胰岛的器官发生期间发挥重要作用。必须注意到VEC
特别是在胰岛的早期发育阶段的作用(Yoshitomi&Zaret,2004,Development
131:807-817;Lammert et al.,2001,Science 294:564-567)。VEC所起的关于它
们与相邻细胞相互作用的作用的确是多方面的，产生其它类型细胞的生态
位，即术语“血管生态位”(Nikolova et al.,2007,Trends in Cell Biology
17:19-25)。VEC分泌胞外基质以支持相邻细胞的生物学，包括粘附、增殖
和功能。的确，在胰岛形态发生期间，胰脏内分泌祖细胞通过一组特定的
整联蛋白粘附并迁移在胞外基质上(Cirulli et al.,2000,Journal of Cell
Biology 150:1445-1458)。因为β细胞甚至在成熟期不具有它们自身的胞外
基质，所以预测它们的物理完整性取决于相邻VEC分泌的胞外基质。胰岛
内分泌细胞成熟后，它们通过除气体和/或营养交换之外的可能的机制与
VEC相互作用。例如，Johansson等人(2006,Endocrinology，147:2315-2324)
发现成熟胰岛细胞与相邻VEC之间的相互增强，VEC分泌HGF以促进β
细胞的增殖和维持，而后者反过来分泌VEGF以支持前者。虽然所有这些
研究可以指出异型细胞-细胞间相互作用的重要性，但是它们尚未证实分离
自胰脏组织的VEC可以促进成年胰脏先祖体外分化为胰岛素生成细胞。
有许多其它研究描述关于VEC分泌的胞外基质的VEC与β细胞之间
的细胞-细胞间相互作用的作用，并且一些研究发现这类相互作用增加胰岛
细胞功能的可能的用途。例如，Powers等人(2005,US20050048040A1)试图
通过重组成熟人胰岛细胞和已经解离的VEC来增加再次血管形成，从而增
加成熟人胰岛细胞的功能。文献中常描述还通过生长因子和胞外基质功能
性增强成熟胰岛细胞，但是在与胰VEC的细胞-细胞间相互作用的情况下
尚未证实成年胰脏祖细胞体外分化为胰岛素生成细胞的增加。
在我们目前的发明中体外产生IPT模拟了一些其它研究所用的悬浮培
养技术，并且证实所得的胰岛样组织分泌增加量的胰岛素入周围培养基
(Ogata et al.,2004,Endocrine Journal 51:381-386;Todorov et al.,2006)。此外，
本发明利用旋转培养方法，其中促进NEEC与VEC之间的直接接触以增加
异型以及同型细胞-细胞间相互作用以高效产生IPT。
首先通过用已知对哺乳动物细胞具有最小损伤的细胞去除酶Accutase
(Innovative Cell Technologies,Inc.)处理来将扩增或传代的NEEC从培养容
器去除。将细胞用PBS洗涤，用该物质淹没，在RT下孵育3-10min，用
培养基稀释，通过温和移液取出，并且通过在160X g下离心少于4min来
沉淀。去除上清，并且将细胞沉淀合并，用IPT生成培养基重悬，所述IPT
生成培养基包含补充了2%(v/v)的FCS、10mM的烟酰胺、0.1mM的抗坏
血酸以及表1所列的生长因子和促分裂原的具有20mM的D-葡萄糖的
DMEM/Ham's F-12。
同时，以相似的方式将VEC从培养容器去除，但是孵育10-15min，
并且在300X g下离心5min。然后将NEEC和VEC以分别95、90、80或
70%以及5、10、20或30%的各自比例在悬浮液中混合，并且更优选70%
和30%。悬浮液中典型的细胞密度为0.1X、0.5X、1.0X、5.0X和10.0X 105
个细胞/ml中的任两个之间，更优选5.0X 105个细胞/ml，并且将约0.5、0.75、
1.0或1.5ml，更优选1.0ml的细胞悬浮液装入超低粘附6-孔板(Corning,Inc.)
的各孔。向包含细胞混合物的板进一步补充1mM CaCl2，将其放置在定轨
摇床上并以低于10、15、20或25转/分钟，更优选20转/分钟的转动速度
在37°C和5%CO2下旋转18-24小时。这段旋转培养期后，细胞通常形成
直径100-200微米的组织球；然后，将培养基完全更换，没有CaCl2，并且
水平放置不动。在约20天的整个成熟期中每1-2天补充培养基。在这个培
养的最后步骤期间，一些球形组织或IPT粘附在一起以形成更大的组织团，
从许多组织团出现较小的半透明组织芽。以这种方式形成的组织球具有比
仅由NEEC组成的组织球显著更光滑的表面纹理和更明显分界的外组织
膜，对于仅由NEEC组成的组织球，培养基倾向于污染显然从组织球分离
的小细胞片段。因此，由NEEC和VEC组成的组织复合物可以维持它们的
物理完整性，而由NEEC单独组成的组织球更脆弱，表明VEC和/或由它
们分泌的基质可能增加组织复合物的物理完整性。
关于NEEC和IPT体外产生和分泌胰岛素的能力，NEEC和IPT的表
征常规通过如RT-PCR、免疫细胞化学或免疫组织化学、以及胰岛素或C-
肽ELISA的方法进行。如果在所用的培养基包含胰岛素作为底物使得难以
定量新分泌的胰岛素，则检测C-肽。单个胰岛素生成细胞理论上产生等摩
尔量的C-肽和胰岛素，虽然通过ELISA定量不一定获得两种蛋白平行的估
计量。
在以下方法中通过RT-PCR进行基因表达分析。将NEEC或IPT从培
养基去除并在PBS中洗涤，并且将收集的细胞或组织在细胞溶解缓冲液中
通过1秒脉冲3-4次超声处理。通过RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,Inc.)提取
总RNA，并且通过RNase-free DNase I Set(Qiagen,Inc.)进一步纯化以去除
可能的DNA污染物。将20ng纯化的RNA用作模板以利用SuperScript III
(Invitrogen,Inc.)用随机六联体(Invitrogen,Inc.)合成cDNA，并且将所得的
cDNA用RNase H加工以去除可能的RNA污染物。通过HotStartTaq PCR
反应混合物(Ambion,Inc.)与20ng cDNA模板用表2所示的引物、退火温度
和循环数进行半定量PCR。通过指定产物分子大小的DNA条带相对于内
对照GAPDH的DNA条带的强度定量PCR产物。
在以下方法中进行免疫细胞化学。将NEEC传代培养至具有各自阶段
的培养基的胶原I包被的载玻片室。将胶原I包被的腔式载玻片用之前使用
的生长因子或抗体预处理。一旦细胞以适当密度生长，将它们用PBS洗涤
3次，在冷甲醇中固定10min或者在70%乙醇中于RT下固定30min，风
干，用PBS洗涤并用封闭液(Dako,Inc.)封闭。将细胞用一抗染色，用包含
具有0.1%的BSA和0.1%的Tween20的PBS的洗涤缓冲液洗涤，并且与二
抗孵育，然后在封闭缓冲液中DAPI染色，用VectraShield封固，并且在倒
置荧光显微镜下观察。对于检测Ngn3的免疫细胞化学，将培养的细胞在磷
酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛中于RT下固定10min，并且用0.1%甘氨酸溶
液终止固定。通过用0.2%胰蛋白酶溶液处理细胞来暴露免疫表位，然后用
封闭液和抗Ngn3抗体进一步处理细胞。
对于静态孵育以测试产生的IPT的葡萄糖反应，将约20IEQ的IPT或
天然胰岛(1IEQ=1直径200微米的IPT)装入具有200微升含5mM葡萄糖
的KREBS缓冲液的U形底96孔板的各孔中。通过移液小心地重新更换缓
冲液，并且在37°C和5%CO2下孵育1小时(预孵育)。然后相似地将IPT
用200微升含5mM葡萄糖的KREBS缓冲液洗涤并孵育2小时(低葡萄糖
孵育)。孵育之后，从孔收集KREBS缓冲液，用含20mM葡萄糖的相同缓
冲液洗涤几次并孵育2小时(高葡萄糖孵育)。孵育之后，收集KREBS缓冲
液并在-30°C下储存直至分析。根据制造商的方案进行ELISA。成熟20天
后产生的IPT通常以适当程度的葡萄糖反应性分泌胰岛素，多达天然胰岛
产生的10%。
本发明的这些和其它目的通过下文所述的一个或多个实施方案提供。
本发明的一实施方案提供通过体外产生由NEEC和VEC组成的组织复
合物来增加IPT的形成和内分泌功能的方法。所述方法允许从给定细胞来
源获得增加量的IPT，并且赋予IPT增加的关于胰岛素分泌的内分泌功能。
在增加IPT的形成和内分泌功能的方法的另一实施方案中，NEEC和
VEC均可以分离自相同的出生后的哺乳动物胰脏，并且后者还可以分离自
其它体细胞组织。
NEEC是位于胰脏导管和/或泡心细胞中但缺少胰岛素或其它内分泌激
素分泌的细胞。
在增加IPT的形成内分泌功能的方法的另一实施方案中，NEEC可以
获得自胰脏丢弃物，所述胰脏丢弃物是酶促消化胰脏随后去除胰岛后剩余
的组织。
本发明的一实施方案提供体外培养所述NEEC的方法，所述方法包括
细胞捕获步骤，其中将所述胰脏丢弃物接种于在用0.2mg/ml鼠尾胶原I包
被并用浓度为1:100-1:1000的抗E-钙粘着蛋白抗体和抗c-Met(HGF受体)
抗体进一步包被的培养容器中的包含10%(v/v)的FCS的RPMI1640中。优
选在37°C左右和5%CO2左右捕获组织24-36小时。
本发明的另一实施方案提供体外培养NEEC的方法，所述方法包括集
落诱导步骤，其中将细胞捕获步骤中的培养基换为在包含7mM的D-葡萄
糖的DMEM/Ham's F-12中的包含1g/L ITS(5微克/ml胰岛素、5微克/转铁
蛋白、5ng/ml亚硒酸钠)、20ng/ml重组人FGF-2和1400U/ml重组人LIF
的无血清培养基，并且培养至少24小时。
本发明的另一实施方案提供体外培养NEEC的方法，所述方法包括初
始集落生长步骤，包括将集落诱导步骤中的培养基换为在包含7mM的D-
葡萄糖的DMEM/Ham's F-12中的包含1g/L ITS、0.2%BSA、10mM烟酰
胺和10ng/ml重组人KGF的另一无血清培养基，并且培养至少5-7天。所
述培养基优选在培养的后期包含0.02微摩尔2-巯基乙醇，以便抑制可以阻
止NEEC生长的成纤维细胞的生长，并且包含支原体去除剂以抑制可能的
支原体感染。每2-3天补充培养基直至相当数量的直径10-30微米大小的
NEEC克隆集落出现。
本发明的一实施方案提供传代NEEC以用于它们的选择性扩增的方
法，所述方法包括细胞去除步骤，其中用组织消化酶Accutase处理培养容
器来从培养容器去除NEEC。将去除的细胞在160Xg或低于160Xg离心少
于4min。
本发明的另一实施方案提供传代NEEC以用于它们的选择性扩增的方
法，所述方法包括培养步骤，其中将先前步骤中去除的细胞接种在与先前
步骤中相同但用终浓度为1:100-1:1000的抗Notch 1抗体预处理的培养容器
上，在相同但具有0.1微摩尔阿托伐他汀的培养基中培养。每2-3天用40%
条件培养基补充培养基直至生长出相当数量的NEEC克隆集落。
在另一实施方案中，或者，不用KGF或抗Notch 1抗体制备胶原包被，
将初始集落生长步骤(3)的培养基中的KGF用10、15、20和30ng/ml，并且
更优选20ng/ml的HGF，10、15、20、30、40或50ng/ml，并且更优选40
的EGF以及2、4、8、14或20微摩尔，并且更优选4的rock抑制剂代替。
0.01-1.0微摩尔，更优选0.03-0.3微摩尔，例如0.1微摩尔的阿托伐他汀，
以及10、15、20和3020ng/ml，并且更优选20ng/ml的BMP4或BMP7，
以便富集在后来分化时倾向于成为内分泌细胞的NEEC。
在本发明的另一实施方案中，上皮细胞团在通过Accutase处理去除
NEEC后仍粘附于培养容器，因此称为“剩余细胞(LOC)”，然后用0.05%
胰蛋白酶-EDTA在37°C下保持5min来从培养容器去除所述上皮细胞团，
用无血清培养基洗涤，转移至transwell并放置在用于增加NEEC增殖的培
养基中。
在本发明的另一实施方案中，与transwell中的LOC一起培养的NEEC
形成细胞簇，所述细胞簇可以传代以进一步富集，以便增加它们在分化时
形成组织复合物的倾向。
在本发明的一实施方案中，培养的NEEC可以在用全反式视黄酸和环
杷明KAAD处理时以表达转录因子Hes1(Notch信号传导的下游靶)和Ngn3
的细胞表征，从而表明能够产生胰岛素生产细胞的先祖的特性。
分离和培养VEC的方法的一实施方案包括从胰脏丢弃物或者收集自胰
脏丢弃物培养物的漂浮组织碎片分离VEC的步骤。这是将组织丢弃物或漂
浮组织碎片接种于在用1.8mg/ml鼠尾胶原I包被的培养容器中的已在
65.5°C下热灭活60-70min.的包含70-100微克/ml的ECGS和20%(v/v)的
FCS的RPMI1640中。培养18小时后包含非粘附细胞和组织的培养基用新
鲜培养基替换。
在分离和培养VEC的方法的一实施方案中，VEC可以通过使用抗体缀
合的微珠和抗CD31抗体来纯化，随后用先前步骤中所述的方法扩增。
在分离和培养VEC的方法的另一实施方案中，出于可能减弱免疫排斥
的目的，VEC来源于分离NEEC的相同供体组织或者待移植所述IPT的受
体的组织。
本发明的一实施方案提供在低粘附培养容器中产生NEEC和VEC的组
织复合物的方法；这两种细胞优选分别具有95、90、80或70%以及5、10、
20或30%的细胞数量混合比例。通过容器优选低于10、15、20或25rpm
的缓慢旋转运动，并在37°C左右和增加的CO2如5%CO2下维持18-24小
时产生组织复合物。
本发明的另一实施方案提供在培养基中产生组织复合物的方法，所述
培养基例如包含补充了2%(v/v)的FCS、2ng/ml的激活蛋白A、5ng/ml的
β细胞素、20ng/ml的HGF、20ng/ml的胃泌素、20ng/ml的IGF-1、5ng/ml
的KGF、20ng/ml的VEGF、20ng/ml的BMP7、20ng/ml的毒蜥外泌肽-4、
10mM的烟酰胺、0.1mM的抗坏血酸以及1mM的CaCl2的具有20mM的
D-葡萄糖的DMEM/Ham's F-12的培养基，直至在容器的旋转运动期间培养
基中出现IPT的球形团。
本发明的另一实施方案提供使所述IPT成熟的方法，其使用相同方法，
除了培养容器水平放置不动以及培养基没有CaCl2。在约20天的整个成熟
期中每1-2天补充培养基。
本发明的另一实施方案提供方法，其中将VEC接种在培养容器上以在
第四个优选实施方案中详细说明的培养基中产生几乎汇合的单层，然后将
从分离并纯化的天然胰岛解离的细胞或细胞簇接种在VEC单层上以促进胰
岛的细胞或细胞团增殖。
在本发明的产生IPT的方法的一实施方案中，产生的IPT包含更多数
量的组织。
在本发明的产生IPT的方法的另一实施方案中，与没有使用所述方法
相比，所产生的IPT包含产生更多胰岛素的细胞。
在本发明的产生IPT的方法的另一实施方案中，因此产生的IPT的功
能包括分泌胰岛素，其是同种天然胰岛产生的胰岛素的少于5%、10%、40%、
60%、80%或100%，例如10%左右。
在本发明的产生IPT的方法的另一实施方案中，IPT的功能包括比不用
所述方法的IPT更强的胰岛素分泌的葡萄糖-反应性。
在本发明的另一实施方案中，从分离和纯化的天然胰岛解离并接种在
VEC单层上的细胞或细胞簇与接种在没有VEC的基质上的细胞或细胞簇
相比增殖增加。
在本发明的另一实施方案中，待加入培养基的抗生素为50-100U/ml
青霉素和50-100微克/ml链霉素，或者链霉素可以用50-100U/ml庆大霉素
代替。
[表1]
表1用于培养NEEC、VEC和IPT的生长因子
rh：重组人：mh：重组鼠：括号表示施用的细胞或组织类型。
[表2]
表2用于PCR的引物对
(F)和(R)分别表示正向和反向。
<定义>
术语“胰脏”或“胰腺”在本领域中认为是以及指的是位于哺乳动物
生物体腹腔中的脾和十二指肠之间的内分泌和外分泌器官。
如本文所用，“胰岛”指胰脏中的小组织簇，其分泌内分泌激素如胰岛
素、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽和grherin。
如本文所用，“胰脏丢弃物”指从胰脏去除胰岛后剩余的胰脏组织。在
临床胰岛移植中，将供体胰脏组织通过胶原酶消化以及一系列随后的纯化
步骤处理以收集胰岛组织，产生作为副产物的大量胰脏丢弃物。已经陈述
并已尝试，可能位于其中的胰岛祖细胞可以用于细胞疗法以治疗糖尿病。
如本文所用，“非内分泌上皮细胞(NEEC)”指分离自出生后的哺乳动
物胰脏的细胞，其由较大的上皮细胞类别中的异质细胞组成，包括尚未获
得内分泌功能的先祖。因此NEEC包含能够在体外增殖并产生胰岛素生成
组织(IPT)的细胞。NEEC可能位于胰脏的导管部分和/或可以与泡心细胞同
义，因为它们可以表征为Aldefluor阳性细胞。
如本文所用，“剩余细胞(LOC)”指从培养容器初始去除NEEC用于传
代后剩余的紧密粘附在一起形成细胞团的上皮细胞。这些细胞在本文所述
的培养条件下快速增殖，并且可能是腺泡细胞、导管细胞的先祖和/或去分
化以具有导管样或导管先祖样表型的细胞。据认为这些细胞通过分泌一些
未鉴定的旁分泌因子来增加NEEC的增殖。
如本文所用，术语“血管内皮细胞(VEC)”指分离自出生后的哺乳动物
胰脏的血管内皮细胞。VEC还可以获得自骨髓细胞或外周血。VEC来源于
分离NEEC的相同供体，或者更优选来源于待移植IPT的受体。
如本文所用，术语“胰岛素生成组织(IPT)”指形成球形组织复合物的
细胞组，其可以在体外产生并成熟为可以分泌胰岛素以及其它可能的内分
泌激素的内分泌组织。
如本文所用，“产生(generation)”或“产生(generating)”指组织形成过
程，其中可以归类为NEEC的细胞经历变化以成为可以满足IPT的定义的
组织复合物。因此，本发明所述的培养条件影响下的NEEC改变以成为或
“产生”IPT。
如本文所用，“祖细胞”指这样的细胞，其选择性培养自胰脏丢弃物，
能够在本发明具体说明的条件下增殖和传代，可以表征为具有成为胰内分
泌细胞的能力，并且在用全反式视黄酸和环杷明KAAD时鉴定为Ngn3阳
性细胞。
如本文所用，“培养”指通过在允许细胞增殖或产生功能性组织的环境
中孵育来繁殖或培育细胞、细胞簇、组织复合物或天然胰岛细胞。培养需
要包含通常支持待培养的细胞、细胞簇、组织复合物或天然胰岛细胞的生
长和/或功能成熟的适当的生长因子、促分裂原、和/或分化因子的培养基。
如本文所用，“组织复合物”指为了产生胰岛素分泌组织(IPT)的目的而
获得的两组细胞的组合物。通过使给定混合比例的这些细胞在低粘附培养
容器中缓慢旋转运动形成组织复合物。组织复合物可以在本文所述的补充
了1mM的CaCl2的无血清培养基中培养。培养基中的钙离子激活相邻细胞
之间的钙粘着蛋白分子，从而促进细胞-细胞间粘附，因此形成组织复合物。
除非另有说明，本发明的实施采用本领域技术内的细胞生物学、细胞
培养、分子生物学、微生物学、重组DNA的常规技术。这些技术描述于文
献；例如Basic Manuals for Molecular Biology，Book 3"Truly-Amplifying
PCR"(Yodo Publishing,Inc.,2004);Culture of Animal Cells(R.I.Freshney,
Alan R.Liss,Inc.,1987);Immunocytochemical Methods and Protocols,Vol.
115in Methods in Molecular Biology(Lorette C.Javois,eds.,Humana Press,
Totowa,NJ,1994);The ELISA Guidebook(Methods in Molecular Biology)by
Crowther(Humana Press,2000);Methods in Cell Biology，Vol.41,Flow
Cytometry,2ndEd.,ed.By Darzynkiewicz,Robinson and Crissman(Academic
Press:1994)。
<实施例>
用来产生以下分析的结果的实验方法的细节描述于相应的实施例。图
中所示的误差棒代表以下数字的标准差。将附图中的每张照片图像通过图
像转换从彩色图像转换为灰度图像，或者通过RGB分色并采用红色、绿色
和蓝色分离图像之一。
实施例
[实施例1]
<收集胰脏丢弃物>
导管内注射2.0-2.5ml的HBSS(Sigma-Aldrich Co.)中的0.1%胶原酶
S-1(Nitta Gelatin,Inc.)后立即收获小鼠胰腺(C57Bl/6)。将这些胰腺在HBSS
中于37°C下孵育20min，在冰上冷却并与额外的没有添加剂的10ml的
RPMI1640(Invitrogen,Co.)剧烈振荡。然后使胶原酶消化的胰脏组织通过
1.0mm钢丝网以去除大部分是脂肪和结缔组织的大团碎片。然后通过在
250Xg和4°C下离心2min来将胰脏洗脱物用50ml的RPMI1640洗涤3
次。将约1ml的组织沉淀用15ml的M-Kyoto溶液(Ohtsuka Pharmaceutical
Co.)和Optiprep(Axis-Shield,PoC AS,Oslo,Norway)的混合物(密度调节至
1.1g/ml)重悬入50ml圆锥管。然后，将悬浮液用15ml的另一混合物(密度
调节至1.077g/ml)温和覆盖，并且用5ml的RPMI1640进一步覆盖。将分
层的悬浮液在400Xg和4°C下离心20min。将包含大多数胰岛的中间不透
明层通过小心移液取出以用于实施例14中的天然胰岛细胞增殖测试，而剩
余的悬浮细胞和组织以及底部的组织碎片全体确认为“胰脏丢弃物”，并且
使其进行细胞捕获步骤。
[实施例2]
<非内分泌上皮细胞(NEEC)的细胞捕获>
通过在250Xg和4°C下离心2min来将胰脏丢弃物用50ml的
RPMI1640洗涤2次，并且立即用包含血清的培养基，补充了10%热灭活
的FCS(HyClone Laboratories,Inc.)和PenStrep(终浓度=50/50的青霉素/链
霉素，Wako Chemicals Co.)的RPMI1640接种在6-孔板或10cm平皿
(Greiners Inc.)上。或者，将胰脏丢弃物的组织团用Accutase(Innovative Cell
Technologies,Inc.)在RT下进一步解离10min。将来自约一个胰脏的胰脏消
化物接种在每个板或皿中。为了捕获NEEC的目的，将板或平皿用0.2-0.25
mg/ml鼠尾胶原I(BD Biosciences)在RT下预包被1小时，并且用浓度为
1:100-1:1000的抗小鼠E-钙粘着蛋白抗体(克隆：36/E-钙粘着蛋白，BD
Biosciences)和/或抗c-Met(HGF受体)抗体(Wako Chemicals,BAF527)在RT
下进一步包被1小时。将组织在37°C和5%CO2下培养24-36小时。在此
期间，将漂浮的组织碎片与培养基一起去除一次并加入新鲜的含血清的培
养基。图1A为显微图像，示出当仅抗c-Met用作包被在皿表面上的抗体时
因此获得的保持粘附在胶原I包被的平皿表面上的细胞。图2A为示出当
NEEC在E-钙粘着蛋白(“Ecad”)和/或抗c-Met(“cMet”)抗体的存在下或者
抗体不存在下培养18和36小时时因此获得的粘附在表面上的细胞数量的
图(双向ANOVA：效果=抗体处理之间，F=11.6，n=6/组，p=0.0003；效果
=18小时对36小时培养，F=87.7，n=6/组，p<0.0001)。
[实施例3]
<NEEC的集落诱导>
细胞捕获步骤后，温和旋转平板使得一些较大的组织团从包被的表面
释放后，去除培养基。为了诱导NEEC的克隆集落生长，向培养物加入在
含7mM的D-葡萄糖(Wako Chemicals Co.)、PenStrep(50/50)和细胞周期蛋
白B 1(Roche Pharmaceutical,Inc.)的DMEM/Ham's F-12中的包含1g/ml ITS
(终浓度：5微克/l胰岛素、5微克/l转铁蛋白、5ng/l亚硒酸钠)(MP Biomedicals,
LLC.)、0.2%BSA(Sigma-Aldrich Co.)、20ng/ml重组人FGF-2和1400U/ml
的重组人LIF的无血清培养基，并且在37°C和5%CO2下培养至少24小
时。图1B示出由此诱导的细胞集落的显微图像。为了比较，如实施例1，
对仅获得自相同胰脏的导管部分的组织(“导管组织”)而不是胰脏的整个
部分(“所有组织”)进行来自实施例1和2以及上述诱导步骤的相同程序；
还进行除了在诱导步骤省略人FGF-2的培养基的相同程序。结果如图2B
所示(双向ANOVA：效果=FGF-2处理对对照，F=75.9，n=6/组，p<0.0001；
效果=导管组织对所有组织，F=338.0，n=6/组，p<0.0001)。在这个诱导步
骤中包括FGF-2的无血清培养基比不包括FGF-2的培养基产生更多的
NEEC，并且整个胰脏丢弃物组织比接种前通过移液吸取手选的导管组织产
生更多的NEEC。
[实施例4]
<NEEC的初始集落扩增>
为了扩增NEEC集落，集落诱导步骤(实施例3)后，用在包含7mM的
D-葡萄糖、PenStrep(50/50)、0.02微摩尔2-巯基乙醇和细胞周期蛋白B1的
DMEM/Ham's F-12(1:1混合物)中的包含1g/L ITS、0.2%BSA、10mM烟
酰胺和10ng/ml重组人KGF的另一无血清培养基代替无血清培养基，并且
培养2天(图1C)。然后，每2-3天不用细胞周期蛋白B1但用40%条件培养
基对培养基进行补充，直至相当数量的直径10-30微米大小的NEEC克隆
集落生长2-7天的时间(图1D)。
[实施例5]
<NEEC的传代和选择性扩增>
将实施例4的初始生长步骤后的NEEC用PBS洗涤2次，并且通过用
Accutase在RT下处理细胞5min来将其从板去除。将去除的细胞通过40
微米尼龙网过滤，并且在160Xg或低于160Xg离心少于4min。将保留在
板上的细胞簇，剩余细胞(LOC)用相同的无血清培养基在不同容器中培养以
便后来用于实施例6中的transwell培养。将细胞沉淀用与实施例4中相同
的但还补充了0.1微摩尔阿托伐他汀(LKT Laboratories,Inc.)的无血清培养
基重悬。将细胞与这种悬浮培养基接种在如实施例2用鼠尾胶原I包被的
6-孔板、10cm评皿或4-孔载玻片室(Biocoat Cellware,BD Labware)上，但
是用于包被板的胶原溶液包含10ng/ml的KGF，并且将包被的表面用终浓
度为1:100-1:1000的抗小鼠Notch 1抗体(克隆：8G10，Millipore)进一步处
理。每2-3天用40%条件培养基补充培养基直至生长出相当数量的NEEC
克隆集落。在比较实验中，在从实施例1直到上述步骤的其它方面相同的
方法中省略抗小鼠Notch 1抗体。图2C(非配对t-检验，n=5/组，p<0.0001)
示出在抗Notch1抗体处理的胶原I包被的培养容器(“抗Notch1”)上以及
在未经处理的胶原I包被的培养容器(“未经处理的”)上传代的溴脱氧尿苷
阳性(Brdu+)细胞的百分比。通过如实施例4的相同方法进行免疫细胞化学。
如图4所示，“抗Notch1”的代表着增殖的Brdu+细胞的比例为“未经处理
的”大约2倍。
[实施例6]
<利用改良的无血清培养基和LOC用Transwell培养NEEC>
将实施例5的选择性扩增后的NEEC在改良的无血清培养基传代至胶
原I包被的12-孔transwell板(Millipore Co.)，所述改良的无血清培养基包含
具有7mM D-葡萄糖、PenStrep(50/50)、0.02微摩尔2-巯基乙醇、ITS(5
微克/ml胰岛素、5微克/ml转铁蛋白、1.25ng/ml亚硒酸钠)、0.2%BSA、
10mM烟酰胺、20ng/ml HGF、40ng/ml EGF、20ng/ml BMP7以及4微
摩尔rock抑制剂(Y-27632.2HCl)的DMEM/Ham's F-12，并且与放置剩余细
胞(LOC)的悬挂的transwell小室(一种具有多孔底部的容器，多孔底部覆盖
transwell板底部上的培养物并与其保持距离)培养3天。然后，对培养容器
的包被表面上(即，transwell板的底部上或“下室”中)的NEEC拍摄显微图
像，如图3-1A所示；并且对transwell小室中(即，transwell小室的底部上
或“上室”中)的LOC拍摄显微图像，如图3-1B所示。以这种方式生长的
NEEC常形成细胞簇(图3-1A，箭头)，所述细胞簇在一周的时间中规模生
长(图3-1C)。如图3-1A和图3-1B中的箭头所示，下室中的NEEC簇在培
养中位置上粗略地与上面的transwell小室中的LOC团对齐，这表明从LOC
团分泌的一些旁分泌因子生理上和/或细胞生物学上影响附近的NEEC。当
用LOC以这种方式生长NEEC时，NEEC簇的数量与没有LOC的对照相
比显著增加(图3-2，非配对的t-检验，n=3组/处理，t=0.0021)。图3-3示出
通过半定量RT-PCR检测的来自这些细胞的Pdx-1和Ins 1的mRNA表达。
虽然LOC表现出比天然胰岛甚至更大数量级的Pdx-1的强信号，但是NEEC
仅表现出中等信号。相比之下，当分化时，与NEEC相反，LOC未显示Ins1
的信号。注意到与小室中的LOC一起培养的NEEC(″NEECs+LOC")表现
出比没有LOC的NEEC(″NEECs-LOC")更大程度的Ins1信号。
[实施例7]
<培养富集分化为胰岛素生成细胞的先祖的NEEC>
将实施例5的选择性扩增后的NEEC传代培养至胶原I包被的载玻片
室(Biocoat Cellware,BD Labware)，并且在与实施例4中相同但具有0.1微
摩尔阿托伐他汀(ATS)的无血清培养基中培养5天。在“对照”中，省略阿
托伐他汀，因此，使用与实施例4中完全相同的培养基。随后通过用具有
20mM的D-葡萄糖、2%(v/v)的FCS、2ng/ml的激活蛋白A、5ng/ml的β
细胞素、20ng/ml的HGF、20ng/ml的胃泌素、20ng/ml的IGF-1、5ng/ml
的KGF、20ng/ml的BMP7、20ng/ml的VEGF、20ng/ml的毒蜥外泌肽-4、
10mM的烟酰胺以及0.1mM的抗坏血酸的DMEM/Ham's F-12(1/1)替换培
养基来诱导这些细胞分化3天。对于免疫细胞化学，将细胞在冷甲醇中固
定，用封闭液(Dako A/S的“过氧化物酶封闭剂”，包含过氧化氢和15mM
叠氮钠)在RT下封闭1小时，用抗胰岛素抗体(Millipore International,Inc.,
Linco 4011-01F)(1:400)在RT下处理30min，用封闭液洗涤，并且用Cy3
缀合的二抗(抗豚鼠IgG)(1:800)处理。将核用DAPI染色，将载玻片用
VectraShield(Vector Laboratories的抗褪色溶液的商品名)封固，并且在荧光
显微镜下观察(图4A)。相对于表示所观察的给定视野中的细胞总数量的
DAPI染色的核数量来计算胰岛素阳性细胞的百分比(图4B)。如图4B所示，
ATS处理的细胞的胰岛素阳性细胞的百分比显著大于对照细胞(非配对t-检
验：n=7/组，p<0.0001)。
[实施例8]
<鉴定NEEC为能够产生IPT的先祖>
将实施例7的富集和分化后的NEEC传代培养至胶原I包被的载玻片
室(Biocoat Cellware,BD Labware)，并且在与实施例4中相同但不含KGF
或阿托伐他汀的无血清培养基中培养至少24小时，有或无2微摩尔全反式
视黄酸(Wako Chemicals Co.)和0.25微摩尔环杷明KAAD(Merk Ltd.)。然后
使这些NEEC进行免疫细胞化学分析。将NEEC用pH=7.4的磷酸盐缓冲
溶液中的4%多聚甲醛(Wako Chemicals Co.)在RT下固定30min，并且用
PBS中的100mM甘氨酸终止固定剂。通过用1%的CaCl2溶液中的0.05%
胰蛋白酶在37°C下处理细胞10分钟来暴露免疫表位。将载玻片上的细胞
用封闭液(Dako,Inc.的“过氧化物酶封闭剂”)和抗Ngn3抗体(Millipore
International,Inc.,AB5684)(400:1)和FITC缀合的二抗(800:1)处理，然后通
过荧光显微镜观察(图5A)。通过Adobe Photoshop(第6版)颜色转换来分析
免疫细胞化学图像，并且将显示任意选择的阈值水平之上的颜色强度的细
胞称为Ngn3阳性。由此获得的NEEC内Ngn3阳性细胞的百分比如图5B
所示。用全反式视黄酸和环杷明KAAD处理的NEEC(″Cycl-K+RA")表现
出比未经处理的NEEC(“对照”)显著更大比例的Ngn3阳性细胞(n=3个细
胞样品/处理，p<0.0001；非配对学生-t检验)。
[实施例9]
<基因表达分析>
进行半定量RT-PCR以表征与胰岛内分泌先祖和胰岛素生成组织以及
分离自C57Bl/6小鼠的天然胰岛相关的mRNA的表达：Ngn3、Pdx1、NeuroD、
Ptfla、Notch1、Hes1、HNF6、Nkx6.1、Ins1和Ins2。通过RNeasy Mini试
剂盒(Qiagen,Inc.)从1.0X105个细胞提取总RNA，并且通过RNase-free
DNase I Set(Qiagen,Inc.)去除可能的DNA污染物。用20ng的RNA通过
Super Script III(Invitrogen,Inc.)用随机引物(Invitrogen,Inc.)进行逆转录，并
且将合成的cDNA用RNase H(Wako Chemicals Co.)处理以去除任何RNA
污染物。用20ng的cDNA通过使用Hot Start Taq Master Mix(Promega Co.)
用表2所列的给定引物对、退火温度和循环数进行PCR。通过凝胶-电泳用
2%琼脂糖凝胶和0.001%溴化乙锭分析扩增的PCR产物(图6A、6B、9A-9C)。
在图6A-6B中，数字1-4表示用于分析的组织或细胞培养样品：“1”，实施
例1的胰脏丢弃物；“2”，实施例7的在具有阿托伐他汀(ATS)的无血清培
养基中培养5天后的NEEC；“3”，实施例8的随后用包含全反式视黄酸和
环杷明KAAD的培养基培养24小时的NEEC(图5A-5B的“Cycl-K+RA”)；
以及“4”，是“3”的NEEC培养对照，即实施例8和图5A-5B的“对照”。
图6A-6B中的箭头突出Ngn3和Hes1表达显然同步，表明细胞的亚群在它
们产生内分泌先祖中具有略微不同的时间进程。
[实施例10]
<VEC的分离和培养>
将实施例2中从胰脏丢弃物的培养物去除的漂浮的组织碎片接种于在
用1.8mg/ml鼠尾胶原I包被的24孔板中的已在65.5°C下热灭活60-70min.
的包含100微克/ml ECGS和20%(v/v)FCS的RPMI1640中。将培养18
小时后的非粘附组织碎片去除，用PBS短暂地洗涤，然后补充包含0.1%(v/v)
两性霉素(Sigma-Aldrich Co.)的新鲜培养基并培养7-10天。然后通过
Accutase处理去除细胞，并且通过抗体缀合的磁性微珠(Miltenyi Biotec,Inc.)
和抗CD31抗体(Pharmingen,Co.)纯化悬浮的细胞。将细胞洗脱液用相同的
培养基在胶原I包被的T25瓶中(Corning,Inc.)培养，其中细胞如上所述去
除。因此获得的细胞(VEC)悬浮液的图像如图7-1A所示。
[实施例11]
<形成组织复合物>
通过Accutase处理将实施例7的富集和分化后的NEEC以及实施例10
的培养后的VEC从各自容器表面去除，并且分别以细胞数量比例：95/5、
90/10、80/20和70/30混合在一起。图7-1B至7-1D和7-2示出当比例为80/20
时的结果，鉴于增加了组织复合物的功能并鉴于不那么降低NEEC的比例，
看来这是最佳的。将按比例的细胞混合物悬浮液接种在具有组织生成培养
基的超低粘附6-孔板(Costar 3471,Corning,Inc.)上(图7-1B)。培养基包含
DMEM/Ham's F-12、20mM D-葡萄糖、2%(v/v)FCS、2ng/ml激活蛋白A、
5ng/mlβ细胞素、20ng/ml HGF、20ng/ml胃泌素、20ng/ml IGF-1、5ng/ml
KGF、20ng/ml BMP7、20ng/ml VEGF、20ng/ml毒蜥外泌肽-4、10mM
烟酰胺、0.1mM抗坏血酸以及1mM CaCl2。使细胞混合物悬浮液在37°C
和5%CO2下进行约20转/min的缓慢旋转运动18-24小时，直至产生IPT
的球形簇(图7-1C)。用与上文相同的办法使得IPT成熟，不过培养容器水
平放置不动并且培养基没有CaCl2。在约20天的整个成熟期中每1-2天补
充培养基(图7-1D)。如从图7-1的图“C”和“D”看到的，在IPT的成熟
过程中，出芽较小的组织部分，而一些IPT融合形成较大的组织团。为了
比较，使实施例7的富集和分化后未与VEC混合的NEEC进行上文所述的
培养。测量从单独的NEEC或者NEEC与VEC的组织复合物产生的具有
100-200微米直径的IPT的数量，并且如图7-2所示(非配对t-检验，n=3组
孵育的细胞，p<0.0001)。如从图7-2看到的，来自组织复合物的IPT数量
比来自单独的NEEC的IPT数量多3倍。
[实施例12]
<IPT的表征>
对实施例11的成熟期后的IPT计数并测量它们的直径，从而计算IEQ
以评价组织生成。1IEQ当量等于一个约200微米直径的球形组织(IPT)。
这种计算基于IPT的体积，其转化为代表获得的IPT数量的IEQ(图7-2)。
还通过标准免疫组织化学方法针对胰岛素阳性细胞的相对比例来评价组
织。将IPT用磷酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛在4°C下固定18小时。将固
定的IPT在PBS中于4°C下洗涤18小时，包埋在2%琼脂糖中，在醇系列
中脱水，在二甲苯中透明并包埋在石蜡中。将4微米石蜡切片在玻璃载玻
片上脱蜡，在醇系列和PBS中复水。将IPT切片用封闭液在RT下封闭1
小时，用抗胰岛素抗体(Millipore International,Inc.,Linco 4011-01F)(1:400)
在RT下处理1小时，用封闭液洗涤并用Cy3缀合的二抗(抗豚鼠IgG)(1:800)
处理。将核用DAPI染色，将载玻片用VectraShield(Vector Laboratories)封
固并在荧光显微镜下观察(图8-1)。为此，将IPT的4微米石蜡切片用抗胰
岛素抗体和Cy3缀合的二抗染色。在图8-1中大小标尺代表30微米。相对
于表示所观察的给定视野中细胞总数量的DAPI染色的核数量来计算胰岛
素阳性细胞的百分比(图8-2)。如图8-2所示，从组织复合物产生的IPT包
含比单独NEEC的IPT更多的胰岛素阳性细胞(n=每组的5个代表性IPT，
非配对t-检验，p<0.001)。为了进一步比较从组织复合物产生的IPT和从单
独的NEEC产生的IPT，测量通过半定量PCR扩增的胰岛素mRNA表达。
图9A示出因此获得的图像，其上M代表DNA大小标记，并且还示出天
然胰岛的模式。图9B示出胰岛素1(Ins1)的相对表达强度(配对的t-检验：
Ins1，n=5个样品对，p<0.0001)；并且图9C示出胰岛素2(Ins2)的相对表达
强度(配对的t-检验：Ins2，n=4个样品对，p<0.0001)。如从图9B和C看到
的，对于胰岛素1(Ins1)和胰岛素2(Ins2)，从NEEC和VEC的组织复合物
产生的IPT均表现出比从单独的NEEC产生的IPT更大的相对表达强度。
[实施例13]
<胰岛素分泌功能的评价>
通过葡萄糖刺激方法评价胰岛素分泌功能。将约20IEQ的成熟20天
后的IPT(通过实施例11获得)用200微升补充了0.1%BSA、10mM Hepes、
PenStrep(50/50)和5mM D-葡萄糖的KREBS林格氏液(低葡萄糖溶液)在U
形底96-孔板(Nalgene Nunc International K.K.)的孔中于37°C和5%CO2下
预孵育1小时。葡萄糖刺激之前，也预孵育天然的20IEQ的天然胰岛
(BALB/c小鼠)，但是预孵育过夜(18小时)，以便使它们适应实验条件。小
心地去除KREBS林格氏液，洗涤2-3次，装入相同量的新鲜溶液，并且在
37°C和5%CO2下孵育2小时。孵育之后，从孔收集150微升的低葡萄糖
溶液并储存在-30°C下用于后来的分析，将IPT洗涤2-3次，装入相同量但
具有20mM的D-葡萄糖的新鲜林格氏液(高葡萄糖溶液)，并且在37°C和
5%CO2下孵育2小时，然后从孔收集150微升的高葡萄糖溶液以储存在
-30°C下用于后来的分析。将收集的KREBS林格氏液解冻，短暂离心以从
每个样品采集50微升，并且根据制造商的说明书通过ELISA(Shibayagi,Co.)
进行C-肽测定(图10A)或者通过ELISA(Mercodia AB,Uppsala,Sweden)进
行胰岛素测定(图10B)。然后使组织进行如实施例9中的RT-PCR以测试Ins1
和Ins2，由此常规评价天然胰岛的成熟和功能状态(图10A、10B)。如图10A
所示，当用增加的葡萄糖浓度激发时，从NEEC和VEC的组织复合物产生
的IPT在C-肽分泌中表现出较大的葡萄糖反应性(双向ANOVA：效果=单
独NEEC对NEEC+VEC，F=19.7，n=5组，p=0.0004；效果=低葡萄糖对高
葡萄糖浓度，F=5.7，n=5组，p=0.0295)。进一步地，如图10B所示，从
NEEC和VEC的组织复合物产生的IPT表现出天然胰岛(BALB/c小鼠)分泌
的胰岛素量的1/10-1/2，但是至少在所用的实验条件下，前者的葡萄糖反应
比后者的葡萄糖反应好(双向ANOVA：效果=IPT对天然胰岛，F=11797.8，
n(IPT)=4组，n(天然胰岛)=3组，p<0.0001；效果=低葡萄糖对高葡萄糖浓
度，F=1223.2，p<0.0001)。
[实施例14]
<在单层VEC上培养胰岛细胞>
如实施例1所述从C57Bl/6小鼠分离天然胰岛，通过与Accutase在RT
下孵育10min来分离胰岛细胞。将这些细胞接种入用0.2mg/ml的低生长
因子基质胶(BD Biosciences)包被的载玻片室或者实施例10获得的VEC已
培养形成单层的载玻片室。将胰岛细胞在具有10%FCS和PenStrep(50/50)
的RPMI1640中培养2天(图11-1)，并且用10微摩尔Brdu脉冲处理培养的
最后30min。对于免疫细胞化学，将它们在70%乙醇中于RT下固定30min，
然后进行如实施例7中的胰岛素染色方法。用PBS洗涤后，将细胞用稀释
倍数分别为1:200和1:400的抗Brdu一抗(克隆：IIB5,Santa Cruz
Biotechnology，Inc.)和二抗(山羊抗小鼠IgG-FITC，Santa Cruz Biotechnology，
Inc.)染色。如实施例7观察荧光图像(图11-2)。图11-2示出接种在腔式载
玻片上的VEC单层上的胰岛细胞(A、B和C)以及接种在腔式载玻片的包被
表面上的胰岛细胞(D、E和F)的一系列免疫细胞化学图像。对于图11-2，
A和D：DAPI；B和E：抗胰岛素-Cy3；C和F：抗Brdu-FITC。图11-3
示出表明在VEC上生长的胰岛细胞的溴脱氧尿苷阳性细胞(%Brdu+细胞)
显著高于在基质胶上生长的胰岛细胞的溴脱氧尿苷阳性细胞(%Brdu+细胞)
的图(非配对学生t-检验：t=6.57，n=8/组，p<0.0001)。
[实施例15]
<IPT的体内功能评价>
将相同性别和品系的9-14周龄的小鼠用作受体，向其移植实施例11
的成熟后的IPT。通过腹腔内注射链佐星(110-150mg/kg体重)使禁食过夜
的小鼠形成糖尿病，并且在注射后的第4天测量血液葡萄糖水平，随后每
2-5天测量一次。认为在连续2天具有400mg/dl以上的血液葡萄糖水平的
小鼠为糖尿病。将麻醉中的小鼠的腹外侧腹膜手术打开并将700-1000IEQ
的IPT移植在肾被膜下。将另一肾保持完整。将小鼠从麻醉释放之前通过
双重闭合技术来闭合切口。然后将手术的小鼠通过Accu-ChekActive(Roche
Diagnostics,Inc.)测量体重和血液葡萄糖水平50天(图12A)。图12A示出对
糖尿病小鼠测量的血液葡萄糖水平的变化，所述糖尿病小鼠在肾被膜下移
植入从相同品系的供体小鼠的胰组织产生的700IEQ的IPT。第“0”天表
示移植的当天。认为在400mg/dl以上和200mg/dl以下的血液葡萄糖水平
分别为高血糖(糖尿病)和正常血糖(非糖尿病并正常)。接受移植的小鼠在最
初2周表现出降低的血液葡萄糖水平。当通过如实施例12中进行的相同方
式的免疫组织化学分析具有IPT移植物的肾的胰岛素+细胞时，胰岛素+细
胞在肾被膜下清楚可见(图12B)。