甘松中提取的新化合物及其制备方法和用途.pdf

本发明公开了甘松中提取的新化合物及其制备方法和用途，包括结构式为a和b的化合物，是从甘松的干燥根及根茎中提取纯化得到，结构式为a和b的化合物可以治疗心肌细胞损伤、抑制心肌细胞钙升高，结构式为b的化合物可以缩短心肌细胞动作电位。

权利要求书
1.  甘松中提取的新化合物，其特征在于:包括其结构式为a和b所示的化合物，
    。

2.  一种制备权利要求1中新化合物的方法，其特征在于步骤如下：
A、取甘松的干燥根及根茎，粗粉碎后用60-70％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，减压浓缩，得到总提取物；
B、将总提取物进行大孔吸附树脂柱层析分离，分别以水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇进行梯度洗脱，70%乙醇洗脱部位经硅胶柱Ⅰ色谱分离，采用氯仿-甲醇系统梯度洗脱，得到馏分Fr.1- Fr.12；
C、Fr.3再经硅胶柱Ⅱ色谱分离，采用石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，得到9个馏分Fr.3.1- Fr.3.9；
D、Fr.3.8经开放ODS柱色谱，60%甲醇洗脱，得到馏分Fr.3.8.1- Fr.3.8.4；
E、Fr.3.8.2经高效制备液相分离，得到结构式为a的化合物；
F、Fr.3.8.4 用凝胶Sephadex LH-20柱层析，氯仿-甲醇洗脱，得到结构式为b的化合物。

3.  根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤B中硅胶柱Ⅰ的规格为10×48 cm。

4.  根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤C中硅胶柱Ⅱ的规格为8×44cm。

5.  根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤D中开放ODS柱的规格为4.5×27cm。

6.  根据权利要求2所述的制备新化合物的方法，其特征在于步骤如下：
A、取甘松的干燥根及根茎，粗粉碎后用60-70％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，减压浓缩至浸膏状，得到总提取物；
B、将总提取物进行大孔吸附树脂HP-20柱层析分离，Φ14×120 cm，保留体积12L，洗脱流速80-100mL/min，分别以水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇进行梯度洗脱，70%乙醇洗脱部位经硅胶柱Ⅰ色谱分离，硅胶柱Ⅰ的规格为10×48 cm，200-300目硅胶，采用氯仿-甲醇系统梯度洗脱为100:0，99:1,95:5,9:1,8:2,0:100，保留体积为3.75L，每个梯度洗脱四个保留体积，每1L收集一次，以薄层板监控，得到馏分Fr.1-Fr.12；
C、Fr.3再经硅胶柱Ⅱ色谱分离，硅胶柱Ⅱ的规格为：8×44cm，200-300目硅胶，采用石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱过程为100:0,200:1,100:1,100:2,100:3,100:5,100:7,100:10,100:15,100:20,0:100，保留体积为2.0L，每个梯度洗脱五个保留体积，每0.5L收集一次，以薄层板监控，得到9个馏分Fr.3.1- Fr.3.9；
D、Fr.3.8经开放ODS柱色谱，ODS柱的规格为4.5×27cm，60%甲醇洗脱，保留体积为200mL，每个梯度洗脱四个保留体积，每50mL收集一次，得到馏分Fr.3.8.1-Fr.3.8.4；
E、Fr.3.8.2，经高效制备液相分离，制备柱：cosmosil,5C18-MS-Ⅱ;25°; ν= 8ml/min;45% MeOH-H2O; tR = 45 min，得到结构式为a的化合物；
F、Fr.3.8.4 用凝胶Sephadex LH-20柱层析，体积比为7:3的氯仿-甲醇洗脱，得到结构式为b的化合物。

7.  权利要求1中新化合物的用途，其特征在于：结构式为a或b的化合物在制备治疗心肌细胞损伤的药物中的应用。

8.  权利要求1中新化合物的用途，其特征在于：结构式为a或b的化合物在制备抑制心肌细胞钙升高的药物中的应用。

9.  权利要求1中新化合物的用途，其特征在于：结构式为b的化合物在制备缩短心肌细胞动作电位的药物中的应用。

说明书甘松中提取的新化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于有机化合物领域，具体涉及新化合物及其制备方法和用途。
背景技术
甘松为败酱科植物甘松和宽叶甘松根及根茎。甘松为多年生草本，生于海拔3500至4500米的高山草原地带，分布于甘肃、青海、四川、云南西北部；宽叶甘松生于3000米以上的高山草原或疏林中，分布于四川、云南、西藏等地。秋末冬初茎叶将枯萎时挖根，抖净泥沙，不可水洗，除去残茎及须根，阴干或晒干。甘松根茎略呈圆锥形，多弯曲，长5～18cm。根茎短小，上端有茎、叶残基，呈狭长的膜质片状或纤维状；外层黑棕色，内层棕色或黄色；根单一或数条交结、分枝或并列，直径0.3～1cm。表面棕褐色，皱缩，有细根及须根；质松脆，易折断，断面粗糙，皮部深棕色，常成裂片状，木部黄白色；气特异，味苦而辛，有清凉感。
甘松的化学成分有很多，对于甘松的化学成分研究的比较少。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是发现从甘松中提取的新化合物以及该新化合物的制备方法和用途。
本发明所采用的技术方案是：
甘松中提取的新化合物，包括结构式为a和b所示的化合物
                                                    
一种制备权利要求1中新化合物的方法，步骤如下：
A、取甘松的干燥根及根茎，粗粉碎后用60-70％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，减压浓缩至浸膏状，得到总提取物；
B、将总提取物进行大孔吸附树脂柱层析分离，分别以水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇进行梯度洗脱，70%乙醇洗脱部位经硅胶柱Ⅰ色谱分离，采用氯仿-甲醇系统梯度洗脱，得到馏分Fr.1- Fr.12；
C、Fr.3再经硅胶柱Ⅱ色谱分离，采用石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱，得到9个馏分Fr.3.1- Fr.3.9；
D、Fr.3.8经开放ODS柱色谱，60%甲醇洗脱，得到馏分Fr.3.8.1- Fr.3.8.4；
E、Fr.3.8.2经高效制备液相分离，得到结构式为a的化合物；
F、Fr.3.8.4 用凝胶Sephadex LH-20柱层析，氯仿-甲醇洗脱，得到结构式为b的化合物。
所述步骤B中硅胶柱Ⅰ的规格为10×48 cm。
所述步骤C中硅胶柱Ⅱ的规格为8×44cm。
所述步骤D中开放ODS柱的规格为4.5×27cm。
结构式为a和b的化合物的具体制备方法如下：
A、取甘松的干燥根及根茎，粗粉碎后用60-70％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，减压浓缩至浸膏状，得到总提取物；
B、将总提取物进行大孔吸附树脂HP-20柱层析分离，Φ14×120 cm，保留体积12L，洗脱流速80-100mL/min，分别以水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇进行梯度洗脱，70%乙醇洗脱部位经硅胶柱Ⅰ色谱分离，硅胶柱Ⅰ的规格为10×48 cm，200-300目硅胶，采用氯仿-甲醇系统梯度洗脱为100:0，99:1,95:5,9:1,8:2,0:100，保留体积为3.75L，每个梯度洗脱四个保留体积，每1L收集一次，以薄层板监控，得到馏分Fr.1-Fr.12；
C、Fr.3再经硅胶柱Ⅱ色谱分离，硅胶柱Ⅱ的规格为：8×44cm，200-300目硅胶，采用石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱过程为100:0,200:1,100:1；100:2，100:3,100:5,100:7,100:10,100:15,100:20,0:100，保留体积为2.0L，每个梯度洗脱五个保留体积，每0.5L收集一次，以薄层板监控，得到9个馏分Fr.3.1- Fr.3.9；
D、Fr.3.8经开放ODS柱色谱，ODS柱的规格为4.5×27cm，60%甲醇洗脱，保留体积为200mL，每个梯度洗脱四个保留体积，每50mL收集一次，得到馏分Fr.3.8.1-Fr.3.8.4；
E、Fr.3.8.2，经高效制备液相分离，制备柱：cosmosil,5C18-MS-Ⅱ;25°; ν= 8ml/min;45% MeOH-H2O; tR = 45 min，得到结构式为a的化合物；
F、Fr.3.8.4 用凝胶Sephadex LH-20柱层析，体积比为7:3的氯仿-甲醇洗脱洗脱，得到结构式为b的化合物。
结构式为a或b的化合物在制备治疗心肌细胞损伤的药物中的应用。
结构式为a或b的化合物在制备治疗心肌细胞钙升高的药物中的应用。
结构式为b的化合物在制备缩短心肌细胞动作电位的药物中的应用。
由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：
本发明从甘松中提取了两种具有生物活性的新化合物，解决了甘松中化学成分复杂，质量难以控制的问题，提取的新化合物，药理作用机制更确切；药理实验也表明新结构式为a和b的化合物在保护心肌细胞损伤和抑制心肌细胞钙升高都有好的疗效，结构式为b的化合物还可以缩短心肌细胞动作电位。
为了验证结构式为a和b的化合物的作用，做了以下实验：
实验例一、氧化应激损伤的保护作用
1)    实验方法
心肌细胞的分离及培养 器械：烧杯1个、解剖剪2个、小镊子2个、玻璃平皿2个、滤网、离心管（15ml）3个、移液管、培养瓶、废液缸、六孔板、橡胶手套、吸管3个， 溶液：PBS缓冲液、DMEM（含10％血清）、DMEM（不含血清）、0.25%胰酶。 动物：新生1－3天的SD乳鼠。 准备：用75％酒精棉球擦拭超净台面后把物品摆放好，将培养液、胰酶37℃水温浴。 培养过程： 1. 两个玻璃皿中分别加入5ml的PBS缓冲液和无血清的DMEM。2．将乳鼠浸入70％酒精1－2min，用小剪子及小镊子开胸取心脏。 3. 取出的心脏放在一个装有PBS的平皿中，剔除心脏周边的血凝及 纤维组织，放入另一个装有不含血清的DMEM平皿中清洗。 4. 用剪子将平皿中的心脏剪成1mm3（一般为四小块），将组织块移入15ml离心管中，加入2-3ml胰酶（胰酶的量约是组织的一半）。 5. 将离心管放入37℃水浴锅中，温和摇动，10min，自然沉淀，小心吸取上清，上清中主要是血红细胞、细胞碎屑和死细胞。 6. 再将2-3ml胰酶加入盛有组织的离心管，37℃水浴消化10min，小心转移上清液+等量的（约2ml）DMEM（含10％血清）至另一离心管中，封口后放入4℃冰箱待用。 7. 重复第6步，3-7次不等，直至组织块消化完全为止。 8. 将多次收集的上清液经滤网过滤，过滤后离心，2500转2分15秒，而后去上清，用培养基将沉淀的细胞重悬，转入培养瓶置于含5%CO2的孵箱中。 9. 在孵箱中培养1-1.5小时，进行差速贴壁。既是成纤维细胞贴壁，将培养瓶倒置后，不断的吹打，使细胞分散开。根据细胞密度铺96孔板。 10. 72小时后换无血清培养液。 
测定过程：
1. 第四日晚，将实施例1中制备的结构式为a和b的化合物分别用无血清培养液配置浓度梯度为：10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3加入96孔板中，每孔200ul，每个浓度3个复孔，每板剩余为空白。
2. 药物作用12小时后，加入过氧化氢诱导凋亡，过氧化氢浓度为100umol(7小时)/200umol(2小时)，每孔加入20ulMTT（5mg/ml）染色，4小时后吸除液体，加200ulDMSO溶解沉淀，振荡10min，上机监测490nm处吸光度A值。
分析：将吸光度A值存于Excel表格，计算每个单体化合物吸光度A值的平均值标准差
    计算方法:细胞活力%=实验组A值/对照组A值*100%  
将数据作图，见图1和图2。 结合图1和图2中可以看出，结构式为a和b的化合物对H2O2诱导的心肌细胞损伤具有保护作用，并伴有浓度依赖性。 
实验例二、激光扫描共聚焦实验测化合物对细胞内钙的作用
1)    急性分离心肌细胞（大鼠）
装置类型：langendorff恒流装置
试剂与仪器
仪器：langendorff装置、恒流泵、水浴锅、500ml量筒1个、50ml量筒1个、5ml量筒1个、1000ml烧杯2个、500ml烧杯2个、100ml烧杯1个、50ml烧杯5个、吸管2个、大平皿2个、10ml注射器1个、10ml离心管4个、秒表1个、大鼠系线2根、冰袋1个、手术器械（大剪刀及止血钳各一个、小剪刀1个及平镊2个）
试剂：台式母液、葡萄糖、0.9mol/LCaCl2母液、KB液、Ⅱ型酶、BSA、肝素、戊巴比妥钠（3%）、
实验步骤：
1、将所用的量筒、烧杯、平皿及注射器用去离子水清洗干净备用，同时用去离子水清洗恒流装置。
2、配备500ml无钙液：50ml台式母液+450ml去离子水+1g葡萄糖，通氧20min以上待用；
配备酶液：Ⅱ型酶10mg+12.5mgBSA放入50ml小烧杯中避光保存待用；
配备肝素钠注射液：4mg/ml，取8mg肝素钠溶于2ml生理盐水中待用；
在零下30℃冰箱中取50mlKB液（一瓶）于37℃水浴锅中融化并通氧20min以上并校正PH在7.35待用。
3、无钙液通氧后校正PH在7.35，将①无钙液倒入平皿中溢满，②10ml注射器中注满6ml左右即可，③倒入配好的酶液烧杯里50ml，开始通氧。
4、将无钙液泵入装置，让装置充满液体并保证排除气泡；此时调节恒流泵示数，用10ml量筒确定恒流泵的流速为8ml/min，示数一般为50-65之间。
5、将称好体重的大鼠麻醉（0.13ml/100g），麻醉后给予0.5ml尾静脉肝素化（防止淤血），3-5min左右即可开始取心脏（也可腹腔注射肝素化，需等待5-10min方可取心脏）。
6、取心脏放入冰冷的无钙液中，修理主动脉边缘至平整，并将针管插入主动脉中，用线系紧，注意：针管不能深也不能浅，心脏挂上后能横过来就可以，系线时不要系到组织。提前将恒流泵开启流动，迅速将系好的心脏挂在装置下端，开始计时，并观察心脏的消化变化。
首先将无钙液灌流5min（切记在2:45时将恒流泵停止转换为酶液再开始，此过程需迅速完成），5min时换烧杯回收酶液，酶液消化时间一般为15-22min，待心肌组织变软，心脏膨大充盈颜色变浅时停止消化；将心脏剪下置于KB液中，将松软心脏的左、右心室及室间隔分离并将各部位剪成小块，在离心管中反复轻轻吹打，最后将剩余组织弃掉；置于显微镜下观察。
7、细胞的耐钙实验：将0.2ml 0.9mol/L CaCl2 溶于100ml无钙液中形成有钙液，将备用的细胞加入有钙液中复钙5min以上。（也可进行梯度复钙：分别配置1/8，1/4，1/2，1倍有钙液，然后依次分别向管中缓慢倒入1/8，1/4，1/2，1倍有钙液，孵育间隔时间为6min。）
8、染色实验（需要避光操作）
 最后一次孵育结束将上清液吸走，然后将细胞粘液加到1ml的染色液中，加2—4滴（具体情况按细胞多少来滴加）。37℃染色30—40min；离心去除上清染色液回收利用，然后加入1ml有钙液清洗后离心去上清，再加入1ml的有钙液备用进行激光共聚焦实验。离心条件：1000r/min，每次1min。
2)    共聚焦实验（需要避光操作）
1 、按要求和步骤打开仪器各项开关，打开软件。取50μl细胞悬液和150μl有钙液加入浴槽中。
2、调物镜，把光路调到3、旋钮调下，观察细胞状态（选细胞），再开自然光重新观察细胞状态。细胞选好后，将光路调到1、旋钮调到照相档，点XY、XYrepeat,调焦距（细调），选状态好的细胞，点XYT、XYTrepeat扫描（fast ，slow）。
3、 扫了3张后，点stop scan，打开自然光，向浴槽中加入5ul稀释5倍的实施例2制备的结构式为a和b的化合物，然后点resume继续扫描，重复三次，这样浴槽中药物浓度有个累计升高的过程，然后向浴槽中加入5μl的KCl，重复以上操作。注：每次扫描间隔为5s，共扫60张片子。最后会得到荧光变化的曲线，由此来反映[Ca2+]的浓度。代表[Ca2+]的浓度由低到高的颜色分别为绿—蓝—粉—红—白。看我们加入的药物是否能够直接使细胞内的钙有变化，以及是否能够抑制KCl引起的内钙升高。
3)    数据统计：扫描所得一系列荧光图像由计算机收集并贮存分析处理,可得到细胞内Ca2+变化的时间效应(相对荧光强度值)曲线，将曲线数据输出为excel表格数据，刻盘保存。
    统计方法：F0：control组平均强度值；F1：加药10ul后平均强度值；Fkcl：加60mmol/L的KCL后最大平均强度值。
    将各组数据F1/F0及Fkcl/F0做比值，计算平均值标准差，系统分析，作图3。从结果中，可以得出结构式为a和b的化合物均有抑制KCL使内钙增高的作用，效果显著。
实验例三、化合物对动作电位的影响（Patch clamp）
1)    实验方法：
 急性分离心肌细胞：装置类型：langendorff恒流装置
试剂与仪器
仪器：langendorff装置、恒流泵、水浴锅、500ml量筒1个、50ml量筒1个、5ml量筒1个、1000ml烧杯2个、500ml烧杯2个、100ml烧杯1个、50ml烧杯5个、吸管2个、大平皿2个、10ml注射器1个、10ml离心管4个、秒表1个、大鼠系线2根、冰袋1个、手术器械（大剪刀及止血钳各一个、小剪刀1个及平镊2个）
试剂：台式母液、葡萄糖、0.9mol/LCaCl2母液、KB液、Ⅱ型酶、BSA、肝素、戊巴比妥钠（3%）、
实验步骤：
1、将所用的量筒、烧杯、平皿及注射器用去离子水清洗干净备用，同时用去离子水清洗恒流装置。
2、配备500ml无钙液：50ml台式母液+450ml去离子水+1g葡萄糖，通氧20min以上待用；
配备酶液：Ⅱ型酶10mg+12.5mgBSA放入50ml小烧杯中避光保存待用；
配备肝素钠注射液：4mg/ml，取8mg肝素钠溶于2ml生理盐水中待用；
在零下30℃冰箱中取50mlKB液（一瓶）于37℃水浴锅中融化并通氧20min以上并校正PH在7.35待用；
3、无钙液通氧后校正PH在7.35，将①无钙液倒入平皿中溢满，②10ml注射器中注满6ml左右即可，③倒入配好的酶液烧杯里50ml，开始通氧。
4、将无钙液泵入装置，让装置充满液体并保证排除气泡；此时调节恒流泵示数，用10ml量筒确定恒流泵的流速为8ml/min，示数一般为50-65之间。
5、将称好体重的大鼠麻醉（0.13ml/100g），麻醉后给予0.5ml尾静脉肝素化（防止淤血），3-5min左右即可开始取心脏（也可腹腔注射肝素化，需等待5-10min方可取心脏）。
6、取心脏放入冰冷的无钙液中，修理主动脉边缘至平整，并将针管插入主动脉中，用线系紧，注意：针管不能深也不能浅，心脏挂上后能横过来就可以，系线时不要系到组织。提前将恒流泵开启流动，迅速将系好的心脏挂在装置下端，开始计时，并观察心脏的消化变化。
首先将无钙液灌流5min（切记在2:45时将恒流泵停止转换为酶液再开始，此过程需迅速完成），5min时换烧杯回收酶液，酶液消化时间一般为15-22min，待心肌组织变软，心脏膨大充盈颜色变浅时停止消化；将心脏剪下置于KB液中，将松软心脏的左、右心室及室间隔分离并将各部位剪成小块，在离心管中反复轻轻吹打，最后将剩余组织弃掉；置于显微镜下观察。
记录方法：将一滴制备好的细胞悬液滴于倒置显微镜上方的浴槽内，静止5一10分钟，待细胞贴壁后，选择静止、杆状、横纹清晰、折光性良好的单个心肌细胞进行封接实验。形成全细胞构型后，在电流钳模式下记录正常动作电位，钳制5分钟后，给予分别记录给药后0min、2min、5min的动作电位，设置浓度梯度为10-6、10-5、10-4mol/L. 
动作电位刺激程序:保持电压omV，给予+8omV去极化刺激脉冲持续2ms。
将记录的动作电位应用Clampfit输出，Origin6.0作图4。
2)    结果如下：
图4中，结构式为b的化合物具有明显的缩短动作电位时程的作用。结构式为a的化合物暂无作用。
附图说明
图1是实验例1结构式为a的化合物的效果图；
图2是实验例1结构式为b的化合物的效果图；
图3是实验例2的效果图；
图4是实验例3的效果图。
其中，1、control的曲线，2、浓度10-6mol/L的曲线，3、浓度10-5mol/L的曲线,4、浓度10-4mol/L的曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细说明：
实施例1
结构式为a和b的化合物的具体制备方法如下：
A、称取败酱科甘松属植物甘松的干燥根及根茎10kg，粗粉碎后用60％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，减压浓缩至浸膏状，得到总提取物；
B、将总提取物进行大孔吸附树脂HP-20柱层析分离，Φ14×120 cm，保留体积12L，洗脱流速80mL/min，分别以水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇进行梯度洗脱，70%乙醇洗脱部位经硅胶柱Ⅰ色谱分离，硅胶柱Ⅰ的规格为10×48 cm，200目硅胶，采用氯仿-甲醇系统梯度洗脱（100:0，99:1,95:5,9:1,8:2,0:100），保留体积为3.75L，每个梯度洗脱四个保留体积，每1L收集一次，以薄层板监控，得到馏分Fr.1（9.5 g），Fr.2(11.9 g)，Fr.3(53.4 g)，Fr.4(22.3 g)，Fr.5(24.8 g)，Fr.6(12.8 g)，Fr.7(12.3 g)，Fr.8(7.1 g)，Fr.9(2.7 g)，Fr.10(9.9 g)，Fr.11(10.1 g)，Fr.12(12.5 g)；
C、Fr.3再经硅胶柱Ⅱ色谱分离，硅胶柱Ⅱ的规格为：8×44cm，200目硅胶，采用石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱过程为100:0,200:1,100:1；100:2，100:3,100:5,100:7,100:10,100:15,100:20,0:100，保留体积为2.0L，每个梯度洗脱五个保留体积，每0.5L收集一次，以薄层板监控，得到9个馏分Fr.3.1- Fr.3.9；
D、Fr.3.8经开放ODS柱色谱，ODS柱的规格为4.5×27cm，60%甲醇洗脱，保留体积为200mL，每个梯度洗脱四个保留体积，每50mL收集一次，得到馏分Fr.3.8.1(40.5 mg)，Fr.3.8.2(410.6 mg)，Fr.3.8.3(876.1 mg)，Fr.3.8.4(919.3 mg)；
E、Fr.3.8.2，经高效制备液相分离，制备柱：cosmosil,5C18-MS-Ⅱ;25°; ν= 8ml/min;45% MeOH-H2O; tR = 45 min，得到结构式为a的化合物；
F、Fr.3.8.4 用凝胶Sephadex LH-20柱层析，体积比为7:3的氯仿-甲醇洗脱洗脱，得到结构式为b的化合物。
实施例2
结构式为a和b的化合物的具体制备方法如下：
A、称取败酱科甘松属植物甘松的干燥根及根茎10kg，粗粉碎后用70％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，减压浓缩至浸膏状，得到总提取物；
B、将总提取物进行大孔吸附树脂HP-20柱层析分离，Φ14×120 cm，保留体积12L，洗脱流速100mL/min，分别以水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇进行梯度洗脱，70%乙醇洗脱部位经硅胶柱Ⅰ色谱分离，硅胶柱Ⅰ的规格为10×48 cm，300目硅胶，采用氯仿-甲醇系统梯度洗脱（100:0，99:1,95:5,9:1,8:2,0:100），保留体积为3.75L，每个梯度洗脱四个保留体积，每1L收集一次，以薄层板监控，得到馏分Fr.1（9.5 g），Fr.2(11.9 g)，Fr.3(53.4 g)，Fr.4(22.3 g)，Fr.5(24.8 g)，Fr.6(12.8 g)，Fr.7(12.3 g)，Fr.8(7.1 g)，Fr.9(2.7 g)，Fr.10(9.9 g)，Fr.11(10.1 g)，Fr.12(12.5 g)；
C、Fr.3再经硅胶柱Ⅱ色谱分离，硅胶柱Ⅱ的规格为：8×44cm，300目硅胶，采用石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱过程为100:0,200:1,100:1；100:2，100:3,100:5,100:7,100:10,100:15,100:20,0:100，保留体积为2.0L，每个梯度洗脱五个保留体积，每0.5L收集一次，以薄层板监控，得到9个馏分Fr.3.1- Fr.3.9；
D、Fr.3.8经开放ODS柱色谱，ODS柱的规格为4.5×27cm，60%甲醇洗脱，保留体积为200mL，每个梯度洗脱四个保留体积，每50mL收集一次，得到馏分Fr.3.8.1(40.5 mg)，Fr.3.8.2(410.6 mg)，Fr.3.8.3(876.1 mg)，Fr.3.8.4(919.3 mg)；
E、Fr.3.8.2，经高效制备液相分离，制备柱：cosmosil,5C18-MS-Ⅱ;25°; ν= 8ml/min;45% MeOH-H2O; tR = 45 min，得到结构式为a的化合物；
F、Fr.3.8.4 用凝胶Sephadex LH-20柱层析，体积比为7:3的氯仿-甲醇洗脱洗脱，得到结构式为b的化合物。
实施例3
结构式为a和b的化合物的具体制备方法如下：
A、称取败酱科甘松属植物甘松的干燥根及根茎10kg，粗粉碎后用70％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，减压浓缩至浸膏状，得到总提取物；
B、将总提取物进行大孔吸附树脂HP-20柱层析分离，Φ12×100 cm，保留体积10L，洗脱流速100mL/min，分别以水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇进行梯度洗脱，70%乙醇洗脱部位经硅胶柱Ⅰ色谱分离，硅胶柱Ⅰ的规格为12×60 cm，300目硅胶，采用氯仿-甲醇系统梯度洗脱（100:0，99:1,95:5,9:1,8:2,0:100），保留体积为4L，每个梯度洗脱四个保留体积，每1L收集一次，以薄层板监控，得到馏分Fr.1（9.5 g），Fr.2(11.9 g)，Fr.3(53.4 g)，Fr.4(22.3 g)，Fr.5(24.8 g)，Fr.6(12.8 g)，Fr.7(12.3 g)，Fr.8(7.1 g)，Fr.9(2.7 g)，Fr.10(9.9 g)，Fr.11(10.1 g)，Fr.12(12.5 g)；
C、Fr.3再经硅胶柱Ⅱ色谱分离，硅胶柱Ⅱ的规格为：9×50cm，300目硅胶，采用石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱过程为100:0,200:1,100:1；100:2，100:3,100:5,100:7,100:10,100:15,100:20,0:100，保留体积为2.0L，每个梯度洗脱五个保留体积，每0.5L收集一次，以薄层板监控，得到9个馏分Fr.3.1- Fr.3.9；
D、Fr.3.8经开放ODS柱色谱，ODS柱的规格为6×30cm，60%甲醇洗脱，保留体积为250mL，每个梯度洗脱四个保留体积，每50mL收集一次，得到馏分Fr.3.8.1(40.5 mg)，Fr.3.8.2(410.6 mg)，Fr.3.8.3(876.1 mg)，Fr.3.8.4(919.3 mg)；
E、Fr.3.8.2，经高效制备液相分离，制备柱：cosmosil,5C18-MS-Ⅱ;25°; ν= 8ml/min;45% MeOH-H2O; tR = 45 min，得到结构式为a的化合物；
F、Fr.3.8.4 用凝胶Sephadex LH-20柱层析，体积比为7:3的氯仿-甲醇洗脱洗脱，得到结构式为b的化合物。
实施例4
结构式为a和b的化合物的具体制备方法如下：
A、称取败酱科甘松属植物甘松的干燥根及根茎10kg，粗粉碎后用70％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，减压浓缩至浸膏状，得到总提取物；
B、将总提取物进行大孔吸附树脂HP-20柱层析分离，Φ15×130 cm，保留体积14L，洗脱流速100mL/min，分别以水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇进行梯度洗脱，70%乙醇洗脱部位经硅胶柱Ⅰ色谱分离，硅胶柱Ⅰ的规格为9×50 cm，300目硅胶，采用氯仿-甲醇系统梯度洗脱（100:0，99:1,95:5,9:1,8:2,0:100），保留体积为3.75L，每个梯度洗脱四个保留体积，每1L收集一次，以薄层板监控，得到馏分Fr.1（9.5 g），Fr.2(11.9 g)，Fr.3(53.4 g)，Fr.4(22.3 g)，Fr.5(24.8 g)，Fr.6(12.8 g)，Fr.7(12.3 g)，Fr.8(7.1 g)，Fr.9(2.7 g)，Fr.10(9.9 g)，Fr.11(10.1 g)，Fr.12(12.5 g)；
C、Fr.3再经硅胶柱Ⅱ色谱分离，硅胶柱Ⅱ的规格为：10×60cm，300目硅胶，采用石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱过程为100:0,200:1,100:1；100:2，100:3,100:5,100:7,100:10,100:15,100:20,0:100，保留体积为3.0L，每个梯度洗脱五个保留体积，每0.5L收集一次，以薄层板监控，得到9个馏分Fr.3.1- Fr.3.9；
D、Fr.3.8经开放ODS柱色谱，ODS柱的规格为6×35cm，60%甲醇洗脱，保留体积为300mL，每个梯度洗脱四个保留体积，每50mL收集一次，得到馏分Fr.3.8.1(40.5 mg)，Fr.3.8.2(410.6 mg)，Fr.3.8.3(876.1 mg)，Fr.3.8.4(919.3 mg)；
E、Fr.3.8.2，经高效制备液相分离，制备柱：cosmosil,5C18-MS-Ⅱ;25°; ν= 8ml/min;45% MeOH-H2O; tR = 45 min，得到结构式为a的化合物；
F、Fr.3.8.4 用凝胶Sephadex LH-20柱层析，体积比为7:3的氯仿-甲醇洗脱洗脱，得到结构式为b的化合物。
结构式为a和b的化合物的分别为
       
其中结构式为a的化合物为黄色晶体，[α] -19.6 (c 0.50, CH3OH)，UV (CH3OH) λmax (log ε) 254.2 (3.66) nm; IR (KBr) λmax 1704, 1671, 1454, 1370, 1214, 1033, 869 cm-1; HR-ESI-MS给出m/z 219.1377 [M+H]+ (calcd for C14H19O2, 219.1385)，确定其分子式为C14H19O2，计算不饱和度为6。 
1H-NMR (300 MHz, in CDCl3)图谱中共显示18个氢信号，其中包括一组烯氢信号δH 6.16 (1H, s, H-1)，高场区有4个甲基氢信号δH 1.09 (3H, s)，1.18 (3H, s)，1.13  (3H, s)，1.07 (3H, d, J = 6.5 Hz)，此外，还存在质子信号δH 2.30 (1H, m)，2.28 (1H, m)，2.34 (1H, m)，1.79 (1H, d, J = 5.5 Hz)，1.94 (1H, d, J = 5.5 Hz)。
13C NMR (75 MHz, in CDCl3)共显示14个碳信号，结合DEPT135图谱可知，其中包括2个羰基碳信号 (δC 201.6，200.0)，2个sp2杂化碳信号 (δC 165.1，123.4)，2个sp3杂化季碳信号 (δC 44.2，32.2)，3个次甲基碳信号 (δC 42.3，40.2，35.4)，1个亚甲基碳信号 (δC 42.1)，4个甲基碳信号 (δC 28.7，20.8，17.7，15.8)。
1H-1H COSY谱中，δH 2.34 (H-4)与δH 2.30 (H-3)，1.07 (H3-14)的相关信号，得到片段（Ⅰ）CH3-CH-CH2-；δH 1.79 (H-6)与1.94 (H-7)的相关，得到片段（Ⅱ）-CH-CH-。
在HMBC谱中，δH 1.09 (H3-11)，1.18 (H3-12)与δC 42.3 (C-6)/40.2 (C-7)/ 32.2  (C-10)相关，提示片段（Ⅱ）可延伸为一个二甲基环丙烷片段；δH 1.13 (H3-14) 与δC 35.4 (C-4)/44.2 (C-5)/42.3 (C-6)/165.1 (C-9)的相关，可将片段（Ⅰ）与二甲基环丙烷片段、双键通过δC 44.2 (C-5)相连；δH 1.79 (H-6)，1.94 (H-7)与δC 201.6有HMBC相关，可以确定δC 201.6位于8位；δH 6.16 (H-1)和δC 42.1 (C-3)相关、δH 2.34  (H-4) 和δC 200.0 (C-2)相关可以确定δC 200.0位于2位；δH 6.16 (H-1)和δC 201.6相关，可以将C-8和C-9相连，由此确定了化合物的平面结构是一个马兜铃烷型的降倍半萜。
NOESY谱中，δH 1.79 (H-6)与δH 1.13 (H3-14)、1.07 (H3-15)、1.09 (H3-12)相关，δH 1.18 (H3-13)与δH 2.34 (H-4)相关，δH 1.09 (H-12)与δH 1.94 (H-6)相关，δH 1.13 (H3-14)与δH 2.38 (H-3α)相关，由此确定了H-6、H-7、H3-13、H3-14位于同一个平面，由此确定了化合物的相对构型。
化合物的绝对构型是通过X-单晶衍射确定的，测得绝对构型因子-0.03(19)，由此确定了化合物的绝对构型为4R, 5R, 6S, 7R。
结构式为b的化合物为无色晶体; [α] -395.4 (c 0.50, MeOH); UV (CH3OH) λmax (log ε) 285 (2.86) nm; IR (KBr) νmax 1715, 1644, 1455, 1375, 1273, 1070, 938, 882, 650 cm-1; HRESIMS m/z 259.1672 [M+Na]+ (calcd for C15H24O2Na, 259.1674)，确定其分子式为C15H20O，计算不饱和度为6。
1H NMR (400 MHz, in CDCl3)图谱中，低场区δH 6.02 (1H, m)，6.00 (1H, m)，5.57 (1H, br s)为三组双键烯氢质子信号；高场区δH 1.11 (3H, s)，1.08 (3H, s )，1.02 (3H, s)，1.00 (3H, d, J = 6.6 Hz)为四组甲基质子的氢信号。
   13C NMR (100 MHz, in CDCl3)图谱中共显示15个碳信号，结合DEPT135图谱可知，其中包括1个羰基碳信号(δC 196.9)，4个sp2杂化碳信号 (δC 160.2，137.3，128.2，123.3)，2个sp3杂化季碳信号 (δC 37.2，25.7)，3个次甲基碳信号 (δC 37.4，36.2，34,7)，1个亚甲基碳信号 (δC 32.7)，4个甲基碳信号 (δC 29.6，22.2，15.8，15.4)。
1H-1H COSY谱中，δH 6.02 (H-2)和δH 6.00 (H-1)、2.11 (H-3)相关，得到片段（Ⅰ）-CH=CH-CH2-；δH 1.90 (H-4)和1.00 (H3-15)相关，得到片段（Ⅱ）-CH-CH3；δH 1.26 (H-6)与δH 1.65 (H-7)相关，得到片段（Ⅲ）-CH-CH-。
HMBC谱中，δH 6.00 (H-1)与δC 123.3 (C-9)相关，δH 6.02 (H-2)与δC 160.2 (C-10)相关，δH 1.26 (H-6)与δC 22.2 (C-14)相关，δH 1.26 (H-6)、1.65 (H-7)与δC 196.9 (C-8)相关，δH 1.11 (H3-12)、1.08 (H3-13)与δC 37.4 (C-6)/36.2 (C-7)/25.7 (C-11)相关，δH  1.02 (H3-14)与δC 34.7 (C-4)/160.2 (C-10)相关，δH 1.00 (H3-15)与δC 32.7 (C-3)/34.7 (C-4)/37.2 (C-5)相关，由此建立了化合物的平面信息。
NOESY谱中，δH 1.00 (H3-15)与δH 2.11(H-3α)、1.96(H-3β)相关，证明H3-15位于e键上；此外还可看到δH 1.02 (H3-14)与δH 2.11(H-3α)相关，δH 1.11 (H3-12)与δH 1.65(H-7)相关，δH 1.08 (H3-13)与δH 1.90(H-4)相关；由于δH 1.26(H-6)与δH 1.02 (H3-14)、1.00 (H3-15)、1.11 (H3-12)模糊难辨别，故对δH 1.26(H-6)进行了1D selective NOE 实验加以确认，由此确认了化合物的相对构型及H3-14、H3-15和H-6、H-7位于同一个平面。