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1、(10)申请公布号 CN 103965349 A (43)申请公布日 2014.08.06 CN 103965349 A (21)申请号 201310413841.0 (22)申请日 2013.09.12 CGMCC No.7718 2013.06.18 C07K 14/77(2006.01) C12N 5/20(2006.01) A61K 39/00(2006.01) C07K 16/18(2006.01) C07K 16/02(2006.01) C12R 1/91(2006.01) (71)申请人 轻工业环境保护研究所 地址 100089 北京市海淀区西三环北路 27 号北科大厦六层 (7。
2、2)发明人 许丽 赵鲁 程言君 (54) 发明名称 一种多环芳烃完全抗原 , 多环芳烃单克隆抗 体和分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种抗多环芳烃完全抗原， 多 环芳烃单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞株 及其制备方法。本发明采用活性酯法将半抗原芘 丁酸与BSA偶联获得完全抗原PAB-BSA， 用完全抗 原 PAB-BSA 免疫小白鼠， 达到理想效价后进行细 胞融合， 筛选到特异性较高， 稳定性较好的单克隆 细胞株并进行保藏， 该细胞株可以持续分泌单克 隆抗体， 该单克隆抗体可用于多环芳烃 ELISA 检 测试剂盒的研制。 (83)生物保藏信息 (51)Int。
3、.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103965349 A CN 103965349 A 1/2 页 2 1.一种用于免疫实验动物的多环芳烃免疫原芘丁酸-牛血清白蛋白偶联物(PBA-BSA) 和包被原芘丁酸 - 卵清白蛋白偶联物 PBA-OVA 。 2. 权利要求 1 所述的免疫原和包被原的制备方法， 其特征在于， 所述方法包括如下步 骤 ： 1) 采 用 活 性 酯 法 将 芘 丁 酸 分 别 与 BSA 和 OVA 偶 联， 按 照 1 ： 1 ： 1 的 比 例 称。
4、 取 (PBA)、 N- 羟基琥珀酰亚胺 (N-Hydroxysuccinimide， NHS)、 N， N- 二环己基碳二亚胺 (Dicyclohexylcarbodiimide， DCC)、 溶解于 N， N- 二甲基甲酰胺 (N， N-Dimethylformamide、 DMF) 中， 室温放置过夜， 12000rpm， 离心 15min， 取上清液 ； 2)4搅拌， 将上清液缓慢加入 8ml BSA 溶液 ( 碳酸钠 - 碳酸氢钠缓冲液配制成浓度为 15mg/ml 的 BSA 溶液 ) 中继续搅拌 5h ； 3)将溶液装入透析袋中， 用蒸馏水透析2d后用pH7.40.01mor/L 。
5、PBS缓冲液继续透析， 每天更换透析液， 直到用紫外分光光度计检测不到 PBA 的特征吸收峰为止 ； 4) 离心分离出上清液即作为免疫原 PBA-BSA， 用同样的方法合成 PBA-OVA 结合物作为 ELISA 的包被原。 3. 一种分泌抗多环芳烃单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法， 该杂交瘤细胞株的保 藏号为 CGMCC No.7718。 4. 权利要求 3 所述的杂交瘤细胞株的制备方法， 其特征在于， 所述方法包括如下步骤 ： 1) 动物免疫 2) 取小鼠脾细胞与 SP2/0 细胞， 采用 PEG 法进行融合 3) 阳性细胞株筛选 4) 抗体纯化和鉴定， 杂交瘤细胞株的筛选与保藏。 5.。
6、 根据权利要求 4 所述的杂交瘤细胞株的制备方法， 其特征在于， 所描述的方法包括 如下步骤 ： 1) 动物免疫 免疫用小鼠为 18g 左右的 BALB/C， 7-8 周 ； 免疫之前眼眶取阴性血清。取 60g 免疫原 “PBA-BSA” ， 用生理盐水稀释到 200l， 再加入等体积弗氏完全佐剂进行皮下注射免疫。此 后， 每隔两周， 进行一次加强免疫， 免疫量为 30g 蛋白 / 只小鼠。共进行四次加强免疫后， 眼眶取血， 测定抗血清效价。选择效价较高的小鼠腹腔冲击免疫， 免疫量为 50g 蛋白 / 只 小鼠。效价达到 1 ： 10000 即可做细胞融合 ； 2) 细胞融合 取免疫小鼠的脾脏。
7、细胞与状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0， 采用PEG法进行融合。 融合后 的细胞用含 15血清的 IMDM 培养基培养 ； 3) 阳性细胞株筛选 用包被原 “PBA-OVA” 包板， 对培养于 96 孔细胞培养板的细胞采用酶联免疫吸附分析 (ELISA) 方法 做第一次筛选。得到阳性杂交瘤细胞株后， 再用 “PBA-OVA 及 BSA” 再次包板， 采用ELISA方法， 做第二次筛选， 得到的阳性杂交瘤细胞株进行亚类鉴定， 选择IgGl类型的 阳性杂交瘤细胞株。最后， 对已筛选的阳性克隆采用竞争 ELISA 法进行复筛， 选择具有明显 竞争反应的细胞株进行后续操作 ； 4) 抗体纯化和鉴定， 杂。
8、交瘤细胞株的筛选 权 利 要 求 书 CN 103965349 A 2 2/2 页 3 将步骤 3) 中筛选到的阳性杂交瘤细胞株接种小鼠 BALB/C 腹腔， 制备腹水， 采用 protein G 进行纯化， 纯化后的抗体用竞争 ELISA 法检测效价， 选择亲和性较强的抗体进行 热稳定性试验， 最终筛选出产生热稳定性良好， 亲和性较强抗体的杂交瘤细胞株进行保藏。 6. 根据权利要求 5 所述的杂交瘤细胞株的制备方法， 其特征在于， 步骤 3) 和 4) 中， 所 述竞争 ELISA 方法包括如下步骤 ： 以 PBA-OVA 包被酶标板， 100ul/ 孔， 4过夜 ； 洗涤 2 次， 用 2。
9、脱脂奶粉， 37封闭 2h， 200ul/ 孔， 加入竞争物 ( 按照设计比例加入竞争物 ( 芘 )， 50ul/ 孔 ； 加入一抗 ( 抗血清纯 化抗体按照选定比例稀释后加入)， 50ul/孔， 37孵育1h。 设置空白对照和不抑制对照， 洗 涤 2 次。加入已稀释的羊抗鼠酶标二抗， 100l/ 孔， 37孵育 1h， 洗涤 2 次。加入 TMB 底 物显色液显色 15min， 100l/ 孔。再加入 0.5mol 硫酸终止显色， 双波长 (450， 630) 测定吸 光值， 记录保存数据。 7. 权利要求 3 所述的杂交瘤细胞株所分泌的抗多环芳烃单克隆抗体。 权 利 要 求 书 CN 10。
10、3965349 A 3 1/5 页 4 一种多环芳烃完全抗原 , 多环芳烃单克隆抗体和分泌该抗 体的杂交瘤细胞株及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及多环芳烃的完全抗原包括免疫原和包被原， 由免疫原免疫实验动物制 备的杂交瘤细胞株和该杂交瘤细胞株产生的抗多环芳烃单克隆抗体。 背景技术 0002 多环芳烃 (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons， PAHs) 是一大类广泛存在于环 境中的有机污染物， 由两个或多个芳香环构成。 主要由煤， 石油等有机物的不完全燃烧而产 生。许多种类的 PAHs 及其代谢物可通过呼吸道和皮肤接触进入人体， 对人体产生较强的致 癌作用。
11、。 0003 多环芳烃的监测和分析技术主要包括以下几个方面 ： 0004 1、 由于 PAHs 对环境造成的污染及对人类健康的威胁， 一些国家都通过书面法律 和法令规定了对多环芳烃的检测限值要求， 包括欧盟 76/769/EEC， 德国 GS 认证， LFGB。美 国国家环保局 (USEPA) 将 16 种 PAHs( 芘、 荧蒽、 苯并 (b、 k) 荧蒽、 芴、 苯并芘、 萘、 菲、 二苯并 蒽、 苯并蒽、 苊、 苯并苝、 蒽、 苊烯、 屈、 茚并芘 ) 列为优先控制污染物， 对其进行严格的监管 和控制。我国国家标准 (GB3092-1996、 GB16297-1996、 GB5749-8。
12、5、 GB4284-84、 GB7104-94) 中规定了空气、 食品、 饮用水等环境介质中多环芳烃的浓度限量。 0005 2、 不论是土样， 水样， 还是大气样， 环境样品中 PAHs 的分析主要包括以下几个步 骤 ： 样品采集， PAHs 提取， 净化和浓缩， 仪器分析。最常用的提取方法包括液液萃取， 固液萃 取， 超临界萃取等， 仪器分析方法主要是气相色谱法或高效液相色谱法。整个过程步骤繁 琐， 耗时较长， 仪器设备昂贵， 不适合对大量样品在短时间的分析和监测， 并且在此过程中 需要用到甲醇， 二氯甲烷， 丙酮等有机溶剂。除以上两种主要的仪器分析方法外， 用于测定 PAHs 的方法还有荧。
13、光法和酶联免疫吸附分析法。与其它方法相比， 酶联免疫吸附分析法具 有特异性好， 灵敏度高， 操作简便快捷， 且可同时处理大批量样品等忧点。 发明内容 0006 本发明针对目前多环芳烃检测的不足之处， 提供一种特异性和亲和力高的单克隆 抗体与产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞。 0007 本发明的思路在于采用多环芳烃完全抗原免疫动物， 达到理想效价后进行细胞融 合， 从而筛选特异性较高的单克隆细胞株， 该细胞株可以持续分泌单克隆抗体， 便于进行多 环芳烃的检出， 从而为检测多环芳烃的试剂盒研发奠定了基础。 0008 本发明的目的之一是提供一种特异性分泌多环芳烃单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 该杂交瘤细胞株。
14、于 2013 年 6 月 18 日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中国科 学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏号 为 CGMCC No.7718， 分类名为多环芳烃单克隆抗体杂交瘤细胞株。 0009 本发明的目的之二是提供一种用于免疫实验动物的多环芳烃完全抗原的制备方 说 明 书 CN 103965349 A 4 2/5 页 5 法， 该方法包括如下的步骤 ： 0010 1、 采用活性酯法将芘丁酸 (PBA) 分别与牛血清白蛋白 (BSA) 和卵清白蛋白 (OVA) 偶联， 按照 1 ： 1 ： 1 的比例称取芘丁酸、 NHS、。
15、 DCC 溶解于 N， N- 二甲基甲酰胺 (N， N-Dimethylformamide)DMF 中， 室温放置过夜， 12000rpm， 离心 15min， 取上清液。 0011 2、 4搅拌， 将上清液缓慢加入 8ml BSA 溶液 ( 碳酸钠 - 碳酸氢钠缓冲液配制成浓 度为 15mg/ml 的 BSA 溶液 ) 中继续搅拌 5h， 0012 3、 将溶液装入透析袋中， 用蒸馏水透析 2d， 后用 pH7.40.01mor/L PBS 缓冲液继续 透析， 每天更换透析液， 直到用紫外分光光度计检测不到 PBA 的特征吸收峰为止。 0013 4、 离心分离出上清液即作为免疫原 PBA-B。
16、SA， 用同样的方法合成 PBA-OVA 结合物 作为 ELISA 的包被原。 0014 本发明的目的之三是提供一种用于制备抗多环芳烃单克隆抗体杂交瘤细胞株的 方法， 该方法包括如下的步骤 ： 0015 1、 动物免疫 0016 免疫用小鼠为 18g 左右的 BALB/C， 7-8 周 ； 免疫之前眼眶取阴性血清。取 60g 免 疫原 “PBA-BSA” ， 用生理盐水稀释到 200l， 再加入等体积弗氏完全佐剂进行皮下注射免 疫。此后， 每隔两周， 进行一次加强免疫， 免疫量为 30g 蛋白 / 只小鼠。共进行四次加强 免疫后， 眼眶取血， 测定抗血清效价。选择效价较高的小鼠腹腔冲击免疫， 。
17、免疫量为 50g 蛋白 / 只小鼠。效价达到 1 ： 10000 即可做细胞融合。 0017 2、 细胞融合 0018 取免疫小鼠的脾脏细胞与状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0， 采用PEG法进行融合。 融 合后的细胞用含 15血清的 IMDM 培养基培养。 0019 3、 阳性细胞株筛选 0020 用包被原 “PBA-OVA” 包板， 对培养于 96 孔细胞培养板的细胞采用酶联免疫吸附分 析 (ELISA) 方法做第一次筛选。得到阳性杂交瘤细胞株后， 再用 “PBA-OVA 及 BSA” 再次包 板， 采用 ELISA 方法， 做第二次筛选， 得到的阳性杂交瘤细胞株进行亚类鉴定， 选择 IgGl。
18、 类 型的阳性杂交瘤细胞株。最后， 对已筛选的阳性克隆采用竞争 ELISA 法进行复筛， 选择具有 明显竞争反应的细胞株进行后续操作。 0021 4、 抗体纯化和鉴定， 杂交瘤细胞株的筛选 0022 进一步将步骤 3 中筛选到的阳性杂交瘤细胞株接种小鼠 BALB/C 腹腔， 制备腹水， 采用protein G进行纯化， 纯化后的抗体用竞争ELISA法检测效价， 选择亲和性较强的抗体 进行热稳定性试验， 最终筛选出产生热稳定性良好， 亲和性较强抗体的杂交瘤细胞株进行 保藏。 0023 更进一步的， 上述步骤 3 和 4 中， 所述竞争 ELISA 方法包括如下步骤 ： 0024 以 PBA-OV。
19、A 包被酶标板， 100l/ 孔， 4过夜 ； 洗涤 2 次， 用 2脱脂奶粉， 37封 闭 2h， 200l/ 孔， 加入竞争物 ( 按照设计比例加入竞争物 ( 芘 )， 50l/ 孔 ； 加入一抗 ( 抗 血清纯化抗体按照选定比 例稀释后加入 )， 50l/ 孔， 37孵育 1h。设置空白对照和不抑 制对照， 洗涤 2 次。加入已稀释的羊抗鼠酶标二抗， 100l/ 孔， 37孵育 1h， 洗涤 2 次。加 入TMB底物显色液显色15min， 100l/孔。 再加入0.5mol硫酸终止显色， 双波长(450， 630) 测定吸光值， 记录保存数据。 说 明 书 CN 103965349 A 。
20、5 3/5 页 6 0025 本发明的再一个目的是提供由上述保藏号为CGMCC No.7718的杂交瘤细胞株所分 泌的单克隆抗体， 该抗体具有高度的亲和性和特异性， 能够与多环芳烃进行结合， 从而进行 检测。 具体实施方案 0026 下面通过具体实施方案对本发明做进一步说明， 但不意味着对本发明保护范围的 限制。 0027 下述方案中所述方法， 如无特殊说明， 均为常规方法 ； 所述试剂和材料， 如无特殊 说明， 均可从商业渠道购买。 0028 实施方案 0029 实验 1 多环芳烃免疫抗原制备 0030 1、 分别称取0.0288g PBA， 0.0115g NHS， 0.0206g DCC。
21、， 溶解于2mlDMF中， 室温放置 过夜， 12000rpm， 离心 15min， 分离上清液。 0031 2、 称取 0.15g BSA 溶于 10ml0.05mol/L， pH9.6 的碳酸钠 - 碳酸氢钠缓冲液中。 0032 3、 在 4条件下， 将步骤 1 中制备的上清液缓慢加入 8ml 步骤 2 所述溶液中， 继续 搅拌 5h 0033 4、 将步骤 3 中所得的反应混合物装入透析袋中， 用蒸馏水透析 2d 后， 用 pH7.4， 0.01mol/L 磷酸氢二钠 - 磷酸二氢钠缓冲液继续透析， 每天更换透析液。 0034 5、 每天对上述透析液进行吸收光谱扫描， 直到检测不到 PB。
22、A 的特征吸收峰为止 0035 6、 离心分离步骤 5 中的透析液， 上清液即为免疫原 PBA-BSA 0036 实验 2 多环芳烃包被抗原制备 0037 1、 分别称取0.0288g PBA， 0.0115g NHS， 0.0206g DCC， 溶解于2mlDMF中， 室温放置 过夜， 12000rpm， 离心 15min， 分离上清液。 0038 2、 称取 0.15g OVA 溶于 10ml0.05mol/L， pH9.6 的碳酸钠 - 碳酸氢钠缓冲液中。 0039 3、 在 4条件下， 将步骤 1 中制备的上清液缓慢加入 8fl 步骤 2 所述溶液中， 继续 搅拌 5h 0040 4、。
23、 将步骤 3 中所得的反应混合物装入透析袋中， 用蒸馏水透析 2d 后， 用 pH7.4， 0.01mol/L 磷酸氢二钠 - 磷酸二氢钠缓冲液继续透析， 每天更换透析液。 0041 5、 每天对上述透析液进行吸收光谱扫描， 直到检测不到 PBA 的特征吸收峰为止 0042 6、 离心分离步骤 5 中的透析液， 上清液即为包被原 PBA-OVA 0043 实验 3 保藏号为 C6MCC No.7718 杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体制备 0044 用实验 1 中制备的免疫原 PBA-BSA 免疫 4 只 BALB/C 小鼠， 免疫之前眼眶取阴性血 清。免疫方法如下 ： 取 60g 免疫原， 。
24、用生理盐水稀释到 200l， 再加入等体积弗氏佐剂， 用混匀仪器将溶液和佐剂混匀， 形成 油包水。 将混匀好的免疫原进行皮下注射免疫， 打6-8 个点。每隔两周进行一次加强免疫， 免疫量为 30g 蛋白 / 只小鼠。第四次加强免疫后， ELISA法检测效价， 选择效价较高的两只小鼠， 免疫剂量为50g蛋白/只小鼠， 腹腔冲击免 疫一次。 0045 最后一次免疫后一周， 取小鼠脾细胞与 SP2/0 细胞， 采用 PEG 法进行融合 ； 融合后 的细胞用含 15血清的 IMDM 培养基培养细胞。 说 明 书 CN 103965349 A 6 4/5 页 7 0046 用包被原 “PBA-OVA” 。
25、包板， 对培养于 96 孔细胞培养板的细胞采用酶联免疫吸附分 析 (ELISA) 方法做第一次筛选。得到阳性杂交瘤细胞株后， 再用 “PBA-OVA 及 BSA” 再次包 板， 采用 ELISA 方法， 做第二次筛选， 得到的阳性杂交瘤细胞株进行亚类鉴定， 选择 IgGl 类 型的阳性杂交瘤细胞株。最后， 对已筛选的阳性克隆采用竞争 ELISA 法进行复筛， 选择具有 明显竞争反应的细胞株进行后续操作。 0047 将以筛选到的阳性杂交瘤细胞株接种小鼠 BALB/C 腹腔， 制备腹水， 采用 protein G 进行纯化， 得到抗多环芳烃单克隆抗体， 并用竞争 ELISA 法检测各抗体的效价， 。
26、选择亲和 性较强的抗体进行热稳定性试验， 最终筛选出产生热稳定性良好， 亲和性较强抗体的杂交 瘤细胞株 PYR#6-B7 进行保藏。 0048 实验 4 单克隆抗体性能测定 0049 单克隆抗体最低检测限值 (LOD) 和半数抑制量 (IC50) 的检测 利用方阵滴定法确定前述多环芳烃单克隆抗体和实验中制备的包被抗原的最适工作 浓度， 采用不同浓度的芘标准品作为竞争物， 其浓度如下 ： 30、 10、 3.33、 0.37、 0.12、 0.041、 0.014， 单位 g/ml， 设置五组平行。 0050 间接竞争酶联免疫吸附 (ELISA) 法 ： 将上述实验 2 制备的包被原 PBA-O。
27、VA 用包被 液稀释至 2.5g/ml， 每孔加 100l 包被酶标板， 4， 过夜 ； PBS-T 洗涤 2 次， 用 2脱脂奶 粉， 37封闭2h， 200l/孔 ； 将竞争物稀释液50l/孔和单克隆抗体稀释溶液50ul/孔混 匀后加入酶标板孔中， 同时设置零标准对照孔 ( 稀释液中不加竞争物 ) 和空白对照孔 ( 将 抗体溶液换为稀释液 )， 37孵育 1h ； PBS-T 洗涤 2 次后， 加入已稀释的羊抗鼠酶标二抗， 100l/ 孔， 37孵育 1h ； PBS-T 洗涤 2 次， 加入 TMB 底物显色液显色 15min， 100l/ 孔。再 加入 0.5mol 硫酸终止显色， 双。
28、波长 (450， 630) 测定吸光值， 记录保存数据。以吸光度为纵 坐标， 以标准浓度的 LOG 值为横坐标， 绘制半对数标准曲线。 0051 根据标准曲线得出最低检测限值 (LOD) 和半数抑制量 (IC50)， 检测灵敏度， 抑制率 计算公式如下 ： 0052 式中 ODmax为零标准对照孔的吸光度值， ODmin为空白对照孔吸光度值， ODi为竞争 物浓度为 i 时的吸光度值。 0053 结果表明， 采用上述的间接竞争 ELISA 法， 以芘丁酸为半抗原制备的单克隆抗体 对芘的 IC50为 0.9g/ml， 最低检测限为 LOD 为 0.05g/ml 0054 抗体特异性检测 0055。
29、 抗体的特异性是指它同特异性抗原的结合能力， 与该类抗原类似物结合能力的比 较， 常用交叉反应率作为评价的标准。 抗体对抗原类似物的交叉反应率越大， 说明该抗体适 合对多组分抗原做免疫检测。 0056 将 16 种美国国家环保局优先控制的多环芳烃 ( 芘、 荧蒽、 苯并 (b、 k) 荧蒽、 芴、 苯 并芘、 萘、 菲、 二苯并蒽、 苯并蒽、 苊、 苯并苝、 蒽、 苊烯、 屈、 茚并芘 ) 进行系列稀释， 按照实验 4 方法， 与实验 3 制备的单克隆抗体进行反应， 绘制标准曲线。根据每一条标曲得出每一种 竞争抑制物的半抑制量 IC50， 计算多环芳烃单克隆抗体对 16 种多环芳烃的交叉反应率。
30、。 0057 交叉反应率 ( ) ( 芘的 IC50/ 其他竞争物的 IC50)100 0058 实验设置三次重复， 取三次重复的平均值作为实验结果。 结果表明， 芘单克隆抗体 说 明 书 CN 103965349 A 7 5/5 页 8 对该单克隆抗体能同时识别 7 种多环芳烃， 芘、 荧蒽、 苯并芘、 菲、 苯并蒽、 蒽、 屈。交叉反应 率为 100、 30.70、 1142.52、 30.38、 384.58、 85.36、 7297.98。由此可知， 本发 明提供的单克隆抗体能够同时识别以上 7 种多环芳烃， 可以用来对样品种多环芳烃总量进 行分析。 说 明 书 CN 103965349 A 8 。