《解淀粉芽孢杆菌及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《解淀粉芽孢杆菌及其应用.pdf（11页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103966118 A (43)申请公布日 2014.08.06 CN 103966118 A (21)申请号 201310711090.0 (22)申请日 2013.12.20 CGMCCNo.8433 2013.11.05 C12N 1/20(2006.01) A23K 1/16(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (71)申请人 中国水产科学研究院黄海水产研究 所 地址 266071 山东省青岛市南京路 106 号 (72)发明人 莫照兰 李贵阳 黄倢 李杰 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 周秀梅 李。
2、颖 (54) 发明名称 解淀粉芽孢杆菌及其应用 (57) 摘要 本 发 明 公 开 一 株 海 洋 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 (Bacillus amyloliquefaciens)M001 及其应用， 所述的解淀粉芽孢杆菌 M001 保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏日期 2013 年 11 月 4 日， 保藏号为 CGMCC No.8433。该 菌株分离筛选自牙鲆鱼肠道， 能明显提高养殖鱼 非特异性免疫水平， 增强养殖鱼抵御细菌病原感 染的能力。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19。
3、)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103966118 A CN 103966118 A 1/1 页 2 1. 一种海洋解淀粉芽孢杆菌， 其特征在于 ： 海洋解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)M001 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏日 期 2013 年 11 月 5 日， 保藏号为 CGMCC No.8433。 2. 一种权利要求 1 所述的解淀粉芽孢杆菌的应用， 其特征在于 ： 所述解淀粉芽孢杆菌 用于制备微生物制剂。 3. 按权利要求。
4、 2 所述的解淀粉芽孢杆菌的应用， 其特征在于 ： 所述解淀粉芽孢杆菌作 为添加剂用于抑制海水鱼类病原菌、 增强鱼类免疫功能的微生物制剂。 4. 按权利要求 2 或 3 所述的解淀粉芽孢杆菌的应用， 其特征在于 ： 将所述解淀粉芽孢 杆菌制成干菌粉。 5. 按权利要求 4 所述的解淀粉芽孢杆菌的应用， 其特征在于 ： 将 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 (Bacillus amyloliquefaciens)M001 在 Zobell2216E 海 水 固 体培养基上划线， 取一单菌落接种于 2216E 液体培养基中， 在 25-30培养 6-8 小时， 即 为种子液， 将所得种子液按体积比 1 。
5、： 100 转接于新鲜的 2216E 液体培养基， 在 25-30、 120-200rpm 培养 24-36 小时， 即为发酵液 ； 所得发酵液在 5000g 离心 30min， 取菌泥在 60 恒温干燥至衡重， 而后与玉米淀粉混合制成干菌粉。 权 利 要 求 书 CN 103966118 A 2 1/6 页 3 解淀粉芽孢杆菌及其应用 技术领域 0001 本发明涉及水产微生物应用技术领域， 具体的说是一种解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens) 及其应用。 背景技术 0002 我国水产养殖产量连续十多年居世界首位， 成为大农业中发展最快的产业之一。 由于养殖业。
6、多年的集约式快速发展， 加上养殖环境不断恶化、 养殖品种抗逆性衰退， 最终导 致养殖动物病害频繁发生， 直接造成巨大的经济损失。病害已成为限制水产养殖产业持续 健康发展的瓶颈。我国水产病害的防治手段主要依赖抗生素等化学药物， 由于抗生素带来 的生态、 环境以及食品安全等的不良影响， 其在水产养殖的应用在国内外受到很多限制。 益 生菌是一类能够抑制病原微生物、 改善养殖生态环境、 调节动物体内生态平衡、 增强肌体免 疫功能、 提高饲料利用效率等作用的有益微生物， 许多商品化的益生菌制剂已在畜牧养殖 业中广泛应用， 以达到减少抗生素使用、 控制疾病发生、 促进动物生长的目的。目前用于水 产养殖的益。
7、生菌多数来源于陆生环境或陆生动物， 这些益生菌多数不适合在水生环境特别 是海洋环境中生长和繁殖， 导致其益生效应难以有效发挥。 因此， 从海洋环境或海洋动物中 分离筛选土著菌作为益生菌来源， 对保证海洋益生菌制剂的高效性和安全性特别关键。 发明内容 0003 本发明目的在于提供一种海洋解淀粉芽孢杆菌及其应用。 0004 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案为 ： 0005 一种海洋解淀粉芽孢杆菌， 海洋解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens) M001保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏日期2013年10月5日， 保藏号为 CGMCC No。
8、.8433， 保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号。 0006 一种解淀粉芽孢杆菌的应用， 所述解淀粉芽孢杆菌用于制备微生物制剂。 0007 所述解淀粉芽孢杆菌作为添加剂用于抑制海水鱼类病原菌、 增强鱼类免疫功能的 微生物制剂。 0008 将所述解淀粉芽孢杆菌制成干菌粉。 0009 进 一 步 的 说， 将 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 (Bacillus amyloliquefaciens)M001 在 Zobell2216E 海水固体培养基上划线， 取一单菌落接种于 2216E 液体培养基中， 在 25-30 培养 6-8 小时， 即为种子液， 将所得种子液按体积比 1 ： 。
9、100 转接于新鲜的 2216E 液体培养 基， 在25-30、 120-200rpm培养24-36小时， 即为发酵液 ； 所得发酵液在5000g离心30min， 取菌泥在 60恒温 干燥至衡重， 而后与玉米淀粉混合制成干菌粉。 0010 海洋解淀粉芽孢杆菌， 即来源于牙鲆鱼类消化道的内源性解淀粉芽孢杆菌 M001， 该菌株不仅有抑制病原菌的效果， 还能增强养殖鱼非特异性免疫水平和抵御病原菌感染的 能力。 0011 本发明所涉及的菌株信息如下 ： 说 明 书 CN 103966118 A 3 2/6 页 4 0012 1. 来源。该菌株分离自健康牙鲆 （Paralichthys olivace。
10、us） 消化道， 经高剂量注 射和投喂确定对养殖大菱鲆、 牙鲆、 舌鳎、 小白鼠等安全， 无致病性。 0013 2. 形态学特征。革兰氏染色阳性， 在 Zobell2216E 海水固体培养基上、 28培养 2 天的菌落形态直径大小为23mm， 圆形， 凸起， 乳白色， 表面粗糙， 边缘不整。 具有荚膜和芽 孢， 芽孢呈椭圆形。 0014 3. 生理生化特征。氧化酶反应阴性， 过氧化氢酶反应阳性， 鸟氨酸脱羧酶反应阴 性， 精氨酸双水解酶阳性， 赖氨酸脱羧酶反应阳性， 脲酶反应阴性， L- 阿拉伯糖醇反应阴 性， 半乳糖酸盐反应阴性， 5- 酮基 - 葡萄糖酸钠反应阴性， 脂肪酶反应阳性， 酚红。
11、反应阴性， - 葡萄糖苷反应阳性， 甘露醇反应阳性， 麦芽糖反应阳性， 吲哚产生阴性， N- 乙酰 - 葡 萄糖反应阴性， - 半乳糖苷酶反应阴性， 葡萄糖反应阳性， 蔗糖反应阳性， L- 阿拉伯糖反 应阴性， - 葡萄糖反应阳性， - 半乳糖苷酶反应阳性， 海藻糖反应阳性， 鼠李糖反应阳 性， 肌醇反应阳性， 侧金盏花醇反应阴性， 帕拉金糖反应阴性， - 葡萄糖酸酶反应阳性， 纤 维二糖反应阴性， 山梨醇反应阳性， - 麦芽糖苷反应阳性， 丙二酸利用阳性， L- 天门冬素 芳胺酶反应阳性。 0015 1） 16SrRNA 基因序列如 SEQ ID ： 1 所示。 0016 2） 抗生素敏感性。
12、。用药敏纸片扩散法检测解淀粉芽孢杆菌 M001 对抗生素的敏感 性， 结果表 1 所示， 该菌对 6 种抗生素敏感。 0017 表 1M001 的抗生素敏感性 0018 0019 3） 抑菌特性。利用牛津杯法检测解淀粉芽孢杆菌 M001 在 2216E 海水液体培养基 的培养物上清对常见海水病原菌的抑菌作用， 结果表 2 所示， 该菌可以抑制迟缓爱德华氏 菌、 海豚链球菌、 坎贝氏弧菌、 鳗弧菌、 副溶血弧菌、 创伤弧菌。 0020 表 2M001 的抑菌特性 0021 0022 4） 产酶特性。如表 3 所示， 解淀粉芽孢杆菌 M001 能够产生较强的蛋白酶、 脂肪酶、 纤维素酶和淀粉酶。 。
13、说 明 书 CN 103966118 A 4 3/6 页 5 0023 表 3M001 的产酶特性 0024 0025 5） 生长特性。如图 1 图 4 所示， 解淀粉芽孢杆菌 M001 在 20 -40、 pH6-8、 1%-4%NaCl 的条件下具有良好的生长能力 （参见图 1- 图 4） 。 0026 6） 抗逆特性。解淀粉芽孢杆菌 M001 在不同浓度胆盐的生长及在人工胃液的存活 情况如图 5 所示， 该菌在 0.03% 胆盐条件下具有良好的生长能力 ； 在 pH4 人工胃液中作用 1 小时、 3小时后， 数量分别下降了2个、 3个数量级， 在pH2人工胃液作用1小时、 3小时后， 数。
14、 量均下降了 5 个数量级。结果说明该菌具有较好的耐受胆盐和胃酸的能力 （参见图 5） 。 0027 本发明所具有的优点 ： 0028 1. 本发明的海洋解淀粉芽孢杆菌 M001 制备的微生物制剂， 能够抑制海水鱼类病 原菌， 增强鱼类免疫功能， 减少疾病发生， 适合水产养殖生产。 0029 2. 本发明的解淀粉芽孢杆菌 M001 具有生长速度快、 抑菌谱广、 抗逆性强等特点， 生产工艺简单、 成本低， 具有良好的商业前景。 0030 3. 本发明的解淀粉芽孢杆菌 M001 来源于海洋鱼类肠道， 为内源性肠道益生菌， 不 仅适合在海洋环境生长繁殖， 而且对养殖动物和人类不存在危险， 在应用方面。
15、具有高效性 和安全性。 0031 附图说明书 0032 图1为本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌M001的生长曲线图。 培养基为2216E 液体培养基， 培养温度 25。 0033 图2为本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌M001在不同温度条件下的生长图。 培 养基为 2216E 液体培养基， pH7.6。 0034 图 3 为本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌 M001 在不同 pH 值条件下的生长图。 培养基为 2216E 液体培养基 , 培养温度 25。 0035 图 4 为本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌 M001 在不同 aCl 含量条件下的生 长图。培养基为 2216E 液体培养基 ,p。
16、H7.6， 培养温度 25。 0036 图 5 为本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌 M001 在不同胆盐含量条件下的生长 图。培养基为 2216E 液体培养基 ,pH7.6， 培养温度 25。 具体实施方式 0037 现参照下列实施例对本发明作进一步说明， 实施例对本发明进行举例描述， 而非 以任何形式对本发明进行限制。 0038 实施例 1 0039 解淀粉芽孢杆菌 M001 的干菌粉制备 ： 0040 从 -80保存的菌种在 2216E 海水固体培养基划线， 在 25 -30培养， 挑取单菌 说 明 书 CN 103966118 A 5 4/6 页 6 落接种在 2216E 海水液体培养基。
17、摇瓶培养 6-8 小时后获得种子液， 所得种子液按体积比为 1 ： 100 的比例转接在新鲜的 2216E 海水液体培养基中， 在 25-30、 120-200rpm 发酵培养 24-36小时获得发酵液， 所得发酵液在5000g离心30min， 收获菌泥在60恒温干燥至衡重， 所得细菌与玉米淀粉按重量1 ： 5的比例混合制成干菌粉， 每克干菌粉的M001活菌数不低于 1012CFU。 0041 所述的 2216E 海水培养基的组成， 按质量百分比为 ： 蛋白胨 0.5%， 酵母粉 0.1%， 硫 酸亚铁 0.01%， 其余为陈海水。 0042 实施例 2 0043 解淀粉芽孢杆菌 M001 干。
18、菌粉的应用 ： 0044 步骤 1) 饲料制备。将解淀粉芽孢杆菌 M001 干菌粉添加在鱼类基础饲料 （按质量 百分比为 ： 鱼粉 40%、 花生仁粕 10%、 大豆粕 10%、 菜籽粕 8.4%、 面粉 26%、 鱼油 2%、 预混料 2%） 中， 配制成每克饲料含活解淀粉芽孢杆菌 M001 在 108-109CFU 的有益菌饲料， 以蛋清为粘合 剂， 加适量水混合， 用小型绞肉机挤压制成颗粒饲料， 在 60烘干至水分含量低于 10%， 分 袋包装保存在 4备用。 0045 步骤 2） 大菱鲆养殖。平均体重为 40.7g 的健康大菱鲆 180 尾， 暂养在循环水养殖 系统2周后随机分为实验组。
19、和对照组两个处理组， 每个处理组3个平行， 每个平行组放鱼30 尾。实验组投喂 M001 益生菌饲料， 对照组投喂基础饲料， 每日投喂饲料 2 次， 日投饵量为鱼 总体重的 3% ； 每日换水 1 次， 日换水量 1/3。每隔 2 周停食 24 小时， 对每组鱼称重以矫正日 投喂量。实验期间养殖水温 16-18， 连续充气。整个养殖试验周期为 6 周。 0046 步骤 3） 血清免疫指标检测。步骤 2） 试验鱼在养殖第 6 周时， 从每组鱼随机取 5 尾鱼采血制备血清， 检测血清溶菌酶活力、 一氧化氮合成酶活力、 超氧化物歧化酶活力、 酸 性磷酸酶活力、 碱性磷酸酶活力、 血清总蛋白含量。结果。
20、如表 4 所示， 实验组鱼的血清在一 氧化氮合成酶和超氧化物歧化酶活力、 总蛋白含量方面显著高于对照组。 因此， 解淀粉芽孢 杆菌 M001 干粉制剂能增强大菱鲆血液的非特异性免疫因子能力。 0047 表 4 大菱鲆血清免疫指标 0048 0049 p 0.05 0050 步骤 4） 消化酶活力检测。同步采集步骤 3） 样品鱼的胃、 肠道、 肝脏检测蛋白酶、 脂肪酶、 淀粉酶活力。 结果如表5所示， 实验组鱼肠道蛋白酶活力明显高于对照组鱼 ； 同时， 实验组鱼肝脏的蛋白酶和脂肪酶活力也明显高于对照组鱼。因此， 解淀粉芽孢杆菌 M001 干 菌粉能增强消化系统的部分酶活力。 0051 表 5 大。
21、菱鲆消化道及肝脏消化酶活力 说 明 书 CN 103966118 A 6 5/6 页 7 0052 0053 p 0.05 0054 步骤 5） 养殖大菱鲆的抗病力。取活的鳗弧菌 M3 株细胞用无菌海水悬浮至浓度为 4.8104CFU/mL， 即为攻毒菌液， 取步骤 2） 的各组实验鱼， 各组取鱼 25 尾， 每尾腹部肌肉注 射 100l 上述攻毒菌液。14 天后， 统计各组鱼的累积死亡率 ： 实验组为 （33.32.5） %， 对 照组为 （89.38.3） %。因此， 解淀粉芽孢杆菌 M001 大干菌粉能提高大菱鲆抵御鳗弧菌感 染的能力。 0055 SEQ ID ： 1 0056 CTAA。
22、TACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTG 0057 AGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGG 0058 ATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGAC 0059 CCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTG 0060 AGAGGGTGATCGGCCACACTGGGA。
23、CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGG 0061 GAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGA 0062 TCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTAC 0063 CTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTT 0064 GTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAA。
24、GTCTGATGTGAAAGCCCCCG 0065 GCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCC 0066 ACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTC 0067 TGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAKCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC 0068 GCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATT。
25、 0069 AAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCA 0070 CAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCC 0071 TCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTC 0072 GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTG 0073 CCAGCATTCAGTTG。
26、GGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGAC 0074 GTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGC 0075 AGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAAC 0076 TCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCC 说 明 书 CN 103966118 A 7 6/6 页 8 0077 GGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAAC 0078 CTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAA 说 明 书 CN 103966118 A 8 1/2 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 103966118 A 9 2/2 页 10 序 列 表 CN 103966118 A 10 1/1 页 11 图 1 图 2 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103966118 A 11 。